水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4功能标记的开发及其利用

孙平勇 张武汉 张 莉 舒 服 何 强 彭志荣 邓华凤,3,*

水稻氮高效、耐冷基因功能标记的开发及其利用

孙平勇1张武汉1张 莉2舒 服1何 强1彭志荣1邓华凤1,3,*

1湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室, 湖南长沙 410125;2湖南省核农学与航天育种研究所, 湖南长沙 410125;3湖南省农业科学院, 湖南长沙 410125

通过分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)培育氮高效水稻品种是减少氮肥使用量、发展绿色农业和可持续农业的一个重要途经。水稻基因编码生长调节因子蛋白, 编码区第487和488碱基由TC变异为AA, 导致丝氨酸突变为赖氨酸, 使得水稻具有氮高效利用、高产和耐冷的特性。为了提高基因在育种中的选择效率, 本研究根据功能SNP (single nucleotide polymorphism)位点设计和筛选出等位基因特异PCR (polymerase chain reaction)功能标记PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。利用此功能标记对不同品种(品系)和川大粒/巨穗稻的F2群体进行基因型检测, 结合测序分析验证, 能准确快速鉴定的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型, 且具有操作简单、成本低的特点。本研究开发的功能标记为通过MAS方法利用基因培育氮高效、高产和耐冷水稻新品种提供了技术支撑。

水稻; 氮高效利用; 耐冷;基因; 等位基因特异性PCR

2020年5月, 世界实时统计数据显示全球人口已达77.85亿。按照每年1亿的增长速度, 到2050年, 全球人口总数将接近100亿。据预测, 到本世纪中叶全世界的农业水平要比2005年提高60%~120%才能养活100亿人口。水稻是最重要的粮食作物之一, 稻谷的增产与稳产对我国乃至世界的粮食安全至关重要。适量的氮肥使用对于提高水稻产量和改善稻米品质起着重要作用。然而, 近年来我国在追求水稻高产过程中, 过量施用氮肥及氮肥利用率低已成为普遍现象[1-2]。这不仅增加水稻生产成本, 影响稻米品质, 而且对生态环境造成严重的影响。因此, 提高水稻的氮利用率刻不容缓。研究表明, 不同施氮水平下, 氮高效水稻“库”大、“源”足、“流”畅, 其库容量和产量均明显高于氮低效水稻[3]。因此, 挖掘水稻氮高效基因并通过分子标记辅助选择(molecular marker- assisted selection, MAS)培育氮高效水稻品种是发展绿色、高效和可持续发展农业的一个重要途经[4]。

近年来, 随着测序技术、基因编辑和功能基因组学的飞快发展, 加速了水稻氮吸收与调控基因的克隆及其分子机理的解析。目前,[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10-11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[15]等参与氮吸收和转运的基因被成功克隆。其中,是氮高效利用的一个关键基因, 通过平衡生长调节因子与生长抑制因子之间的关系, 可以同时增加“绿色革命”水稻品种的氮利用效率和产量[13]。是一个多效基因, 本团队最先将粒形基因/精细定位在水稻第2染色体33 kb的区间[16]。后来发现水稻基因编码区序列全长1185 bp, 有5个外显子。第3外显子的SNP3位点由TC突变为AA, 导致丝氨酸变异为赖氨酸, 使得水稻籽粒落粒性降低、产量增加、氮利用率提高和苗期耐冷性增强。此突变正好位于的调控结合部位, 为功能位点[13,17-22]。

为了通过MAS方法培育氮高效、耐冷和高产水稻新品种, 加快育种进程, 本研究根据基因功能位点的碱基差异, 设计了2组功能标记。进一步利用该标记对水稻种质资源和川大粒/巨穗稻F2群体的基因进行了鉴定, 结合测序数据证明了该功能标记只需通过PCR (polymerase chain reaction)扩增和琼脂糖电泳即可快速准确鉴定出纯合型、杂合型和纯合型3种基因型。本研究开发的功能标记为基因的分子育种奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻材料包括携带功能基因的对照品种川大粒与近等基因系NIL-, 不携带功能基因的对照品种巨穗稻与NIL-, 不同来源的20个品种资源, 以及川大粒/巨穗稻的F2群体22个单株。所有材料均于2019年正季种植于湖南杂交水稻研究中心试验田。供试引物: 与共分离的分子标记GL2-11-F: 5′-GAGAAAGCCATTAGTG CA-3′, GL2-11-R: 5′-TCTACCAAACCAAAACAA-3′[16]。

1.2 OsGRF4基因功能标记的设计与合成

根据基因序列和功能位点的差异, 通过Primer Premier 5软件设计了6条引物。引物序列为PF: 5′-CTGTGAACCAACACCCTG-3′, PR: 5′-CGGC AATAGCAGGGTAAA-3′, DR: 5′-CGTTTCCACAG GCTTTCTTTT-3′, XR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTT CTTGA-3′, DMR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTTCTT T-3′, XMR: 5′-CGTTTCCACAGGCTTTCTGA-3′, 其中下划线的碱基C是人为引入的错配碱基。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3 DNA提取、PCR扩增和电泳检测

取水稻幼苗期叶片, CTAB法提取基因组DNA。利用T3 Super Mix体系(北京擎科新业生物技术有限公司)进行PCR扩增: 98℃预变性2 min; 98℃变性10 s、57℃复性10 s、72℃延伸10 s, 35个循环; 72℃延伸2 min; 4℃冷却, 反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶上100 V电泳40 min; 染色后于凝胶成像系统下观察分析。

2 结果与分析

2.1 OsGRF4基因功能标记的开发策略

根据基因功能位点SNP3 (TC-AA)的突变设计功能标记, 总共开发了6条引物。首先, 设计一对外引物PF和PR用作参考对照, 无论是哪种基因型都能扩增出488 bp的条带, 其扩增产物包含SNP3位点; 再根据SNP3的多态性设计2条反向内引物DR和XR, 其3′端分别对应碱基AA和TC, DR与基因完全匹配, XR与完全匹配; 此外, 为了增强PCR扩增的特异性, 分别在引物DR和XR的3′端第4位人为引入错配碱基C, 设计了引物DMR和XMR。根据设计引物的原理进行预测: 如果含有基因, 引物组合PF、DR (或DMR)和PR则能扩增出488 bp和370 bp两条目的带, 而PF、XR (或XMR)和PR组合则只能扩增出488 bp的目的带; 如果含有等位基因, 引物组合PF、DR (或DMR)和PR只能扩增出488 bp的目的带, PF、XR (或XMR)和PR组合能扩增出488 bp和370 bp两条目的带; 假如是杂合型, PF、DR (或DMR)和PR组合以及PF、XR (或XMR)和PR组合均能扩出370 bp和488 bp两条目标带(图1)。因此, 利用2种引物组合通过2次PCR扩增就可以区分2种纯合和1种杂合基因型。

SNP3为功能性多态位点, PF和PR为外引物, DR和XR为反向内引物, 分别与碱基AA和TC匹配。分别在DR和XR的3′端引入错配碱基C开发了DMR和XMR。箭头表示扩增方向。

SNP3 indicates functional polymorphic sites; PF and PR are outer primers; DR and XR are reverse inner primers, which matching the bases AA and TC, respectively. A mismatch base C was introduced in the 3′ end of DR and XR to develop DMR and XMR. The arrows indicate amplification direction of the primers.

2.2 OsGRF4基因功能标记的筛选和验证

为了筛选最优的功能标记, 以川大粒(携带功能基因)和巨穗稻(携带)的DNA为模板, 通过不同引物组合进行PCR扩增。图2所示, PF+PR引物在川大粒和巨穗稻中均能扩出488 bp的目标带(泳道1和泳道2); PF+DR或PF+DMR在川大粒中能扩出370 bp的目标带(泳道3和泳道11), 而在巨穗稻中扩不出(泳道4和泳道12); PF+XR或PF+XMR在巨穗稻中能扩出370的目标带(泳道6和泳道14), PF+XR在川大粒中能扩出淡淡的目的带(泳道5, 理论上应该扩不出), 而PF+XMR在川大粒中扩不出(泳道13), 因此PF+XMR优于PF+XR组合; PF+DR+PR或PF+DMR+PR组合在川大粒中能扩出370 bp和488 bp的两条目标带(泳道7和泳道15), 而在巨穗稻中只能扩出一条488 bp的带(泳道8和泳道16); PF+XR+PR或PF+XMR+PR在巨穗稻中能扩出370 bp和488 bp的两条目标带(泳道10和泳道18), 但是PF+XMR+PR的扩增效果要优于PF+XR+PR, 2种组合在川大粒中均只能扩出一条488 bp的带(泳道9和泳道17)。因此, 确定PF+DMR+PR和PF+XMR+PR为最优的功能标记组合。

单数泳道为川大粒; 双数泳道为巨穗稻; M: 100 bp marker; 1, 2: PF+PR; 3, 4: PF+DR; 5, 6: PF+XR; 7, 8: PF+DR+PR; 9, 10: PF+XR+PR; 11, 12: PF+DMR; 13, 14: PF+XMR; 15, 16: PF+DMR+PR; 17, 18: PF+XMR+PR.

The singular lane is ‘Chuandali’, the dual lane is ‘Jusuidao’. M: 100 bp marker; 1, 2: PF+PR; 3, 4: PF+DR; 5, 6: PF+XR; 7, 8: PF+DR+PR; 9, 10: PF+XR+PR; 11, 12: PF+DMR; 13, 14: PF+XMR; 15, 16: PF+DMR+PR; 17, 18: PF+XMR+PR.

2.3 功能标记对不同品种OsGRF4基因型的鉴定

以川大粒、巨穗稻以及近等基因系NIL-和NIL-为对照, 利用设计的功能标记对20份不同来源的种质资源进行检测。结果显示: 川大粒与NIL-的扩增结果一致, 巨穗稻与NIL-的结果一致。当以PF+DMR+PR组合进行扩增时, 20份资源均只能得到1条488 bp的目标带(图3-A); 当以PF+XMR+PR组合进行扩增时, 20份资源均能扩出370 bp和488 bp两条目标带(图3-B)。说明这些品种均不含有功能基因, 这与文献报道的突变位点为稀有变异一致[19,21]。此外, 功能标记PF+DMR+PR和PF+XMR+PR的检测结果与测序结果[21]完全一致, 因此, 利用此功能标记可以准确快速鉴定出水稻资源中是否含有氮高效、耐冷基因。

2.4 功能标记对F2分离群体OsGRF4基因型的鉴定

为了进一步验证功能标记对杂合基因型的鉴定效果, 对川大粒/巨穗稻F2群体的22个单株进行检测。首先, 利用与共分离标记GL2-11对F2的22个单株进行基因型分析, 结果显示有5个单株(泳道3、泳道6、泳道8、泳道11和泳道16)为纯合型, 8个单株为纯合型(泳道17~24), 9个单株能扩出2种亲本条带为杂合型(图4)。然后, 利用功能标记对这22个单株进行PCR扩增, 为了便于观察分析, 根据GL2-11的结果将样品以纯合型、杂合型和纯合型的顺序排列。结果显示, 如果是纯合型(泳道3~7), 当以PF+DMR+PR组合进行扩增时, 能扩出370 bp和488 bp的2条目标带,而PF+XMR+PR组合则只能得到1条488 bp的目标带;纯合型(泳道17~24)的结果与纯合型恰好相反; 而杂合型(泳道8~16), PF+DMR+PR组合和PF+XMR+PR组合均能扩出370 bp和488 bp两条目标带(图5), 检测结果与预期的结果完全一致。因此, 本文设计的功能标记可以有效对纯合、杂合型和纯合3种基因型进行准确鉴定, 适合用于基因的MAS育种。

A: PF+DMR+PR引物组合; B: PF+XMR+PR引物组合; M: 100 bp marker; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3: NIL-; 4: NIL-; 5~24: 农香99, 玉针香, 湘晚籼17, 冈46B, BL122, 佳辐占, 农香18, 明恢86, 新银占, 玉柱香, R700, 丰源 B, 农香29, 南洋占, R299, 02428, C418, P7144, 农香16, CY016。

A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; M: 100 bp marker; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3: NIL-; 4: NIL-; 5–24: Nongxiang 99, Yuzhenxiang, Xiangwanxian 17, Gang 46B, BL122, Jiafuzhan, Nongxiang 18, Minghui 86, Xinyinzhan, Yuzhuxiang, R700, Fengyuan B, Nongxiang 29, Nanyangzhan, R299, 02428, C418, P7144, Nongxiang 16, CY016.

M: 100 bp marker; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3~24: F2分离单株。

M: 100 bp marker; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3–24: individual plants isolated from F2population.

M: 100 bp marker; A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; 1: 川大粒; 2: 巨穗稻; 3~24: F2分离单株。

M: 100 bp marker; A: PF+DMR+PR; B: PF+XMR+PR; 1: Chuandali; 2: Jusuidao; 3–24: individual plants isolated from F2population.

3 讨论

MAS育种是利用与目标基因紧密连锁或者来自目标基因内部的分子标记, 对杂交后代的基因型进行快速准确鉴定, 达到选择目标性状的目的。它不受外界环境的干扰, 因此能显著提高育种的效率, 已成为作物遗传改良的重要辅助工具。根据基因组测序数据库预测, 水稻大约有4~5万个功能基因, 目前有1000多个控制产量、品质、株型以及抗生物逆境与非生物逆境的基因被克隆[23]。虽然已克隆的基因较多, 但是通过MAS手段在水稻育种中得以利用的却是少数, 主要是缺乏简单实用的分子标记[24]。

开发简便、经济和实用的分子标记是高效开展作物MAS育种的基础。早期开发的大多是与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记, 这种标记与目标基因之间会发生重组交换, 容易导致假阳性和选择效率低。如程保山等[25]利用连锁SSR标记对育性恢复基因进行选择, 结果表明3726R系列的育性恢复力只有94.1%。梁毅等[26]利用共显性InDel标记对广谱抗稻瘟基因进行选择, R640×谷梅4号组合的稻瘟病抗性选择率只有95%。后来Andersen等[27]提出功能标记的概念, 它是根据等位基因功能位点的DNA序列差异设计的标记。由于来自基因本身, 功能标记不会发生重组交换而导致假阳性, 对目标基因的选择效率可以达到100%, 因此功能标记在水稻MAS中被广泛应用[28-29]。胡雪娇等[30]根据水稻耐高温基因功能SNP (single nucleotide polymorphisms)的差异设计了dCAPS标记, 可以对F2群体的不同基因型进行准确鉴定。陈涛等[31]根据除草剂抗性基因编码区碱基差异开发的功能标记, 可以准确区分3种不同的基因型, 并且选择的结果与苗期除草剂的抗性完全一致。

水稻很多基因的功能是由于SNP的变异造成的, 比如水稻香味基因[32]稻瘟病抗性基因[33]粒重主效基因[34]抗除草剂基因[35]氮高效基因[36][37]究的氮高效、耐冷基因[17-22]。SNP检测的主要方法是通过PCR扩增, 然后对扩增产物进行回收测序。另一种方法是根据SNP信息开发CAPS或者dCAPS标记, 它受酶切位点的限制, 同时需要增加酶切的步骤。测序和酶切的方法增加了检测成本和劳动强度, 不适合检测大量的遗传材料。扩增阻滞突变系统PCR (amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR)又称等位基因特异性PCR (allele-specific PCR, AS-PCR), 其原理是根据目的基因SNP的差异分别设计特异引物, 只在匹配的基因型中有扩增产物, 可以鉴定出包括杂合型的3种基因型。AS-PCR省去了测序和酶切的步骤, 具有快速和费用低的特点, 已广泛用于水稻MAS育种。王军等根据水稻稻瘟病抗性基因功能区域的核苷酸差异开发了AS-PCR功能标记, 可以准确鉴定出的不同基因型[38]。后来在ARMS-PCR的基础之上开发了四引物扩增受阻突变PCR (tetra-primer ARMS-PCR), 通过1次PCR扩增就可以区分3种基因型[39]。然而Tetra-Primer ARMS-PCR的4条引物在同一PCR体系中, 引物的浓度比酶的浓度以及退火温度都会影响扩增效率和特异性, 因此很难避免扩增效率低和非特异延伸的问题, 最终导致检测准确性降低, 限制了其在MAS中的应用[39-40]。

氮素是水稻生长发育所必需的营养元素, 水稻产量与氮肥的施用量密切相关。研究表明粳稻比籼稻的氮肥利用率要低[41]。过量施用氮肥会造成严重的生态环境问题, 解决此问题的关键是通过MAS培育氮高效利用的水稻品种。是氮高效利用的一个重要基因, 利用可以实现产量和氮肥利用率的双增长[13]。此外,的突变类型属于稀有变异[19,21], 是一种新的遗传资源, 因此它在水稻遗传育种中具有较大的应用前景。Makoto Matsuoka在上评论说,将在可持续农业中发挥巨大的作用[42]。开发基因的功能标记是开展该基因MAS育种的前提。本研究对AS-PCR进行了改进, 增加了1对外引物用作参考对照, 无论是哪种基因型都能扩增出488 bp的条带; 此外, 根据功能位点SNP3 (TC-AA)的突变开发了相应的内引物。通过优化筛选证明, 在3′端第4位引入错配碱基的引物组合比没有引入错配的组合的扩增效果要好, 最终确定PF+DMR+PR和PF+XMR+PR为基因最优的功能标记组合。通过2次PCR扩增, 对水稻不同品种资源以及F2群体的进行鉴定, 结合测序的结果, 证明本研究开发的功能标记可以同时对纯合、杂合型和纯合3种基因型进行精准快速鉴定。在利用基因进行回交选育的过程中, 大多情况只需把目标基因型AA纯合和AA/TC杂合型筛选出来就可以, 利用本研究的PF+DMR+PR引物组合进行1次PCR反应就可以准确快速筛选出2种目标基因型。因此本研究开发的功能标记组合可以很好的应用于相关资源基因鉴定与MAS育种。

4 结论

根据氮高效、耐冷基因功能区域存在的单核苷酸差异(TC-AA), 并在3′端第4位引入1个错配碱基, 开发了AS-PCR功能标记组合PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。PF+DMR+PR能特异扩增纯合基因型; PF+XMR+PR能特异扩增纯合基因型; PF+DMR+PR与PF+XMR+PR均能扩增出2条带的为杂合型。该标记可以对水稻品种资源以及F2群体的进行精准快速鉴定, 因此能用于分子育种培育氮高效、高产和耐冷水稻新品种。

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Development and application of functional marker for high nitrogen use efficiency and chilling tolerance genein rice

SUN Ping-Yong1, ZHANG Wu-Han1, ZHANG Li2, SHU Fu1, HE Qiang1, PENG Zhi-Rong1, and DENG Hua-Feng1,3,*

1State Key Laboratory of Hybrid Rice, Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha 410125, Hunan, China;2Nuclear Agriculture and Space Breeding Research Institute, Changsha 410125, Hunan, China;3Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, Hunan, China

The use of molecular marker-assisted selection (MAS) to breed rice with high nitrogen-use efficiency is one of the most effective methods to reduce the amount of nitrogen fertilizer quantity and to develop the green and sustainable agriculture. The gene growth-regulating factor 4 () encodes a growth regulatory factor protein, and the mutation in the coding region from the nucleotides TC to AA in 487 and 488 substituted the amino acid serine for lysine, which resulting in enhancing nitrogen-use efficiency, increasing grain yield, and improving chilling tolerance in rice. In order to improve the selection efficiency ofin rice breeding, an allele-specific PCR (AS-PCR) marker combination, PF+DMR+PR and PF+XMR+PR, was developed based on the single nucleotide polymorphism in the functional region of thealleles. The functional marker was used to identify genotypes of different varieties and an F2population derived from Chuandali/Jusuidao. The three different genotypes oflocus could be accurately distinguished, which was further confirmed by sequencing. This functional marker is simple to operate and low-cost, and could provide a technical support when using MAS to breed new rice varieties of high nitrogen-use efficiency, high yields, and increased chilling tolerance.

rice; high nitrogen-use efficiency; chilling tolerance;gene; AS-PCR

10.3724/SP.J.1006.2021.02035

本研究由湖南省自然科学基金项目(2019JJ50427, 2020JJ5287), 湖南省科技重大专项项目(2018NK1020-1)和湖南农业科技创新资金项目(2020CX08, 2019TD06)资助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hunan (2019JJ50427, 2020JJ5287), the Hunan Province Key Research and Development Program Project (2018NK1020-1), and the Hunan Agricultural Science and Technology Innovation Project (2020CX08, 2019TD06).

邓华凤, E-mail: dhf@hhrrc.ac.cn

E-mail: zlspy23@126.com

2020-05-22;

2020-08-19;

2020-09-10.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200908.1547.002.html