毛花猕猴桃花芽石蜡切片制作方法的改良

廖光联 刘青 钟敏 徐小彪

(江西农业大学猕猴桃研究所，江西 南昌 330045)

猕猴桃隶属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)，是观赏与食用兼备的多年生落叶藤本果树，也是20世纪野生果树人工驯化栽培最有成就的4大果树之一[1]。猕猴桃果实营养密度较高，富含大量的蛋白质、糖和氨基酸等多种有机物以及人体所必需的多种维生素及矿物质[2]，尤其以抗坏血酸的含量极高，远高于梨、苹果等，其果实还具有通便、消炎等医疗功效，颇受消费者和生产者关注[3]。目前市场上主要以鲜食为主，也有部分加工成果脯、果酒，均具有独特的风味，因此深受大众喜爱。除此之外，猕猴桃花色多样极具观赏性，具有较好的观赏价值[4]。目前，全世界共有猕猴桃属植物54个种及21个变种[5]，其中毛花猕猴桃(A.eriantha)为中国特有的猕猴桃属中的一个重要种类，广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广西、浙江、广东和贵州等地，是继中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)之后极具开发潜力的特色浆果，野生种质资源十分丰富[6]。

近几年，江西省赣南地区因黄龙病的原因，已由脐橙的单种类为主的种植模式向多种类果树的种植模式转化[7]。其中，猕猴桃是重要的种植种类之一，主要以中华猕猴桃、毛花猕猴桃及软枣猕猴桃为主。然而，目前赣南地区猕猴桃的种植存在盲目引种、品种混杂、栽培管理措施未能够因地制宜等现象。其主要原因是同一区域具有不同的气候，气候同时严重影响植株的花芽形态分化，如果不能准确把握植株的花芽形态分化时间，将对施肥等栽培管理造成极大的困扰[8]。石蜡切片是花芽分化研究中最为常用的一种技术，但传统的石蜡切片方法并不适用于猕猴桃这种多茸毛的花芽研究，尤其是毛花猕猴桃花芽，其密集的短茸毛[9]，在进行石蜡切片时会严重影响其连片效果，无法形成完整的片段，甚至出现断片、碎片等现象，以至于无法进行后期的展片、脱水、透明、封片等步骤。因此，本研究以毛花猕猴桃花芽为试验材料，在传统石蜡切片方法的基础上，结合毛花猕猴桃花芽多茸毛的特点，通过对固定、渗蜡、脱蜡及包埋等环节进行改良，探索适合毛花猕猴桃花芽石蜡切片制片的方法，以期为进一步研究赣南山区毛花猕猴桃花芽分化研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为江西省赣州市信丰县江西苌楚果业有限公司猕猴桃种质资源圃内的五年生毛花猕猴桃“赣猕6号”。采集新鲜完整的花芽，立即置于FAA固定液(90mL 50%乙醇加5mL冰醋酸加5mL福尔马林)中固定48h以上。

1.2 方法

改良后石蜡切片法的整体试验流程与传统石蜡切片流程相似，包括固定、整染与脱水、透明与渗蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡与染色、封片与显微镜观察。但改良后的石蜡切片方法需要在固定液固定花芽后进行茸毛剔除处理，同时对透明、渗蜡、染色过程进行了改良。

1.2.1 样品处理

切取其结果枝从基部数起的第5～7腋芽，放入FAA固定液中固定，迅速运回实验室进行处理，在直筒显微镜下利用解剖针剔除其表面的密集茸毛，随后放入FAA固定液中继续保存7d。

1.2.2 整染与脱水

将材料从FAA固定液中取出，蒸馏水清洗数次后用爱氏苏木精整染3～4d后倒去染液，并用蒸馏水轻荡洗1～2次，随后置于稀氨水(5%～8%)中12h。取出后按以下步骤进行脱水处理：50%酒精2h→70%酒精过夜→85%酒精2h→95%酒精2h→100%酒精2h→100%酒精2h。

1.2.3 透明与渗蜡

将材料转入1/2酒精加1/2二甲苯溶液中30min，再转入纯二甲苯中2次，每次2h。取出后按以下步骤进行渗蜡处理：1/2二甲苯加1/2石蜡4h(55℃)→纯蜡液过夜(60℃)→纯蜡液24h(60℃)。如果放入纯二甲苯中液体变浑浊，说明脱水不彻底，应立即将其转入95%乙醇中重新脱水，直至加入二甲苯时不再浑浊，透明的时间以肉眼观察样品变成透明状态为准。

1.2.4 包埋与切片

在包埋机上操作，除冷台外其余温度都不要超过60℃，最好接近但不低于石蜡熔点，提前将包埋机开好，待石蜡熔化后即可开始。包埋好的蜡块放入4℃冰箱中放置一段时间再切片效果更好。修块时，将蜡块按材料的个数分割成数小块；然后修整有材料的小块，相对的两边需平行，特别是和刀口相切的两边一定要平行，材料的边缘只留1～2mm的空白蜡；再将修好的小蜡块粘牢在台木上，以备切片用。切片时将材料夹在切片机上，并调整好切片机，然后手摇切片机将蜡块切成薄片，并使成为连续的蜡带，切片厚度为10～12μm。

1.2.5 展片与粘片

将装好蒸馏水的烧杯放入38℃水浴锅中加热，同时将粘片剂也放入水浴锅加热。将小毛笔沾水后把所需蜡带挑入蒸馏水中，切片充分展平后，用涂有一层粘片剂的载玻片将切片捞起。最后将所有粘好的载玻片统一放入40℃的恒温箱中，干燥2～3d。

1.2.6 脱蜡与染色

将烘干的载玻片放在染色架上，依次进行下列步骤：二甲苯10min→1/2二甲苯加1/2酒精10min→100%酒精10min→95%酒精10min→85%酒精10min→70%酒精10min→50%酒精10min→蒸馏水10min(若温度过低，则此操作在烘箱内进行且需延长二甲苯中的脱蜡时间)→4%铁矾15min→自来水流水洗10min→蒸馏水滴注1次→0.5%苏木精10min→自来水流水洗5min→2%铁矾分色至适度(镜检确定)→自来水流水洗15min至返蓝。

1.2.7 脱水与透明

将返蓝后的材料经滴注蒸馏水、30%、50%、70%、85%、95%的无水酒精2次，1/2无水酒精加1/2二甲苯、二甲苯2次，各级5～10min，二甲苯滴注后，置二甲苯缸中。

1.2.8 封片与观察

将透明后的载玻片取出，滴上中性树胶，缓缓盖上盖玻片，然后放置阴凉处晾干，即成永久封片。先在普通显微镜下观察，找出所需的视野，再在OLYMPUS BH-2型显微镜下进行摄影。

2 结果与分析

2.1 传统石蜡切片与改良后石蜡切片方法对比

改良后石蜡切片与传统石蜡切片相比，主要的区别集中在样品处理、脱水、透明与渗蜡、包埋与切片及染色方式，见表1。由于毛花猕猴桃花芽上附着茸毛，影响切片效果，在改良后石蜡切片方法中利用解剖针剔除其表面的密集茸毛可以提高蜡片的完整度。同时，延长了样品在脱水和透明与渗蜡过程中的时间，尽管残留部分茸毛，也不会导致切片破碎。切片厚度及苏木精染色的改良也提高了切片的效果。

表1 传统石蜡切片与改良后石蜡切片方法对比

2.2 不同固定方式对石蜡切片效果的影响

与传统石蜡切片方法相比，改良后的石蜡切片方法切出完整的组织切片效率更高，不易造成组织错位、破碎，见图1。尽管改良后的石蜡切片方法在样品处理上操作复杂，但其切片效率较高，与蜡贴合较好，在一定程度上降低了破损概率。

图1 不同样品处理后切片效果对比

2.3 传统石蜡切片与改良后石蜡切片方法效果对比

改良后石蜡切片方法组织染色效果均匀，图片清晰，细胞轮廓明显，而传统石蜡切片方法除切片不完整外，由于浸蜡及脱水时间较短，切片中易残留气孔，切片效果较差，易导致切片模糊，见图2。

图2 传统石蜡切片与改良后石蜡切片方法效果对比

3 讨论

花芽分化一般分为生理分化和形态分化2大阶段，生理分化是营养生长转向生殖生长的质变；形态分化是在生理分化质变起点的基础上，在内源物质继续作用下发育构成完整花器，完成从叶芽生长点到花芽的形态建成过程[10]。对不同气候下猕猴桃花芽分化时间的研究，有助于因地制宜地制定施肥措施，石蜡切片作为主要的研究方法显得尤为重要。毛花猕猴桃花芽上的茸毛是对花芽的一种保护，如果不对其进行处理，制片过程中，茸毛浸蜡后变得坚硬，易导致切片破损，最终难以获得理想的石蜡切片效果。改良后的石蜡切片方法在剔除茸毛后，不仅无茸毛影响，而且材料更易渗蜡，与蜡更贴合，从而获得良好的切片效果。

在剔除茸毛过程中，难免残留些茸毛，为了降低茸毛的影响，本研究中还对其它过程进行了优化，包括脱水和渗蜡等步骤。最重要的是，延长了脱水的时间，这样更有利于提高脱水效果，有效避免切片的气泡产生。此外，在延长渗蜡时间的同时，还提高了渗蜡的温度，使得材料与蜡更贴合，有效提高了切片完整性。传统的石蜡切片采用苯胺番红染色，而苯胺具有高毒性，对人体有害。参考在石榴和杏上石蜡切片方法改良[11,12]的研究后，本研究采用爱氏苏木精染色，组织轮廓染色清晰，但存在细胞核染色不清晰的现象。

在利用改良的石蜡切片进行制片时，需注意以下方面。

所有的样品都在通风橱进行处理，避免中毒；样品放入FAA固定液后，由于茸毛间张力，茸毛无法打湿，可以先用温水浸泡花芽，待茸毛湿润后放入FAA固定液中；剔除茸毛时务必小心，不要破损组织；脱水务必干净，如果有水，水会与二甲苯反应，液体变浑浊，此时应继续脱水，直至放入二甲苯中无浑浊产生；包埋后，可放入4℃冰箱2～3d，切片效果更佳；制片时要清洗载玻片和盖玻片，避免因灰尘造成阴影。