明胶与六偏磷酸钠的复凝聚研究

侯 岭

(乌鲁木齐市米东区农产品质量安全检测中心，新疆 乌鲁木齐 830000)

引言

明胶(gelatin，GE)是胶原蛋白的水解产物，是两性物质，同时含有-COOH和-NH32类基团，具有乳化性。通过调节pH可以改变明胶的带电性，且范围广。正是由于这种优良的性质，常被用作为复合凝聚法的壁材，可与不同种类的多糖物质或其它相反电性的化合物形成复聚物。六偏磷酸钠(Sodium metaphosphate，SHMP)，又称“聚偏磷酸钠”“格雷汉姆盐”，为直链状聚合化合物，其链长至少为20～100个单位，在食品工业中用作品质改良剂，也可作为锅炉用水和工业用水的软水剂，在医药、石油、造纸等领域都有广泛的应用[1]。

不同壁材组合形成复聚物的结构及性质存在区别。本文主要研究明胶与六偏磷酸钠形成复聚物的条件，如壁材比、pH、壁材浓度，通过浊度、Zeta电位等手段进行表征，并与常见的大分子壁材组合明胶-阿拉伯胶对比。复聚物的性质与相应微囊的制备有相关性，研究复聚物的性质能为复合凝聚法制备微囊起到指导作用。

1 材料与设备

1.1 原料与试剂

明胶，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；六偏磷酸钠，分析纯，阿拉丁；阿拉伯胶，生物试剂，国药集团化学试剂有限公司；醋酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

AL204万分之一电子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HK-1D型恒温水槽，南京大学应用物理研究所；JJ-3数显恒温搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DM 1000生物显微镜，德国Leica公司；雷磁PHS-25 pH计，上海雷磁仪器厂；DHC-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海圣欣科学仪器有限公司；其它玻璃仪器，北京欣维尔玻璃仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 反应液的制备

分别配制1%的明胶、六偏磷酸钠与阿拉伯胶溶液，以质量浓度(W/V)浓度配制。具体配制方法：称取1g明胶或阿拉伯胶，加入100mL去离子水于50℃水浴中加热溶解1h；六偏磷酸钠在常温下配制即可，操作同上。

2.2 Zeta电位的测定

分别配制0.1%的明胶、六偏磷酸钠与阿拉伯胶溶液，利用1%的醋酸溶液将各反应液调到所需pH值，使用电位仪测量各个pH下的Zeta电位值，并绘制曲线。

2.3 复合凝聚反应的浊度滴定曲线

配制明胶-六偏磷酸钠混合反应液(15∶1，W/W)，总浓度为0.1%。将反应液置于50℃的恒温水浴中，500rpm下搅拌，逐滴滴加醋酸溶液，调节不同的pH值，取样于400nm下测量各个pH下的吸光度值，即为浊度值。配制明胶-阿拉伯胶混合反应液(1∶1，W/W)，总浓度为0.1%，其它步骤同上，取样于590nm下测量吸光度值。

2.4 明胶-六偏磷酸钠复凝聚比例的确定

配制不同混合比例的明胶-六偏磷酸钠的反应液(GE/SHMP：45、40、35、30、25、20、15、10、5，W/W)，总浓度为0.1%。将反应液置于50℃的恒温水浴中，500rpm下搅拌，逐滴滴加醋酸溶液，调节不同的pH值(4.54、4.60、4.65、4.70、4.75)，取样于400nm下测量各个pH下的吸光度值，通过浊度的大小确定形成复合凝聚物的最佳壁材比。

2.5 明胶-六偏磷酸钠复凝聚浓度的确定

将不同浓度的明胶与六偏磷酸钠反应液(1%、1.5%、2%、3%、4%，W/W)混合，置于50℃的恒温水浴中，500rpm下搅拌，逐滴缓慢加入10%醋酸溶液，待pH调节到特定值后，继续反应30min。冰浴，使温度维持在15℃以下，继续搅拌20min。冰浴结束后，用10%(W/V)NaOH溶液调节体系至碱性(pH=9～10)，随后加入37%(W/V)甲醛进行固化反应1h。以复聚物的产率作为评价标准确定复聚物形成的最佳浓度。

2.6 复聚物的形态观察

用滴管取少量复聚物溶液置于载玻片上，盖上盖玻片，用生物显微镜观察复聚物的形态，放大倍数为400倍，并拍照记录。

2.7 复凝聚产率的测定

将复聚物溶液倒入离心管中，在3000rpm下离心30min，离心管底部的白色固体即为复聚物，用去离子水清洗复聚物3次。移去上清液，取出复聚物进行冷冻干燥。

计算复聚物产率公式：

式中，Y为复聚物产率，%；m为干燥后复聚物的质量，g；M为未反应前明胶与六偏磷酸钠的质量之和，g。

3 结果与讨论

复凝聚法是2种电性相反的物质主要通过静电相互作用结合形成不溶性复聚物。常见的发生复合凝聚的壁材组合均为大分子，如明胶-阿拉伯胶、壳聚糖-阿拉伯胶等。关于讨论明胶-六偏磷酸钠这类大分子与小分子组合形成复聚物的报道很少。将明胶-阿拉伯胶体系与明胶-六偏磷酸钠体系进行对比，能更深入、更透彻地了解复合凝聚的过程及复聚物的性质。

3.1 体系带电性质的分析

复合凝聚法主要是由静电相互作用驱动，因此pH对复聚物的形成具有很大影响。明胶是两性离子，带电性由环境中的pH决定。六偏磷酸钠在水中溶解度较大，在水中易电离，分子量为611.77。阿拉伯胶的成分较复杂，还含有少量蛋白质结构，因此，阿拉伯胶具有良好的乳化性。

明胶、阿拉伯胶与六偏磷酸钠在不同pH下的电位图见图1。通过对壁材电位的考察，能快速确定体系发生复合凝聚的pH范围，减少实验次数。由图1可知，明胶对pH敏感，表现在随着pH的下降电位经历了由负向正的转变。明胶分子的-COOH与-NH3在酸性或碱性环境中会发生电离，当-COO-多于-NH3+时，溶液呈负电；当COO-比-NH3+少时，溶液呈正电；当两者的量相等时，溶液呈电中性。根据这个性质，可以得到明胶的等电点，即电位为零时所对应的pH值。本实验所用的明胶等电点为5.10。

当今社会的科学技术发展迅速，我们要充分利用先进的科学技术，从实现最大限度防灾减灾的目的出发，建立合理的避险系统，在地质灾害发生时，及时的响应，科学高效的进行应急处理，力求将灾害程度降到最小。

图1 pH对明胶、阿拉伯胶及六偏磷酸钠带电性质的影响

阿拉伯胶在较宽泛的范围内电位均为负，且随着pH的下降，呈上升趋势，在pH 3.50～5.50的区间，电位在-25～-15mV。六偏磷酸钠不受pH的影响，电位在-40～-30mV波动。

由此可确定，在pH<5.10的情况下均能发生复合凝聚。但pH<2.00时，阿拉伯胶的-COOH电离受到抑制，电位由负向正转变[2]。因此，明胶-阿拉伯胶体系的复合凝聚发生范围在pH2.00～5.10。

3.2 体系的浊度滴定曲线

复合凝聚反应的过程中，溶液的pH会对壁材的带电基团有影响。随着pH的变化，复聚物在溶液中经历多个阶段的的变化，包括存在状态、粒径等，这些变化从外观上可通过浊度体现。通过测量体系的浊度，可以从宏观的角度对复合凝聚过程有进一步了解。

明胶-六偏磷酸钠体系在不同pH下的浊度滴定曲线见图2。选取pH范围为4.0～5.0，此时明胶带正电，六偏磷酸钠带负电。由图2可知，随着pH的变化，浊度呈现先增加后减小的变化趋势。在pH5.0～4.8阶段，浊度呈轻微的上升，此时明胶分子虽然带正电，但带电量极小，明胶与六偏磷酸钠之间的静电吸引力弱，没有出现相分离现象，混合液外观上透明、均一。这个阶段形成的复聚物称为可溶性复合物[3]。当继续滴加醋酸，从pH4.7开始体系的浊度快速增大，这是由于明胶的带电量增加，增强了与六偏磷酸钠之间的静电相互作用。溶液由透明转变为不透明的乳白色，静置一段时间后溶液发生分层，上层澄清透明，下层为白色粘稠状物质。此阶段形成的复聚物成为不可溶性复合物，在微囊上的应用正是基于此阶段。达到最大浊度点后，溶液的浊度开始下降，相比于浊度上升过程，浊度的下降过程显得比较缓慢。溶液由浑浊再次转变为透明状态，表明不可溶性复合物逐渐解体，重新变为可溶性复合物。

图2 pH对明胶-六偏磷酸钠体系浊度的影响

明胶-阿拉伯胶体系的浊度滴定曲线见图3，同样是出现了3个变化阶段，变化过程与明胶-六偏磷酸钠体系相同。pH4.8～4.5形成可溶性复合物，pH4.8～3.9形成不可溶性复合物，继续降低pH，又变为可溶性复合物。由于阿拉伯胶与六偏磷酸钠在不同pH下的电位有差异，导致形成3个阶段对应的pH值不同。

图3 pH对明胶-阿拉伯胶体系浊度的影响

3.3 复合凝聚物的形态

明胶与六偏磷酸钠、明胶与阿拉伯胶形成的复聚物均为球形，从能量方面解释，可能是为了降低体系的表面自由能所致。并不是所有体系形成的复聚物均为球形。张海洋等[4]在研究明胶-羧甲基纤维素体系时，发现明胶与羧甲基纤维素形成的复聚物呈长条状。

明胶-六偏磷酸钠体系在不同pH下形成的复聚物的显微镜图见图4。pH为4.75、4.71处于可溶性复合物阶段，在显微镜下观察不到复聚物。pH4.65时，复聚物的粒径较小，可能是此pH下明胶所带的正电较少，与六偏磷酸钠之间的静电相互作用不强所致，且由于六偏磷酸钠过量，形成的复聚物之间存在静电排斥作用，阻碍复聚物聚集。pH4.60下的复聚物粒径有所增大，且大小较均一，此时对应的是浊度的最大值，表明明胶与六偏磷酸钠之间的作用力已达最大。pH4.54时，复聚物的粒径进一步增大，此时的浊度值与pH4.60的浊度值相差不大。推测可能是六偏磷酸钠的电位不随pH变化，在pH4.60下明胶分子的有效位点与六偏磷酸钠的结合达到饱和，而pH4.54下明胶的电位发生变化，导致明胶分子上有过量的带电基团，由于静电排斥作用使得复聚物的结构不如pH4.60下的紧凑，因此粒径会略增大。但明胶的电位变化幅度较小，所以浊度变化并不明显。当pH降低到4.30时，溶液的粘度明显变大，搅拌过程中出现大量泡沫，形成的复聚物粒径继续变大，且出现粘连，有不规则形状出现。pH4.10时，可看到溶液中出现白色的絮状物，显微镜下观察到复聚物的粒径不均一，存在粒径小的复聚物，表明复聚物开始解体，由不可溶性复合物向可溶性复合物过渡。这与浊度滴定曲线的变化趋势一致。

3.4 明胶与六偏磷酸钠最佳比例的确定

本研究采用浊度法测量最佳壁材比。由图5可知，不同pH下，相同壁材比对应的浊度值不同。浊度曲线可分为2类，pH4.54、pH4.60、pH4.65下的浊度曲线趋势相同，均为随着壁材比的增大，浊度先增大后变小；pH4.70、pH4.75下的浊度曲线趋势一致，先增大后平缓，下降趋势不如第1类浊度曲线明显，且浊度值小，在0.5以下。

图5 混合比例对于明胶-六偏磷酸钠体系浊度的影响

图6 壁材比对明胶-六偏磷酸钠体系最大浊度的影响

由第1类曲线可知，在相同pH条件下，随着明胶用量的增加，浊度先增大后减小。当明胶用量较小时，六偏磷酸钠相对明胶过量，加入的明胶均能与六偏磷酸钠通过静电相互作用结合，使浊度增加；当明胶的量达到某一个值，如图5中GE/SHMP为15时，参与形成复聚物的明胶的量已达到饱和，此时对应的浊度为最大值；继续增加明胶的量，参与复合凝聚反应的明胶过多，由于分子间的静电排斥作用或空间位阻作用，使得复聚物的结构变得松散，复聚物开始发生解体，表现为浊度值开始下降。而第2类曲线，在相同pH下，随着明胶的量的增加，浊度上升的幅度不大，且出现平缓趋势。浊度之所以出现上升趋势，原因与第1类曲线相同，但由于pH 4.70、pH4.75接近于等电点明胶的电位较小，即使增加明胶的量，总体的正电荷增幅不大，六偏磷酸钠相对于明胶仍处于过量状态，因此浊度变化不大。

除此之外，随着pH的减小，最大浊度值对应的壁材比呈减小趋势，即明胶的量减小。这是因为随着pH的减小，明胶分子的zeta电位增大，结合位点增多，而六偏磷酸钠的量不变，因此，参与复合凝聚的明胶的量减小。

由图5可知，当pH为4.60，明胶/六偏磷酸钠为15时浊度值最大。因此，可确定明胶与六偏磷酸钠复合凝聚反应最适宜的pH为4.60，最佳壁材比为15。

不同壁材比的最大浊度值对应的pH不同。明胶/六偏磷酸钠为5时，在pH4.55～4.75，其浊度值均小于0.2，表明两者之间的相互作用极弱，可忽略不计。随着明胶/六偏磷酸钠比例的增加，不同壁材比对应的最大浊度值呈先增加后减小趋势，在壁材比为15时达最大。相应的，两壁材之间的相互作用随着壁材比的增加而先增加后减小，表明增大明胶比例，不利于复聚物的形成。Ana S Prata等[5]也得出相似的结论。在明胶与阿拉伯胶的体系中，增加明胶的量有助于产率的提高，而增加阿拉伯胶的量导致产率下降。

3.5 明胶-六偏磷酸钠复凝聚浓度的确定

明胶-六偏磷酸钠在复凝聚反应过程中的浓度是以复合凝聚物产率作为评价标准，在其它条件(pH、壁材比、温度、反应时间等)相同的情况下，复合凝聚物产率最高时对应的浓度即为最佳壁材浓度。在形成复聚物过程中，调节溶液至酸性至关重要，关系到能否形成复聚物。M Saravanan等[6]研究表明，酸的种类会影响复聚物的形成；以盐酸、柠檬酸、硫酸、硝酸和醋酸作为果胶/海藻酸钠-明胶体系的pH调节剂，发现这些酸都能诱导果胶-明胶体系形成复聚物，而只有醋酸才能引发海藻酸钠-明胶体系发生凝聚现象，柠檬酸不能形成凝聚物，其余几种酸使海藻酸钠与明胶生成沉淀。

本研究选用醋酸作为pH调节剂，且将壁材混合后逐滴滴加醋酸调节pH。在此基础上，选取了6种浓度(0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%)来探讨浓度对复凝聚产物的影响。

由图7可知，随着壁材浓度的增大，复凝聚物产率先增大后减小，在浓度为3%时，产率达65.1%，与Wang等[7]研究结果一致。因此，明胶-六偏磷酸钠复凝聚反应最适宜的壁材浓度为3%。

图7 壁材浓度对复聚物产率的影响

4 小结

复合凝聚反应主要的驱动力为静电相互作用，通过分析体系的带电情况确定复合凝聚反应发生的pH范围。明胶的等电点约为5.10。阿拉伯胶的带电量会随着pH的变化而变化，在pH>2.00时带负电。而六偏磷酸钠的带电性质与阿拉伯胶不同，其带电量与pH无关。因此，明胶-六偏磷酸钠体系形成复合凝聚物的pH范围更广。

明胶-阿拉伯胶体系与明胶-六偏磷酸钠体系的浊度滴定曲线的变化趋势一致。复合凝聚反应过程均是随着pH的减小，经历可溶性复合物-不可溶性复合物-可溶性复合物的过程。

通过对明胶-六偏磷酸钠体系的pH、壁材比、壁材浓度进行探讨，得出复合凝聚的最佳条件：pH=4.60、壁材比为15、壁材浓度为3%，此条件下复合凝聚物的产率达65.10%。