甘蓝型油菜千粒重全基因组关联分析

张 春 赵小珍 庞承珂 彭门路 王晓东 陈 锋 张 维 陈 松 彭 琦 易 斌 孙程明,,* 张洁夫,* 傅廷栋

甘蓝型油菜千粒重全基因组关联分析

张 春1,2赵小珍1,2庞承珂1,2彭门路1,2王晓东2陈 锋2张 维2陈 松2彭 琦2易 斌3孙程明2,3,*张洁夫2,*傅廷栋3

1南京农业大学 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095;2江苏省农业科学院经济作物研究所/农业农村部长江下游棉花与油菜重点实验室 / 中国江苏省现代作物生产协同创新中心, 江苏南京 210014;3华中农业大学植物科学技术学院 / 作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070

千粒重是油菜产量构成的重要因素之一。本研究利用高通量SNP芯片对496份具有代表性的油菜种质资源进行基因型分析, 考察群体在3个环境(14NJ、15TZ、16TZ)中的千粒重表型, 利用混合线性模型(mixed linear model, MLM)和一般线性模型(general linear model, GLM)进行全基因组关联分析。结果表明, 本群体在3个环境中千粒重的广义遗传力为63.12%。MLM模型检测到6个显著位点, 解释28.92%的表型变异; GLM模型检测到61个显著位点, 解释47.08%的表型变异。合并共同位点后得到62个显著位点, 联合解释47.31%的表型变异。这些位点分布在基因组所有染色体上, 在A07、A03和C06染色体上分别检测到数目最多的9、8和7个位点。其中效应最大的位点Bn-scaff_17526_1-p1066214位于C09染色体, 在MLM和GLM模型中表型贡献值分别为5.55%和15.26%。21个位点与前人报道的QTL重叠, 其中8个位点得到至少2个群体的验证。其余41个位点为新鉴定的位点, 其中多个位点效应高且在多环境中被检测到, 如位点Bn-A03-p560769、Bn-scaff_15743_1-p599416和Bn-scaff_15743_1-p590955等。在11个位点附近找到、、等拟南芥已报道千粒重基因的同源基因。本研究结果有助于解析甘蓝型油菜千粒重的遗传基础, 为研究千粒重的调控机制、指导千粒重的遗传改良奠定基础。

甘蓝型油菜; 千粒重; 产量; 关联分析; SNP标记

甘蓝型油菜(L., 2= 38, AACC)是世界上广泛种植的油料作物, 也是我国重要的植物油来源之一, 占总食用植物油40%以上。然而我国植物油料自给率不足四成, 且缺口仍呈扩大趋势, 提高油菜产量、保障油料供给安全已迫在眉睫[1]。千粒重是构成油菜产量的三因素之一, 提高油菜千粒重是增产的直接途径, 因此解析粒重遗传基础和分子机理对油菜产量乃至国家油料供给安全具有重要意义。

千粒重是由多基因控制的数量性状, 受基因型和环境条件共同作用[2]。从细胞学水平看, 种子器官的发育主要受细胞增殖和细胞膨大调节, 两者又分别决定着细胞数目和细胞大小[3], Breuninger等[4]研究认为, 细胞增殖(细胞数目)对种子等器官大小的影响更大。从种子发育进程看, 胚、胚乳及胚珠的协同生长关系着种子重量及大小, 同时发育过程又与母体植株密不可分, 种子大小与母体组织间存在某种内在联系。朱军等[5]研究认为, 粒重遗传模型为胚、胚乳、细胞质和母体基因型的效应, 其中细胞质和母体基因型效应属母体效应。李娜等[6]通过对遗传背景广泛的油菜大小粒种质进行遗传分析, 证明了油菜种子大小主要由母体基因型效应调控, 母体效应值达0.93。母体组织可从多种途径对种子大小产生影响: 一是转录因子调控途径, 如通过限制种皮细胞的延伸控制种子生长[7]; 二是泛素化途径, 如泛素受体和通过限制种皮细胞增殖影响籽粒大小[8-9]; 三是G蛋白途径, 如G蛋白复合物由异源三聚体的Gα、Gβ和Gγ 3个亚基组成, 超表达Gγ ()的拟南芥通过细胞增殖促进种子生长发育[10]; 四是激素途径, 如BZR1通过油菜素内酯途径影响种子大小[11]; 五是其他类型生长物质, 如编码细胞色素P450单加氧酶, 通过促进种子株被或种皮细胞的延伸增加种子大小[12]。

分子标记、SNP芯片等技术的出现大大推进了对复杂数量性状如千粒重基因的定位。多数科研工作者利用遗传差异大的双亲构建连锁群体, 进行千粒重QTL定位。Quijada等[13]利用2个DH群体定位到3个千粒重QTL位点, 分别位于A07、C07和C09染色体上。Basunanda等[14]同样利用DH群体, 结合SSR标记和AFLP标记, 检测到34个千粒重QTL, 表型变异贡献率范围为2.4%~23.0%, 其中7个位点能重复检测到。Yang等[15]考察186个RIL群体在2环境下的表型, 检测到9个与千粒重相关的QTL, 分布在5个连锁群A01、A06、A07、A09和C03, 其中贡献率最大的QTL位于A09染色体, 解释28.2%的表型变异。Zhao等[16]考察DH群体在5个环境下的表型, 定位到40个千粒重QTL位点, 其中位于A06的主效QTL贡献率为20.1%。Fan等[17]考察DH和F2两群体在2环境下的表型, 共检测到9个千粒重QTL, 分别位于在A01、A02、A05、A07、A10和C04, 解释的表型变异范围为27.6%~37.9%。Sun等[18]利用高密度SNP图谱, 考察189个RIL群体在5个环境下的表型, 定位到25个千粒重相关的QTL, 其中QTL解释6.6%~7.6%的表型变异。目前甘蓝型油菜中已精细定位的粒重基因很少, Liu等[19]成功克隆了第1个影响千粒重的基因, 该基因是控制角果长和千粒重的双效调控因子, 通过延长角果皮细胞长度促进角果伸长, 增加角果皮光合面积, 促进千粒重增加。Shi等[20]利用图位克隆得到1个影响千粒重的基因, 该基因编码1个P450单加氧酶, 通过促进角果瓣中的细胞伸长来调节角果长度, 影响种子大小。

随着高密度单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)基因分型芯片和全基因组测序等技术的发展, 全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)已广泛应用于油菜复杂性状的遗传结构解析[21-22]。本研究选用496份具有代表性的油菜种质资源为关联群体, 利用60K SNP芯片对群体进行基因型分析, 结合3个环境考察的千粒重表型数据, 对该性状进行全基因组关联分析, 基于检测到的显著SNP位点挖掘候选基因。本研究中筛选出千粒重大的优异种质资源, 为今后的性状改良提供材料; 基于检测到的显著位点, 为开发粒重分子标记提供信息; 挖掘候选基因, 为千粒重基因克隆和调控机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

496份甘蓝型油菜为国内外的地方品种、育成品种及高世代育种材料(附表1)。其中国内资源444份, 主要来自湖北、重庆、江苏、湖南、四川、陕西等油菜主产省市; 国外资源52份, 主要来自德国、瑞典、朝鲜、加拿大等国家。所有材料均由华中农业大学国家油菜工程技术研究中心提供。

1.2 田间试验与表型调查

试验材料于2014年在江苏南京(14NJ)以及2015年、2016年在泰州(15TZ和16TZ)种植。采用完全随机区组设计, 设置3个重复, 单个材料每重复种2行, 每行15株, 行宽1.5 m, 行距40 cm, 株距15~17 cm。每年10月上旬大田直播, 田间管理按当地常规方式进行。田间材料均是自然成熟时收获, 每小区选择具有代表性的6个单株, 在挂藏室内自然阴干后进行考种分析。千粒重具体测量方法为: 单株全株脱粒后, 随机选择其中500粒种子称重, 重复取样3次, 保证3次称重结果差异小于0.1 g (5%以内)为有效的3个数据, 取平均数后加倍即为测量值。利用RStudio软件对各个环境的千粒重表型进行统计分析和相关性分析, 并计算广义遗传力和最佳线性无偏预测值(best linear unbiased prediction, BLUP)[23-25]。

1.3 基因型检测与分析

利用Illumina 60K SNP芯片对496份甘蓝型油菜资源进行基因型分析。在Genome Studio软件中对SNP进行质量控制。将过滤后的33,218个SNP序列比对至油菜Darmor-基因组, e-value阈值设为10-12, 得到19,167个单拷贝且位置清楚的SNP标记用于关联分析[26]。

1.4 全基因组关联分析

利用软件Structure 2.3.4基于贝叶斯模型进行群体结构, 得到Q矩阵[27], 利用软件SPAGeDi计算不同材料间的亲缘关系, 得到K矩阵[28], 在软件Tassel 5.0中导入基因型、表型、Q矩阵和K矩阵数据文件。以Q矩阵和Q+K矩阵作协变量, 分别进行MLM和GLM 2种模型的全基因组关联分析[29]。对MLM模型设置的显著性阈值(bonferroni threshold)为1/总标记数, 即-lg () = 4.28; 对GLM模型设置更为严格的显著性阈值为0.05/总标记数, 即-lg () = 5.58。当1 Mb区间内存在多个显著SNP时, 若两两间的2≥0.1, 则将这些SNP归为1个关联位点, 以最小值的SNP作为显著性位点代表。用RStudio软件包qqman绘制曼哈顿图和QQ (Quantile-Quantile)图。用RStudio软件lm功能分析关联位点解释的总表型变异。

1.5 已报道QTL的信息整理

目前有4篇千粒重关联分析研究, 4个群体分别包含157、192、427和521份油菜资源[30-33], 整理其检测到的显著位点并与本研究结果进行比较。针对利用SNP芯片进行基因分型的连锁群体, 将检测到的QTL两侧的SNP探针序列比对至油菜Darmor-参考基因组, 以确定QTL的物理区间[34]。对于以SSR和AFLP等传统标记进行基因分型的研究, 搜集QTL两侧标记的引物序列并将其比对至参考基因组, 以确定QTL的物理区间。

1.6 候选基因挖掘

对于显著关联位点, 以2= 0.1作为衰减阈值, 用软件Tassel 5.0计算显著关联位点的LD衰减距离作为置信区间, 提取置信区间内的基因CDS序列, 与模式植物拟南芥中已报道的千粒重相关基因CDS进行BLAST比对, 设e-value阈值为10-10, 以相似度最高的拟南芥基因信息来注释油菜基因。

2 结果与分析

2.1 千粒重表型统计分析

496份油菜种质资源表型千粒重在3个环境中具有广泛的变异, 单个环境的千粒重极差范围为4.63~ 5.36 g。单个环境表型平均值范围为(3.51±0.64)~ (4.27±0.88) g, 变异系数范围为0.16~ 0.21 (表1和图1)。3个环境间的相关系数为0.55, 达到极显著水平(≤0.001)。这表明本研究考察的表型数据具有较高的可靠性和重复性。利用RStudio软件包lem4计算, 油菜千粒重在3个环境下的广义遗传力为63.12%。

表1 关联群体千粒重性状的统计分析

2.2 千粒重全基因组关联分析

利用MLM模型对千粒重BLUP值进行关联分析, 显著性阈值为-lg () = 4.28时, 共检测到8个显著位点。合并存在连锁不平衡的SNP (2≥0.1), 得到6个显著位点, 分布在A01、A02、A03、C06和C09染色体(表2和图2)。6个显著位点的-lg ()值范围是4.33~5.38, 可解释4.86%~6.06%的表型变异。利用一个简单加性模型计算, 6个位点联合解释28.92%的表型变异。与单环境的关联结果比较, 5个位点被重复检测到。

利用GLM模型对千粒重BLUP值进行关联分析,显著性阈值为-lg () = 5.58时, 共检测到226个显著位点。合并存在连锁不平衡的SNP (2≥0.1), 得到61个显著位点, 分布在全基因组所有染色体(表3和图2)。其中显著性最高位点Bn-scaff_17526_ 1-p1066214的-lg () = 15.98, 对表型变异的贡献率为15.26%。其余位点的-lg ()值范围是5.58~11.57, 可解释4.89%~11.31%的表型变异。利用一个简单加性模型计算, 61个位点联合解释47.08%的表型变异。与单环境的关联结果比较, 47个位点被检测到, 13个位点在2环境中重复检测到, 7个位点在3个环境中被检测到。

综合2个模型关联结果, 5个MLM模型的显著位点与GLM重叠, 合并重叠位点后共得到62个显著位点, 联合解释47.31%的表型变异。这些位点分布在全基因组所有染色体上, 其中A07染色体上检测到的数目最多, 达9个位点, A03和C06染色体上分别检测到8个和7个位点。分析显著位点的分布, 58.06%的位点分布在A亚基因组, 41.94%位于C亚基因组(表2和表3)。

2.3 与前人报道 QTL的比较

综合MLM和GLM模型检测结果, 与已报道的千粒重QTL结果比较, 本研究中21个显著位点与前人研究结果重叠, 其中有8个位点得到至少2个群体的验证(表2和表3)。位于A02染色体的位点Bn-A02-p6564861位置为3.78 Mb, 与Shahid等[32]通过关联分析检测到的位点Bn-A02-p6564861和Luo等[35]通过DH群体定位到的千粒重QTL(位置: 3.78~3.83 Mb)重叠。位于A07染色体的位点Bn-Scaffold002856-p361位置为0.59 Mb, 与Cai等[31]、Fan等[17]和Shi等[36]采用不同策略检测到位点BrGMS3983、QTL和(位置: 0.83 Mb)重叠。位于A09染色体的位点Bn-A09- p7329993位置为5.54 Mb, 与Basunanda等[14]定位到QTL、和Shahid等[32]检测到位点Bn-A09-p7327691 (位置: 5.54~5.74 Mb)重叠。位于C06染色体的位点Bn-scaff_16874_1-p411591位置为31.82 Mb, 与Dong等[30]、Shi等[36]和Li等[37]通过不同策略检测到的位点(位置: 31.18 Mb)重叠。

GLM模型中效应最大的位点Bn-scaff_ 17526_1-p1066214位于C09染色体1.49 Mb,-lg () = 15.98, 解释15.26%的表型变异, 与Shahid等[32]检测到的效应最大位点Bn-scaff_17526_1-p1063974 (位置: 1.49 Mb)一致。该模型中效应次高的位点Bn-scaff_16064_1-p938130位于C06染色体24.70 Mb,-lg () = 11.57, 解释11.31%的表型变异, 与Luo等[35]定位到的千粒重QTL(位置: 24.52 Mb)重叠。此外有16个位点与前人检测的QTL位点重叠或相邻(表3), 以上QTL比较验证了本研究结果的可靠性。

A: 千粒重MLM曼哈顿图; B: 千粒重MLM QQ图; C: 千粒重GLM曼哈顿图; D: 千粒重GLM QQ图。

A: Manhattan plot of MLM for 1000-seed weight; B: quantile-quantile plot of MLM for 1000-seed weight; C: Manhattan plot of GLM for 1000-seed weight; D: quantile-quantile plot of GLM for 1000-seed weight.

表2 MLM千粒重显著关联位点(BLUP)

缩写同图1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

表3 GLM千粒重显著关联位点(BLUP)

(续表3)

缩写同图1。Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

2.4 候选基因挖掘

基于油菜基因组的注释信息, 在Bn-A03-p221 25583位点下游244 kb处找到候选基因, 该基因的拟南芥同源基因编码二酰甘油酰基转移酶, 其过表达促进种子中甘油三酯含量和种子重量增加[39](表4)。在Bn-A03-p8851142位点下游118 kb处找到候选基因, 该基因的拟南芥同源基因编码WRKY转录因子, 通过增加种皮细胞延伸促进种子粒重增加[40]。在Bn-A05-p2610006位点下游7.5 kb处找到候选基因, 该基因的拟南芥同源基因编码I型MADS结构域蛋白, 在中央细胞发育过程和种子胚乳形成过程中起调节作用, 影响种子大小[41]。在Bn-A07-p11611255位点上游115 kb处找到候选基因, 该基因的拟南芥同源基因调节编码糖酵解途径和脂肪酸相关酶基因的表达,通过增大种子体积引起种子重量增加[42]。在Bn-scaff_18062_1-p229981位点上游323 kb找到候选基因, 该基因的拟南芥同源基因是植物生长的负调控因子, 其高表达的转基因植株表现出异常胚珠, 导致种子大小、重量和数量减少[43]。此外, 本研究还找到其他6个候选基因, 包括拟南芥已知调控粒重相关基因[44]、[45]、[46]、[12]、[47]、[9]、[48]等在油菜中的同源拷贝。

表4 千粒重关联位点候选基因信息

3 讨论

本研究对496份油菜资源千粒重进行考察, 分析其在3个环境下的千粒重表型, 其中材料2012-8998、甲904、WH-59和CY19PXW-65等千粒重大且稳定, 其平均千粒重分别为5.63、5.59、5.09和5.06 g, 上述材料值得作为改良千粒重的优良亲本。比较MLM和GLM模型的关联分析, MLM将群体结构Q矩阵作为固定效应, 亲缘关系K矩阵作为随机效应, 很好地控制了假阳性, 位点可靠性更高。MLM模型检测到6个显著位点, 联合解释了28.92%的表型变异, 其中4个位点得到前人验证。但MLM检测功效偏低, 容易造成假阴性。因此, 引入了检测功效高, 同时假阳性更高的模型GLM; 但对GLM模型设置更为严格的显著性阈值为0.05/总标记数, 以减小GLM中可能存在的假阳性位点。GLM检测到61个显著位点, 联合解释了47.08%的表型变异, 其中21个位点得到前人验证。合并两模型位点后共得到62个显著位点, 联合解释47.31%的表型变异。21个位点与前人定位的QTL重叠, 包括Bn-scaff_ 17526_1-p1066214和Bn-scaff_16064_1-p938130等大效应位点, 其中Bn-A01-p9621623、Bn-Scaffold 002856-p361和Bn-scaff_16874_1-p411591等位点得到多个群体的验证。在后续研究中值得对上述可靠性高的位点可进行精细定位和基因克隆, 为油菜千粒重的改良提供基因资源。

本研究共收集了26篇已发表的油菜千粒重QTL信息, 包含了3~159个QTL, 分布在19条染色体上, 解释的表型变异范围为2.40%~41.46%。与前人QTL位点比较, 本研究中41个显著位点尚未得到验证(表2和表3)。多个位点效应值较高且在多环境中被检测到, 如位点Bn-A03-p560769、Bn-scaff_ 15743_1-p599416和Bn-scaff_15743_1-p590955的表型贡献值分别为9.08%、8.80%和8.58%, 以上位点在3个单环境中均被检测到。此外, 在多个新位点附近找到候选基因, 如在Bn-A01-p15496639、Bn- A05-p2610006和Bn-A08-p10452462等位点附近分别找到拟南芥粒重已知基因、和等的同源基因。这些新位点可靠性高, 值得进一步研究与验证。鉴于千粒重是受多基因调控的复杂数量性状, 在育种上可针对上述位点设计分子标记, 通过分子标记辅助选择聚合有利等位基因, 选育出高产油菜新品种。

此外, 本研究在11个显著位点附近找到千粒重相关的候选基因及其拟南芥同源基因(表4), 根据基因功能注释, 多数候选基因归类于转录因子, 如、、、和等。这些基因还影响除粒重外的其他性状, 如功能缺失后对粒重和角果长均有抑制作用[12];编码二酰甘油酰基转移酶, 对籽粒含油量和籽粒均有重要调节作用[39];双突变产生多室角果, 每角粒数和千粒重均增加[45], 这些基因调控范围广, 利用价值大, 后期可重点关注。目前很多研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术改良油菜的性状, 如改良抗裂角[49]、株高和分枝数[50]、高油酸[51]等。本研究在Bn-scaff_18062_1-p229981位点附近找到候选基因, 其拟南芥同源基因为负调控因子, 可与和的启动子直接结合, 导致后者表达受抑制, 进而影响粒重, 后续研究可通过CRISPR/Cas9敲除提高油菜的千粒重。

4 结论

本研究利用496份油菜种质资源对千粒重进行全基因组关联分析, 群体在3个环境中千粒重的广义遗传力为63.12%。MLM模型检测到6个显著位点, GLM模型检测到61个显著位点, 合并共同位点后得到62个显著位点, 联合解释47.31%的表型变异。此外, 21个位点与前人研究定位的QTL重叠, 其中8个位点得到至少2个群体验证, 其余41个为新检测到的位点。在11个位点附近发现拟南芥粒重基因、EOD3、、、和等的同源拷贝。

附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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Genome-wide association study of 1000-seed weight in rapeseed (L.)

ZHANG Chun1,2, ZHAO Xiao-Zhen1,2, PANG Cheng-Ke1,2, PENG Men-Lu1,2, WANG Xiao-Dong2, CHEN Feng2, ZHANG Wei2, CHEN Song2, PENG Qi2, YI Bin3, SUN Cheng-Ming2,3,*, ZHANG Jie-Fu2,*, and FU Ting-Dong3

1Nanjing Agricultural University / State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, Jiangsu, China;2Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210014, Jiangsu, China;3National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Thousand-seed weight (TSW) is one of the important component of seed yield. In this study, a collection of 496 representative rapeseed accessions were genotyped by the high-throughput 60K SNP array for TSW in three environments (14NJ, 15TZ, 16TZ). The genome-wide association study (GWAS) of TSW was performed via the MLM (Mixed linear model) and GLM (General linear model). The results showed that the broad sense heritability of TSW was 63.12% in three environments. Six and 61 loci were detected with MLM and GLM, which explained 28.92% and 47.08% of the phenotypic variance, respectively. Combining the common loci between two models, 62 significant loci were obtained and accounted for 47.31% of the phenotypic variance. These loci were distributed on all chromosomes of the genome, with the largest number of 9, 8, and 7 loci detected on Chromosome A07, A03, and C06, respectively. The most significant locus Bn-scaff_17526_1-p1066214 was detected on C09, and accounted for 5.55% and 15.26% of the phenotypic variance in MLM and GLM, respectively. Among them, 21 loci overlapped with previously reported QTLs, of which 8 loci were verified by at least two populations. The remaining 41 loci were newly detected, and many of them had high effects and were detected in multiple environments, such as Bn-A03-p560769, Bn-scaff_15743_1-p599416 and Bn-scaff_15743_1-p590955. Besides, 11 candidates orthologous to documentedseed weight genes, like,,,,, and, were found near our GWAS loci. The results are helpful for analyzing the genetic basis of TSW of rapeseed and lay a foundation for studying the regulation mechanism and guiding the genetic improvement of TSW.

L.; 1000-seed weight; yield; GWAS; SNP

10.3724/SP.J.1006.2021.04136

本研究由国家重点研发计划项目(2018YFD0100602), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-12), 国家自然科学基金项目(32001581), 江苏省农业科技自主创新基金(CX(19)3055), 江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20190260)和中央高校基本科研业务费专项资金项目(2662016PY063)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100602), the China Agriculture Research System (CARS-12), the National Natural Science Foundation of China (32001581), the Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (CX(19)3055), the Natural Fund Project of Jiangsu Basic Research Program (BK20190260), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2662016PY063).

张洁夫, E-mail: jiefu_z@163.com; 孙程明, E-mail: suncm8331537@gmail.com

E-mail: 15662020807@163.com

2020-06-22;

2020-09-13;

2020-09-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200922.1143.006.html