ROP信号途径在细胞极性发育中的研究进展

吕畅 周利明

(华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063210)

ROP(Rho-like GTPase from plants)是植物中介导信号传导的Rho类小G蛋白(small GTPases)，参与调控细胞极性建成、细胞壁的合成、过氧化氢的生成、胞吞与胞吐等方面[1]。如图1所示，ROP有结合GTP的活性形式和结合GDP的非活性形式2种状态。当细胞接受上游信号刺激后，鸟苷交换因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)通过鸟苷交换作用，将与GDP结合的非活性形式的ROP转变为与GTP结合的有活性的形式。有活性的ROP通过与一个或多个效应子相互作用，以传递不同的分子信号。GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP)促进小G蛋白结合的GTP水解，从而将ROP转变成非活性状态。大部分ROP存在膜结合态和胞质游离态2种形式，二者形成动态平衡。但只有与膜结合的ROP才可以被鸟苷交换因子GEF激活。在胞质中，ROP与鸟苷解离抑制因子(Guanine nucleotide dissociation inhibitor,GDI)结合，被隔离于胞质中处于无活性的储备状态[2-4]。简而言之，GDI和GAP是ROP的负调节因子，而GEF则被认为是ROP的正调节因子。ROP在胞质中和质膜上的循环以及活性和非活性形式的转换，构成一个高度动态的平衡，使得各种信号都能得到灵敏的响应。ROP作为植物中一类重要的分子开关，可与多种上游调节因子和下游效应因子发生相互作用，产生了一系列复杂的信号网络，以此调控多种细胞类型的生长过程[5]。

图1 ROP的调控模式图

1 植物细胞极性发育的模式系统

细胞极性是细胞发育的基本属性之一，从广义上讲称之为细胞的不对称性，需要通过细胞骨架和囊泡运输导致极性的建立和维持[2,6]。植物细胞极性是生命周期中每个阶段发育、生长和形态建成的基础。随着拟南芥发展成为模式植物，拟南芥的单细胞系统(花粉管或根毛)或多细胞系统(叶片铺板细胞)已成为研究植物细胞极性发育与形态建成的理想模式系统[7]，见图2。

花粉管萌发和生长是一个复杂的动力学过程，需要快速生长(最快可达1cm·h-1)，是一类典型的单细胞极性生长系统[8]。大多数植物细胞在体外培养时会失去其固有的极性，而体外培养的花粉管仍旧保持其发育状态和生长极性。体外培养的便捷性以及实时成像系统的不断升级，使花粉管成为植物细胞极性研究中的理性模式系统[9]。目前，花粉管顶端生长机制的研究主要集中在2个相互关联的方面：顶端聚焦的钙离子梯度和ROP信号网络。两者都可以反馈调节肌动蛋白细胞骨架的动态，从而构成花粉管顶端生长过程中复杂的信号调控网络[10]。

叶片铺板细胞如同拼图游戏中的模块相互嵌合生长在一起，局部地区向外特定生长，形成凸起区域(lobes)。而另一相邻区域则被抑制生长，形成凹陷区域(indentations)。具备凸起与凹陷结构特征的铺板细胞的形成是一个复杂和动态的极性建成过程。另外，相邻细胞之间的凸起和凹陷的精确匹配(一个细胞的凸起刚好嵌套在相邻细胞的凹陷中)，见图2，需要细胞间精巧的时空调节[11]。因此，叶片铺板细胞不仅可以用于研究细胞内复杂的极性发育过程，也可作为研究细胞间协调的极性模式系统。

图2 植物细胞极性生长模式系统

2 ROP在细胞极性发育中的功能多样性

拟南芥中基因组中存在11个ROP，系统发育学将这些ROP分为4组，见图3。I组只包括ROP8；II组包括ROP9、ROP10及ROP11；III组只包括ROP7；IV组包括ROP1～ROP6这6个ROP基因[12]。

2.1 ROP控制花粉管的延伸

ROP1、ROP3及ROP5在功能上存在着冗余性，CA-ROP1、CA-ROP5和过量表达的野生型ROP1或ROP5都可促进花粉管的去极化生长[13,14]。定位于质膜上的ROP1在花粉管顶端被激活，进而作用于下游的效应子RIC3和RIC4。前者可以引起花粉管顶端的钙离子积累，进而促进微丝的解聚。而后者可促进顶端微丝的聚合。2条通路相互拮抗，调控微丝动态，最终达到影响花粉管极性建成的作用[15]。

ROP1的活性是调节花粉管极性生长的关键因素。ROP1在顶端的分布存在周期性的震荡作用，并早于花粉管的生长周期震荡，说明ROP1的活性震荡引导着花粉管生长的震荡[16,17]。另外，RIC3所介导的Ca2+信号在花粉管生长过程中同样存在震荡现象[18]。Ca2+的震荡周期晚于ROP1活性的震荡周期，说明Ca2+与ROP1之间可能存在一个负反馈的调节作用，预示着Ca2+信号相关调控因子可能参与到Ca2+与ROP之间的负调节机制中[7]。

图3 拟南芥ROPs的系统发育分析

2.2 ROP调控根毛的发育

根毛的形态建成是个非常复杂的过程。根毛形成细胞底端膨大，而后如同花粉管的生长方式一样，在膨大细胞的顶端进行极性生长。利用GFP荧光标记，发现ROP2分布在根毛延伸区域的顶端。在根毛中表达CA-ROP2、ROP4或ROP6可以导致各向辐射生长或根毛长度增加，而过量表达DN-ROP2则会抑制根毛的生长[19]。这些研究都证实了ROP控制根毛的极性生长与花粉管中的情况类似，根毛中的ROP也是通过调节顶端钙离子积累和微丝动态来实现其功能的[15,19]。

除了调控根毛的顶端生长外，ROP还参与了根毛膨大位点的形成和极性生长位点的建立。过量表达ROP2后，根毛形成的细胞膨大位点无法正确定位而导致同一个根毛细胞会形成多个分支结构[19]。极性生长是一种依赖于微丝的辐射生长，而顶端位点的建成是被微管所调节，所以ROP在早期根毛发育与伸长时期的顶端生长中所起的调控机制有所不同[4]。

2.3 ROP调控叶片铺板细胞的发育

叶片铺板细胞是一类研究细胞与细胞间协同生长，以及调控弥散生长的理想模式系统。铺板细胞的形状建成主要取决于微丝和微管的排列方向。CA-ROP2和DN-ROP2突变体中的铺板细胞发生了显著的形状改变[20]。ROP2与ROP4拥有高度的同源性，二者在叶片铺板细胞的突起区域的顶端被激活，可以激活RIC4引起微丝的形成，促进铺板细胞的突起区域的生长；同时ROP2又在突起区域顶端抑制RIC1的功能。RIC1是植物特有的微管结合蛋白，能促进铺板细胞凹陷区微管的有序化排列，抑制该处细胞的侧向扩张，同时有序排列的微管还可反馈抑制ROP2的活性。两条途径相互拮抗，共同调控叶片铺板细胞的生长[21]。

3 ROP的调控因子及其下游效应子

ROP小G蛋白可与多个上游调控因子及下游效应子相互作用，这一点Rho类小G蛋白在酵母及动物中也同样存在。ROP互作因子的多样性使之成为重要的信号分子开关并具备多样的生物学功能[4]。

3.1 ROP的上游调控因子

已发现拟南芥中存在14个RopGEF基因，都包括一段保守的功能未知的结构域(DUF315)，以及可变的C-端和N-端。分别过表达RopGEF1、RopGEF8、RopGEF9、RopGEF12及RopGEF14，可造成不同程度的花粉管去极化生长。其中，以RopGEF1所诱导的去极化生长最为严重。另外，RopGEF1、RopGEF8、RopGEF9、RopGEF14都定位在花粉管顶端质膜上。共表达RopGEF1和DN-ROP1，可抑制RopGEF1过表达所诱导的去极化生长，说明RopGEF1在花粉管的极性生长中可能激活ROP1[22]。

GAP是一类Rho类小G蛋白的失活因子。通过酵母双杂交技术发掘出一组RopGAP。这些RopGAP都含有一段GAP的催化结构域，并且与哺乳动物中的Cdc42 GAP拥有高度的同源性[23]。体外试验证实，RopGAP可以显著促进结合在ROP上的GTP水解，但对于结合在Cdc42的GTP水解却影响不大，所以这一类RhoGAP是一类ROP特异作用的GAP。RopGAP包含一段CRIB(Cdc42/Rac-interactive binding)结构域，处于GAP结构域的上游[1]。对CRIB结构域中的关键位点进行突变，可以显著抑制RopGAP1的活性及其与ROP1的结合能力，说明RopGAP1中的CRIB结构域是促进GTP水解的关键区域。另外，CRIB结构域决定了RopGAP1在花粉管顶端质膜的定位，并且影响RopGAP1负调节因子功能的发挥[23]。

利用RopGAP4功能缺失突变体，已经证实RopGAP4负反馈调节ROP信号途径。在氧胁迫的条件下，RopGAP4功能缺失突变体中有高水平的ROP活性。同时氧胁迫下激活的ROP信号和H2O2又可以促进RopGAP4的表达，这些结果预示着RopGAP4介导了ROP的负反馈调节[24]。拟南芥基因组编码6个RopGAP基因，其同源基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中。除了保守的CRIB和GAP结构域，RopGAP的N端和C端个体间存在较大差异，说明不同的GAP可能执行不同的生物学功能[23]。

3.2 ROP的下游效应子

酵母和哺乳动物中Rho类小G蛋白可以激活多种功能不同的效应子[2]。效应子和GTP形式的小G蛋白结合，利用酵母双杂交技术分离出含有CRIB结构域的ROP效应因子，命名为RIC(Rop-interactive CRIB-containing protein)[25]。RIC优先结合有活性的小G蛋白，而不与结合GDP的小G蛋白作用。目前拟南芥中已证实有11个RIC蛋白，除了CRIB结构域外，其他部分有着较大不同。采用基因枪转化的方法将9个RIC在烟草的花粉中进行瞬时过量表达，发现RIC过量表达呈现出以下几种类型：RIC3和RIC4过量表达造成花粉管去极化生长；RIC10过量表达促进花粉管生长；RIC5过量表达抑制花粉管的生长；其他的RICs过量表达抑制花粉管的生长。另外，不同的RICs有着不同的花粉管亚细胞定位：RIC1、RIC4、ROP5、ROP6与ROP7定位于顶端质膜上；RIC2定位于顶端及亚顶端的质膜上；ROP9定位于整个质膜上；ROP10定位在细胞质中；RIC3定位在细胞质中，但在靠近顶端的区域相对集中。ROP1的过量表达对不同RIC的定位及表型的影响也不同。ROP1可以显著增强RIC4在顶端膜上的定位，但对于RIC2、RIC5及RIC9的影响则不大[25]。大部分RIC基因在多种拟南芥组织中都有表达，在其他植物中也有RIC的同源基因存在，这说明RIC蛋白作为ROP受体作用的广泛性。不同的ROP拥有不同的下游效应子，以此调控不同的细胞功能[1,7]。

4 展望

近年来，利用几种植物模型系统(花粉管、根毛或铺板细胞)在细胞信号和极性形成领域取得了一定的研究进展[1,2,26]。ROP作为植物中唯一的一类小G蛋白，通过调节细胞骨架和囊泡运输来控制细胞极性的建立，已成为植物细胞信号转导领域中重要的分子开关[3]。尽管通过酵母双杂交方法揭示了几种独特的ROP调节因子和效应子，但ROP定位及激活的分子机理仍然有待探索。另外，ROP如何控制下游效应子，进而影响植物特定的功能，也需要进一步探索。RIC作为ROP下游潜在的靶蛋白，将ROP和各种下游通路有效的整合在一起，因此发掘RIC互作蛋白对于理解ROP控制下游通路的机制具有重要作用。

钙离子对于调控花粉管的生长和导向，起着至关重要的作用[10,27]。正在生长中的花粉管顶端可以形成钙离子的浓度梯度[18,28]。ROP信号途径中存在钙离子介导的反馈调节系统，可以调节ROP的动态活性，进而影响花粉管的极性生长[7]。植物细胞中已被证实存在许多钙离子感受器，其可以感知并传递钙信号的波动。其中，钙依赖蛋白激酶(CPK)由一个激酶区域和一个类CaM区域组成，所以其既是Ca2+的感受器，又是一个效应因子[29,30]。本研究团队发现，花粉特异表达的CPK参与细胞极性信号传导，但尚不清楚是否涉及ROP的负反馈调节机制。随着遗传学工具、细胞学标记、生化与分子生物方法的不断升级，相关突出问题将会在不久的将来实现实质性的突破。