玉米籽粒突变体smk7的表型分析和基因定位

蒋成功 石慧敏 王红武 李 坤 黄长玲 刘志芳 吴宇锦 李树强 胡小娇,* 马 庆

1 作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室, 安徽合肥 230036; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 作物分子育种国家工程实验室, 北京 100081

玉米是世界第一大粮食作物, 也是重要的饲料和工业原料[1], 玉米产量对全球粮食安全具有举足轻重的作用。玉米籽粒发育状况决定着玉米的产量和品质, 因此籽粒遗传发育机制一直是玉米研究的热点[2-3]。玉米的籽粒由胚、胚乳和表皮3个部分组成。胚是籽粒的关键部分, 是精子与卵细胞融合形成的二倍体。胚乳占籽粒的绝大部分, 为籽粒的早期发育提供营养物质, 是精子与中央细胞极核融合形成的三倍体[4]。发掘调控胚和胚乳发育的关键基因并解析其分子机制, 对指导玉米高产优质育种具有重要意义[5]。

籽粒突变体是研究胚和胚乳发育机制的良好材料。早在1980年, Neuffer和Sheridan[6]利用EMS化学诱变玉米材料, 发现大约300个基因上的相关位点与玉米籽粒发育有关。随后, 学者们根据突变籽粒的表型将玉米籽粒突变体大致分为, 小籽粒(small kernel,smk)、籽粒严重缺陷(defective kernel,dek), 胚特异缺陷(embryo defective,emb), 粉质胚乳(opaque或floury)和空果皮(empty pericarp,emp)等类型[7]。

胚乳是玉米籽粒营养的主要储存部位, 包括淀粉胚乳、糊粉层、转移层及胚周层4个区域。粉质胚乳突变体具有不透明胚乳, 通常赖氨酸含量较高。赖氨酸具有促进生长发育及增强免疫的作用,因此这类突变体被广泛研究。目前已克隆opaque或floury突变体有14个, 如隐性突变o2、o5-7、o10、o11[8-10], 半显性突变fl1[11]等。其中研究最早的o2突变体赖氨酸含量较野生型增加约69%[12]。O2基因编码 Bzip转录因子调控醇溶蛋白基因表达, 突变后醇溶蛋白含量显著降低, 富含赖氨酸的非醇溶蛋白含量增加, 从而极大提高籽粒中赖氨酸含量[13-15]。而其余opaque或floury基因也均与醇溶蛋白的结构、分布和积累密切相关。近期克隆的fl3在淀粉胚乳细胞中特异表达, 通过与 RNA聚合酶III互作调控5S rRNA和tRNA的转录[16]。胚乳基部转移层(basal endosperm transfer layer, BETL)位于胚和胚乳之间, 是籽粒从母体获取营养的重要部位, 并且还具有细胞分裂素合成、能量代谢、防御反应以及母本和籽粒之间信号传导等多种功能。一旦受损会严重影响籽粒发育, 如mn1、dek37、dek41、dek44等突变体。Mn1编码细胞壁转化酶,mn1突变体胚乳基部转移层缺乏己糖的合成, 导致BETL细胞发育受到影响, 引起籽粒缺陷表型[17]。DEK37编码P亚家族的三角状五肽重复蛋白(PPR),该蛋白功能的丧失导致线粒体复合体 I亚基nad2的第一个内含子剪接效率降低[15]。DEK41编码 1个P型的PPR蛋白, 与玉米nad4内含子3的顺式剪切有关, 突变导致转移层细胞中线粒体结构和功能遭到破坏, 引起BETL层细胞发育受损[18]。糊粉层包裹着胚和胚乳细胞, 种子萌发时, 糊粉层产生水解酶, 分解胚乳中的营养物质。目前已知调控糊粉层发育的基因有DEK1、CR4、SAL1、THK1和NKD1。DEK1基因编码胚乳中糊粉层细胞的1个蛋白酶,CR4编码受体激酶,SAL1编码1个E类液泡蛋白, 在质膜的囊泡运输上起作用,CR4和DEK1参与糊粉层细胞特化的信号接收与传导,SAL1降解或者循环DEK1,CR4来维持质膜上二者的浓度, 起负调控作用[19]。

胚是玉米籽粒具有生命活性的部分。胚特异突变体通常表现为籽粒大小正常, 但是没有可见胚或胚发育畸形。已克隆的胚发育特异基因有EMB8156、EMB8522、LEM1、EMB12、EMB14、EMB16、EMB-7L[20]等。EMB8516、LEM1、EMB14和EMB16的功能均与质体核糖体形成相关,Emb12编码质体起始因子 3 (IF3), 质体基因的正确表达对玉米胚发生具有重要意义。PPR8522与EMB-7L均编码叶绿体靶向的 PPR蛋白, 突变后叶绿体受损, 代谢产物合成受抑制[21]。除了上述突变体外, 还有一类胚和胚乳都有缺陷的突变体, 如small kernel突变体的胚和胚乳发育都比较滞后。SMK6基因编码 1个PPR-E+型蛋白, 突变导致线粒体nad1-740、nad4L-110、nad7-739和mttB-138、139位置上 C-U的编辑受到影响, 损害了线粒体活性[22]。SMK4基因碱基的缺失突变导致线粒体复合物 IV细胞色素 C氧化酶1 (cox1)转录本的1489位C被U编辑[23]。总而言之, 在玉米籽粒突变中, 大部分的籽粒突变是由PPR蛋白的突变导致的。而PPR蛋白分为PLS、E、E+、DYW 几种类型, 直接或间接参与 RNA稳定、翻译、切割、剪切、编辑等[24]。

本研究以玉米自交系B73经EMS诱变产生的籽粒突变体smk7为研究材料, 对突变籽粒的表型和显微结构进行观察, 同时构建不同遗传背景的 F2分离群体, 开展性状的遗传解析和基因定位。结合对定位区间的基因注释, 为候选基因的克隆及功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

利用EMS诱变玉米B73自交系花粉构建突变体库, 经过筛选获得 1个表型可稳定遗传的小粒突变体smk7(small kernel 7)。由于smk7发芽率低, 且不能生长成正常植株, 我们将杂合植株(+/smk7)自交4代(M4)获得的分离果穗用于突变表型分析。2017年和2018年在北京昌平基地, 分别以昌7-2、Mo17和郑58为母本, 以M4代杂合植株(+/smk7)为父本, 杂交得到F1群体, 再自交获得不同遗传背景的F2分离群体。F2群体用于后续的遗传分析和基因定位。

1.2 实验方法

1.2.1 扫描电镜观察淀粉粒结构 取 M4代分离果穗上的野生型和突变体籽粒, 在 65℃烘箱内连续烘 48 h确保籽粒完全脱水干燥, 把胚乳部分敲碎,固定在贴有导电条的圆形金属样品台上, 置于离子溅射仪中镀金膜, 用HITACHISU8020扫描电镜对突变体胚乳的淀粉大小和结构变化进行观察。

1.2.2 石蜡切片 取授粉后12 d的M4代分离果穗上的突变体和野生型籽粒, 用 FAA固定液保存,固定后的组织材料进行脱水、透明、浸蜡与包埋, 将包埋好的蜡块切片黏附于载玻片上, 然后盖上盖玻片在45℃烘箱里干燥。再用OLYMPLUS BX53正置显微镜(奥林巴斯, 日本)观察并照相。

1.2.3 籽粒蛋白、油分和淀粉含量的测定 淀粉含量的测定: 取野生型籽粒和突变体籽粒在 65℃烘箱中烘6 h以上, 用磨样机磨样, 称取2.5 g粉末, 加10 mL CaCl2-乙酸溶液润湿, 再加50 mL CaCl2溶液充分混匀, 置于120℃油浴锅中加热30 min, 放入冷水槽冷却至室温, 将水解液全部加入带漏斗100 mL容量瓶中, 并加1 mL硫酸锌溶液摇匀, 在加1 mL硫酸亚铁溶液充分沉淀蛋白质, 蒸馏水定容至100 mL, 摇匀过滤。用空白液调整旋光仪零点, 再将滤液装满旋光仪室温下测定。结果计算:

粗淀粉(%) = α×105/L × W × (100 − H) × 203。

式中, α为旋光仪上读出的旋转角度; L为炫光管长度(dm); W为样品重(g); 203为淀粉比旋度; H为样品含水量(%)。

籽粒蛋白和油分测定: 用德国 BRUKER MPA近红外光谱仪测定油分和蛋白含量, 分别选取大小均一的突变体和野生型籽粒置于样品杯中, 用透射方式扫描获得籽粒近红外样品的吸收光谱图, 每个样品重复装样扫描3次, 实验设置3个生物学重复。根据本实验室已构建的蛋白和油分模型, 利用BRUKER公司的OPUS软件进行数据分析。

1.2.4 基因的初定位和精细定位 以突变体与Mo17杂交构建的 F2群体为材料开展基因定位。提取F2果穗上的45粒突变籽粒及双亲的基因组DNA。委托博瑞迪生物技术有限公司进行基于 20K GBTS(genotyping by target sequencing) 靶向测序基因型分型[3]。计算每个多态性 SNP标记的基因型频率(SNP index), 即亲本型基因型占所有F2样本基因型的频率, SNP index越接近1, 表明标记与目标基因连锁越紧密。然后用MaizeGDB和Gramene等网站比对和下载定位区间内的核苷酸序列, 用 Primer 5等软件开发InDel和SNP标记。进一步扩大定位群体, 筛选标记处的交换单株, 完成基因精细定位。

利用试剂盒 DP360 (天根生化科技(北京)有限公司)提取正常籽粒和突变籽粒的DNA, 操作步骤如下:样品充分研磨, 加入裂解液, 涡旋离心, 转移上清过柱, 将滤液和无水乙醇等体积混合, 将混合液过柱,倒掉滤液, 加漂洗液漂洗2次, 离心, 加ddH2O溶解2 min, 得到的DNA溶液置于–20℃保存。选用25 µL扩增体系, 上下游引物各1.25 µL, PCR mix 12.5 µL,DNA 2 µL, ddH2O 8 µL。扩增程序为: 98℃预变性3 min; 98℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸30 s、共35个循环; 72℃终延伸5 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果与分析

2.1 小粒突变体smk7的表型分析

smk7是玉米自交系 B73经 EMS诱变产生的小籽粒突变体。对 M4和 F2代成熟分离果穗进行观察发现,smk7突变体与野生型相比, 种皮皱缩,籽粒扁小, 胚与胚乳发育缺陷(图 1-A, B)。仅有10%的突变籽粒可以发育成苗, 但幼苗植株生长发育缓慢, 叶色浅黄, 最终不能发育为正常植株(图 1-C)。百粒重测量结果表明, 突变体籽粒百粒重显著降低, 仅约野生型籽粒的 35% (图 2)。对smk7和野生型籽粒胚乳结构进行扫描电镜观察发现, 野生型淀粉粒呈球形, 形状规则, 而突变体淀粉粒变小, 结构不规则。突变体与野生型蛋白体结构无明显差异(图3)。

2.2 小粒突变体smk7的籽粒成分测定

smk7突变体籽粒成分测定结果表明, M4代分离果穗的smk7突变籽粒淀粉含量和蛋白含量低于野生型籽粒, 油分含量突变籽粒略高于野生型籽粒,均未达到显著水平。F2代分离果穗的smk7突变籽粒淀粉和油分含量显著低于野生型, 而蛋白含量显著高于野生型, 可能是由于不同背景的影响导致 F2代籽粒淀粉、油分和蛋白的含量发生变化(图4)。

2.3 小粒突变体 smk7授粉后不同时期胚和胚乳的观察分析

对授粉后12、15、18、21、25和30 d的M4代分离果穗进行观察发现, 授粉后12 d即可明显区分出smk7突变籽粒。与野生型籽粒相比,smk7籽粒明显体积较小, 胚乳不饱满, 胚发育迟滞, 几乎不可见。随着发育进程的增加, 突变表型更加显著, 授粉后21～25 d, 胚发育明显滞后, 大小不足野生型胚的1/10, 胚乳灌浆不饱满。授粉后30 d, 突变籽粒果皮和胚乳间出现较大空隙, 籽粒皱缩体积约为野生型的 1/3, 胚和胚乳略有增大, 但结构畸形明显, 以上结果表明smk7突变产生与籽粒发育的早期(图 5-A,B)。进一步对授粉后12 d的野生型和smk7籽粒制作石蜡切片, 显微观察发现, 结果发现与野生型籽粒相比, 突变体发育严重滞后, 突变体的胚乳转移层细胞(BETL)存在明显发育异常。授粉后12 d, 野生型籽粒 BETL区细胞发育完善, 成带状和基部胚乳细胞接触更为紧密, 有明显的细胞壁内突, 而smk7突变体BETL区细胞与基部分离, 细胞壁内突不明显(图 6)。由此推测SMK7基因突变可能导致BETL细胞发育异常, 影响母体营养物质向胚和胚乳传递, 造成了籽粒的发育缺陷表型。

2.3 smk7受单隐性核基因控制

利用杂合植株(+/smk7)分别与自交系Mo17、昌7-2、郑58杂交得到F1群体, F1自交获得不同遗传背景的F2群体。挑选杂合体F1植株进行自交, 对M2、M3和 F2分离果穗中的小粒突变体和正常籽粒进行统计, 计算分离比, 卡方测验结果表明, 正常籽粒与突变籽粒之比均符合3∶1分离规律(χ2<3.84) (表2)。表明smk7小籽粒性状受1对隐性单基因控制, 是细胞核遗传。

2.4 SMK7基因的定位

表2 不同群体的遗传分离比检验Table 2 Genetic segregation test of different populations

以 Mo17为遗传背景的 F2分离果穗为材料, 利用CTAB法提取45个粒突变籽粒及其亲本DNA, 利用20K GBTS靶向测序技术分析样本基因型。去除杂合及双亲之间无多态的位点后, 共得到 7903个SNP多态性标记, 占总位点数的39.5%, 其中1号染色体最多为1314个, 10号染色体最少为586个(图7)。通过计算各条染色体, 每个多态性 SNP标记的基因型频率(SNP index), 发现 2号染色体上 0.04 Mb～9.54 Mb区间可能与目标性状连锁(图8)。扩大定位群体, 提取 274个突变籽粒 DNA, 同时开发In0.83、In1.16、In1.9和 In4.3若干对 InDel标记, 将SMK7定位在0.83 Mb～1.9 Mb区间。继续扩大定位群体到 399, 开发 SNP1、SNP2、SNP3、SNP4和SNP5等若干对SNP标记, 最终将SMK7基因定位在 2号染色体的 SNP2和 SNP3两个 SNP标记之间, 左侧标记处交换单株数为4, 右侧标记处交换单株数为 9, 物理距离为 120 kb (图 9)。利用Gramene (http://www.gramene.org/)网站检索到此区间内含有 8个蛋白编码基因。对Zm00001d00 1818和Zm00001d001820两个基因进行测序并和B73序列比对发现无变化; 其余6个基因分别编码:乙酰化酶家族蛋白(Zm00001d001819)叶绿体 β亚基邻氨基苯甲酸合成酶(Zm00001d001823)、Dof锌指蛋白(Zm00001D001824)和 WD40重复超家族转导蛋白(Zm00001D001825); 还有 2个功能未知蛋白(Zm00001d001821和Zm00001d001822)(表 3)。

3 讨论

籽粒是玉米主要营养储存器官, 也是研究禾本科种子发育的模式器官。开展籽粒突变体研究对于克隆籽粒发育关键基因及解析籽粒发育调控分子机制具有重要意义。

本研究中smk7突变体属于小粒(small kernel)类型突变体, 表现为胚和胚乳发育迟滞的表型。成熟的smk7突变体种子体积较小, 胚和胚乳发育缺陷, 尚有少数可以成苗, 幼苗具有黄化现象。这种表型不同于emp、emb等类型的突变体,emp是胚和胚乳严重缺陷的致死突变, 而emb突变体仅胚发育存在异常。小部分dek突变体表型与smk7类似, 如dek36、dek37、dek40、dek42[25]等发育成幼苗。对smk7授粉后12 d 的籽粒石蜡切片观察发现, 突变体 BETL层细胞壁向内生长受阻, 发育迟缓。胚乳基部转移层是一类2～3层高度特异的细胞, 含有大量线粒体, 参与细胞的信号转导,激素合成等重要功能, 种子灌浆发育需要通过BETL从母体中获取营养。表明SMK7基因可能调控胚乳基部转移层细胞形成, 进而影响胚和胚乳发育。

表3 候选区间内基因信息Table 3 Gene information in the candidate region

目前已克隆的smk突变体有smk1、smk2、Zmsmk3、smk4、smk6和Zmsmk9[26-29]。smk1突变体胚和胚乳发育滞后, 种皮和胚乳之间有很大空腔,约 10%的突变籽粒可萌发。SMK1基因编码 1个 E型PPR蛋白, 参与了线粒体nad7-836的编辑。smk2突变体籽粒变小, 胚败育, 胚乳细胞少, BETL细胞发育受阻。SMK2位于4号染色体, 编码谷氨酰胺酶参与vitamin B6的合成。Zmsmk3突变体表现为胚与胚乳发育滞后, BETL细胞发育严重受损, 约30%突变籽粒可萌发成苗。ZmSMK3位于 3号染色体, 编码 1个线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白, 参与nad1的第4内含子和nad4的第1内含子剪切过程;smk4小粒突变体95%可以成苗, 但是植株生长发育缓慢且花期延后。基因克隆结构表明SMK4位于 4号染色体编码E亚类PPR蛋白, 参与线粒体cox1转录本 C-U的编辑;smk6是 1个小粒胚致死突变体,SMK6基因位于10号染色体, 该基因编码E型PPR蛋白, 影响线粒体基因的编辑功能;Zmsmk9突变体胚与胚乳发育滞后, 但是能正常萌发并发育成株。ZmSMK9位于1号染色体, 编码1个P型PPR蛋白,参与nad5的剪切。由此可知大部分smk突变均与线粒体功能缺陷有关, 线粒体作为细胞的能量工厂和进行有氧呼吸的主要场所, 在胚乳 BETL细胞功能及籽粒发育中具有重要的作用。

本研究中smk7被定位在 RM1433917～RM15 35316两个SNP标记之间, 物理距离约为120 kb。通过MaizeGDB和Gramene生物信息学网站分析发现该区段包含了 8个新的蛋白编码基因。对其中Zm00001d001818和Zm00001d001820进行PCR扩增并和诱变亲本 B73进行序列比对发现无突变位点;Zm00001d001819编码氮-乙酰氨基葡萄糖基磷脂酰肌醇-氮-乙酰化酶家族蛋白, 目前今发现在哺乳动物, 酵母和原生动物中有活性[30];Zm00001d001823的编码叶绿体β亚基邻氨基苯甲酸合成酶1, 可能参与IAA合成的色氨酸途径[31]。在核分化过程中, IAA控制着糖和蛋白质的代谢, 是胚乳 BETL形成的必要条件, IAA通过CK或ABA直接或间接地调控玉米醇溶蛋白编码基因的转录。Zm00001d001824编码Dof锌指蛋白, 广泛参与碳氮代谢、花和花粉发育、种子发育和萌发、次生代谢、维管发育和叶片等植物生长发育过程。Zm00001d001825编码WD40重复超家族转导蛋白, 可能与 AP2形成复合物协同作用于网格蛋白介导的内吞作用[32]。玉米edh1突变体中与网格蛋白内吞作用的基因发生突变, 导致突变体籽粒变小, 因此 WD40也可能参与籽粒发育调控。所以后续还需通过候选基因测序、基因表达分析等分子实验进一步确定候选基因。

4 结论

本研究以B73为背景材料通过EMS诱变得到1个可以稳定遗传的籽粒突变体, 该突变体籽粒变小,胚和胚乳发育严重滞后, 胚乳 BETL层细胞发育迟缓, 细胞壁发育向内生长受阻。利用图位克隆将SMK7定位在 2号染色体短臂 RM1433917～RM1535316这2个SNP标记内, 物理距离约为120 kb, 在该区间内没有已克隆的籽粒发育相关基因,因此SMK7可能是1个调控籽粒发育的新基因。