蒽酮-硫酸显色法测定白及块茎与非药用部位中白及多糖含量的比较研究

龙小琴戴应和

(1.贵州健康职业学院,贵州 铜仁 554300；2.铜仁职业技术学院,贵州 铜仁 554300)

肖培根院士提出药用植物亲缘学,认为中药存在一定的亲缘关系,在化学成分、药理作用等方面有着密切的关系[1]。在同一种药用植物不同部位的基础上开展药用部位和非药用部位中化学成分含量研究,力求寻找新的药用部位[2,3]。白及为铜仁市重点发展品牌药材之一,白及为贵州大宗药材,药用价值极高,目前研究发现,白及的主要成分为白及多糖,即白及胶,白及多糖具有活血、止血、消肿、生肌的作用,可以促进局部炎症物质吸收及局部止血,可治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等病症[4,5]。目前对白及的研究主要集中在白及块茎的化学成分和药理作用的研究,其它非药部位的研究甚少。临床上用的是白及干燥块茎,其它部位去除,并没有体现其药用价值,加重了白及的用药需求,扩大研究白及其它部位中白及胶的含量成为必然趋势。本课题就铜仁市思南产白及块茎与白及非药用部位(叶、茎秆、须根)中白及胶含量进行比较研究,采集铜仁市思南产白及植株,并挑拣白及块茎和非药用部位。采用水提醇沉法来提取白及块茎与非药用部位中白及多糖,显色剂用蒽酮-硫酸进行显色、再用紫外分光光度测白及块茎与非药用部位中白及多糖含量。力求寻找新的药用部位,为缓解临床用药需求,为铜仁白及的进一步开发利用提供参考思路,为白及新的药用部位资源研究依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

循环水式多用真空泵(SHB-ⅢS,郑州长城科工贸有限公司)；电子天平(BSM-220.4,上海卓精电子科技有限公司)；红外鼓风干燥箱(DHG-9140B,上海副絮实验室仪器设备厂)；低速离心机(TDZ5-WSD)；紫外可见分光光度计(TU-1800SPC)。

1.2 试药

D-无水葡萄糖，中国食品药品检定研究院,批号为50-99-7,浓度为100%；蒽酮，分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号为20190305；硫酸，优级纯,国药集团化学试剂有限公司,批号为20170108；试验用水为实验室自制纯化水；白及(采于贵州省铜仁市思南县许家坝镇中药材现代高效农业科技示范园区,批号为20201001、20201002、20201003、20201004、20201005、20201006)。以上药材均经铜仁职业技术学院药学院梁玉勇教授鉴定为2015版《中华人民共和国药典》中兰科植物中的药用白及[Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.]植株[6]。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 蒽酮-硫酸溶液配制[7]

精密称取蒽酮0.2011g,置于容器中,用80%的硫酸溶液溶解至100mL,摇匀,配好的0.2%蒽酮-硫酸溶液用棕色瓶保存。

2.1.2 对照品溶液[7]

用电子天平精密称取D-无水葡萄糖对照品0.0334g,装到100mL的容量瓶中,用蒸馏水进行溶解,并稀释至刻度,进行摇匀,即得。以100%计,对照品的浓度为0.334mg·mL-1。

2.1.3 供试品溶液的制备[8]

取经60℃干燥至恒重的白及块茎和非药用部位(叶、茎秆、须根),用研钵分别碾碎成粉末状,分别放入编号的离心管中,再置于干燥器中保存。分别精密称取样品粉末1.0g,放入圆底烧瓶中,精密加蒸馏水50.0mL,进行称重,放入用电套,加热回流1h(保持微沸),放冷,用蒸馏水补重,摇匀,滤过。用移液管精密量取5.0mL续滤液,加入30mL无水乙醇,进行摇匀,放置3h,以3500r·min-1离心15min,离心后将上清液倒去,沉淀用适量热蒸馏水溶解,放冷,置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,即得。

2.1.4 多糖含量测定[8,9]

精密量取1mL供试品溶液,置于10mL试管中,加蒸馏水稀释到2mL,精密加入0.2%蒽酮-硫酸试液4.5mL显色；同时取蒸馏水2mL,置于10mL试管中,以加入0.2%蒽酮-硫酸试液4.5mL作为空白,置于紫外-可见分光光度计上在625nm波长处检测,记录吸光度。采用标准曲线法计算白及多糖的含量。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液分别为0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,置于10mL刻度试管中,各加蒸馏水至2.0mL,摇匀,另取2.0mL蒸馏水作为空白对照。将刻度试管置于冰水浴中,精密加入显色剂0.2%蒽酮-硫酸试液4.5mL,混匀,置于沸水浴中3min进行加热,立即取出置于流水中冷却10min,以对照品溶液浓度为零的试液为空白。在625nm波长处测定吸光度,以吸光度(y)为纵坐标、质量浓度为横坐标(x),绘制标准曲线。线性回归方程y=3.5189x-0.0108,R2=0.999,结果表明,D-无水葡萄糖质量浓度在5.13～51.38μg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.2 精密度试验

取1.0mL标准品溶液,加蒸馏水稀释到2mL,按“2.1.3”中方法连续测定6次。结果显示,所测吸光度的RSD为0.08%,表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

分别取己配置好样品溶液、D-无水葡萄糖对照品溶液各1mL,按照“2.1.3”中方法显色,以相应试剂做空白,分别于0～3h内每30min测定1次吸光度值,结果显示,所测吸光度的RSD分别为0.82%和1.35%,表明样品和对照品溶液在3h内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验

取同一批次的白及样品6份,按样品溶液制备项下方法制备样品溶液,精密量取1mL样品溶液,按照“2.1.3”中方法进行显色,测定吸光度值。结果显示,多糖含量的RSD为2.48%,说明方法重复性好。

2.2.5 加样回收率试验

取经60℃干燥至恒重的白及块茎和非药用部位,用研钵分别碾碎成粉末状,放入离心管中编号保存在干燥器中。精密称取粉末1.0g,放入圆底烧瓶中,精密加蒸馏水50.0mL,进行称重,放入用电套,加热回流1h(保持微沸),放冷,用蒸馏水补重,摇匀,过滤。用移液管精密量取5.0mL过滤液,加入30mL无水乙醇,进行摇匀,放置3h,以3500r·min-1离心15min,离心后将上清液倒去,沉淀在60℃条件下真空干燥,精密称取样品0.0501g,沉淀用热蒸馏水溶解,放冷,置250mL量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,即质量浓度均为0.20mg·mL-1,摇匀,备用。精密吸取等量的7份样品溶液,其中6份加入不等量标准溶液,按照“2.1.3”中方法测定其吸光度值,代入线性回归方程,确定白及多糖的量,根据不加标准溶液的样品溶液的吸光度值,确定样品中白及多糖的量,结果见表1。求得平均回收率为98.66%,RSD=1.40%。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.3 样品含量测定

表2含量测定结果表明,块茎的白及多糖含量35.12%、须根的白及多糖含量28.82%、茎秆的白及多糖含量20.93%、叶的白及多糖含量16.15%。多糖含量由高到低依次为须根>茎秆>叶。白及块茎和非药用部位多糖含量存在一定差异。

表2 多糖含量测定结果(x±s,n=6)

3 讨论

在供试品提取方法的选择时,采用稀乙醇去除杂质后再用水提的方法以及用水提取后再用醇沉淀的方法测定白及多糖含量,结果发现，这2种方法测定结果差异不大,但是稀乙醇去除杂质后再用水提的方法过滤时间太长,有部分含量损失,用水提取后再用醇沉淀的方法操作简便,故选择水提醇沉法。目前有文献研究证实苯酚-浓硫酸显色法存在毒性较大,容易氧化,需纯化处理才能进行实验,操作复杂,并且在测定样品测定结果时重复性较差；而蒽酮-硫酸显色法测定结果时重复性较好,且操作比较简便,因此选择蒽酮-硫酸显色法进行白及多糖含量测定[10,11]。研究结果显示,块茎的白及多糖含量35.12%、须根的白及多糖含量28.82%、茎秆的白及多糖含量20.93%、叶的白及多糖含量16.15%,多糖含量由高到低依次为须根>茎秆>叶。白及块茎和非药用部位(叶、茎秆、须根)多糖含量存在一定差异,可以进一步优化白及多糖的纯化方法,为有效提高白及非药用部位的利用,以及白及新的药用部位资源进一步研究提供参考。