番茄PHT1家族磷转运蛋白研究进展

张琳淳 李越 沈锦纯 赵竑博

(华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642)

磷(Phosphorus,P)是植物体整个代谢进程中的重要化学物质，参与多个植物的生命活动。由于无机物固定、有机络合物的形成以及营养物质在土壤中扩散速度缓慢等问题，磷成为世界范围内最难获得的植物养分之一[1]。植物在发展变化过程中逐步进化出几种机制来改善缺磷造成的影响，其中包括植物地下部形态改变、根周土壤化学性质的改变、AM真菌的定殖以及激活高亲和力无机磷的转运[2]。

植物磷转运蛋白(Phosphate transporter)是控制植物吸收和转运磷酸盐的重要膜蛋白，存在于植物的线粒体膜、质膜和质体膜中[3]。植物磷转运蛋白的长度为1500～1800bp，编码氨基酸个数为500～600，对磷的吸收和利用起重要作用[3]。当植物处于低磷环境中，植物会通过改变地下部形态、调控外源激素、诱导菌根以及诱导高亲和力磷转运蛋白(PTs，Phosphotransferase)等途径来增强植物对磷的获取[4]。

在众多茄科植物中，番茄(Lycopersicon esculentum Mill)在全国乃至全球范围内普遍栽种，是我国重要的蔬菜之一，也是在生物学和遗传学方面用于研究肉质浆果发育的模式植物[5]。缺磷时，番茄植物的生长发育受到严重影响，植株矮化以及出现黄化等症状，对番茄的产量带来严重的影响[6,7]。因此，为了提高番茄的产量与质量就必须提高番茄植株对磷元素的吸收与转运能力。近几年，随着植物高效吸收磷素营养的分子机制和基因资源的探究逐渐成为热点，番茄磷转运蛋白相关研究也逐渐白热化，这为更好地揭示和应用番茄磷转运蛋白家族相关基因提供了生物学基础。本文综述了番茄磷转运蛋白PHT1家族基因对番茄磷吸收和转运的研究进展，并对未来番茄PHT1研究的发展方向提出了展望。

1 磷在番茄生长发育中的作用

1.1 番茄缺磷症状

在番茄植株生长早期，植株处于低磷条件下时，可以观察到番茄叶背开始出现紫红色，花青素聚集，而在光合作用下叶片出现了暗绿或灰绿色，叶面积减少，叶片表面无光泽，叶肉组织呈现斑点状[7-10]。随着缺磷时间的增长，缺磷症状越强烈，威胁番茄植株茎叶的生长发育，主根生长缓慢，侧根明显增多，植株茎部积累花青素，叶脉、叶柄及叶簇都呈现紫红色[11,12]。番茄植株在缺磷时也会影响到氮素的吸收，导致植株叶片卷曲，老叶片逐渐变黄，茎部变得细小[13]。

1.2 番茄对低磷环境的适应

为了减少低磷造成的伤害，植物在其生长发育的过程中会形成不同的机制来进行调控[14]。磷缺乏时，植物通过增加地下部H+和有机酸含量以及增强高亲和性无机磷转运体基因表达等来应对磷胁迫，同时，也会造成植物体内蛋白质含量下降，细胞分裂分化减慢，形态和生理生化变化缓慢，影响植物产量[15,16]。

番茄在低磷胁迫下，植株根长显著减小，其根的总面积和总体积也呈现出下降趋势，根毛数量和密度却增加，以此来增强植株对磷的吸收[17,18]。有研究表明，磷缺乏会改变番茄地上部与地下部之间的碳水化合物分布，从而促进根系的生长和植物对磷酸盐的吸收[19]。由于低磷环境会造成植物除根毛以外的根系与土壤中的菌根真菌相互作用形成有益的共生体-菌根(Vesicular-arbuscular mycorrhiza，简称VA菌根)[20]。目前在番茄上发现，低磷胁迫造成番茄相关基因受到了菌根系统的诱导表达[21]。

2 磷转运蛋白

2.1 磷转运蛋白的分类

根据对磷的亲和力大小将磷转运蛋白分为以下2类，高亲和力磷转运蛋白和低亲和力磷转运蛋白[22,23]。再进一步细分为新型的磷转运蛋白基因PHO1家族(Phosphate1)、高亲和力的磷转运蛋白基因PHT1家族(Phosphate Transporter1)、低亲和力的磷转运蛋白基因PHT2家族(Phosphate Transporter2)和少量PHT3(Phosphate Transporter3)、PHT4(Phosphate Transporter4)、PHO2基因(Phosphate2)的其它基因家族这4大类[24]。

2.2 磷转运蛋白的功能

磷转运蛋白的类型不同，其所处位置和功能也不同，绝大部分的磷转运蛋白在植物的根系中表达，被认为与磷的吸收有关，小部分在植物的其它部位表达，被认为与磷的转运有关。PHO1家族主要位于根的维管柱和下胚轴等部位，负责木质部中磷酸转运体信号调控[25,26]；PHT1家族主要位于植物根系的细胞质膜上，负责植物根系无机磷的吸收和转运[27]；PHT2家族位于植物质体膜上，负责无机磷向载体的转移和代谢[28]；PHO2编码的蛋白负责通过韧皮部将磷从芽向根运输；PHT3编码的蛋白位于线粒体膜，负责线粒体的无机磷进行交换代谢；PHT4编码的蛋白位于质体和高尔基体中，在光照和昼夜变化条件下，调控基因影响磷代谢[24,29-32]。总结上述家族相关研究参照Ticconi和Abel等，得出磷转运蛋白家族的作用区域如图1所示[33]。

图1 几种磷转运蛋白家族的作用区域

2.3 PHT1家族磷转运蛋白结构特征

现阶段，已检测到的植物PHT1家族磷转运蛋白家族成员均为膜蛋白。大多数具有相似的蛋白序列和化学结构，这些膜蛋白的大小均在58KD左右，其中含有的氨基酸残基个数约为500[34]。高亲和力的磷转运蛋白PHT1家族一般具有12个亲脂的疏水跨膜结构域(TM)，这12个TM中每个结构域含有20个左右的氨基酸残基，均匀地分布在细胞质蛋白的N端和C端，亲水性大环坐落于第6和第7个结构域之间，将12个TM划分为2组，在二级结构中组成6个结构域-环-6个结构域“6-环-6”的结构[35]。第1次被克隆并报道的酵母磷转运体Pho84距今已经30a[36]。研究表明，随着酵母转运体Pho84的同源物和编码无机磷活性的蛋白基因在多种植物中逐渐被发现并鉴定，大多数植物的PHT1家族磷转运蛋白是根据酵母磷转运体Pho84序列进行克隆的[37,38]。磷转运体Pho84具有PHT1家族磷转运蛋白的全部结构特征，可以认为是PHT1家族磷转运蛋白模型。

3 番茄PHT1家族磷转运蛋白研究进展

3.1 番茄PHT1家族磷转运蛋白在不同组织中的表达分析

通过对已发布的番茄基因组序列数据库进行广泛搜索，目前共鉴定出8个PHT1家族基因(LePT1～LePT8)，分布在3条不同的染色体(3、6和9)上[39]。染色体组织和系统发育树分析表明如图2，将8个番茄PHT1家族基因划分为LePT1/3/7、LePT2/6和LePT4/5/8这3对，其物理距离非常近，是由茄科与其它双子叶植物科分裂后发生的串联重复事件产生的[40]。这些PHT1成员的表达分析表明，除了LePT8在所有组织中都无法检测到转录本外，其它7个类似物表现出差异但部分重叠的表达模式[5]。

图2 番茄(T)染色体上PHT1基因(LePT1～8)的分布

对番茄植株的表达模式进行分析，分析发现PHT1家族转运蛋白的表达受外部磷供应和叶、根组织类型的影响[41]。LePT1在所有的组织中普遍表达，如根皮层细胞、叶片维管束、叶片、茎及花等器官中，当低磷胁迫时，其转录本被大量诱导[23,28,35,42,43]。编码序列相同的LePT2和LePT6主要在缺磷根中表达，在磷供给充足的情况下LePT2基因不表达，在较老的植物根部体内的表达量高于鲜嫩的植物根部[6,45,46]。在低磷胁迫下，丛枝菌根真菌对LePT3～LePT5的活性较强，而高磷胁迫下，丛枝菌根真菌对LePT3～LePT5的活性较弱，均不表达[47,48]。早期研究表明，大部分PHT1基因都集中在根部表达，特别是在根表皮和根毛中表达，表明这些基因在磷缺乏时可能在无机磷的捕获和调控中发挥作用摄取[23,49]。郭珑辉利用遗传转化方法，将番茄的PHT1家族基因LePT1转化进拟南芥中，通过高磷、低磷研究证实，PHT1家族基因LePT1启动子在番茄植株根部活性较强[5]。张传玲运用VIGS技术构建番茄VIGS载体，对番茄LePT1～LePT8这8个基因的序列及其表达模式进行研究，结果表明，在低磷条件下，LePT1基因表达量上调，总根长、总根面积和总根数等根系结构发生改变，植物根与土壤的接触变得更加紧密，接触面积增大，有利于土壤对磷的吸收[39]。洪帅利用分子克隆技术，将番茄PHT1家族基因LePT1和LePT2利用农杆菌介导入水稻中，对LePT1和LePT2进行功能探究，结果表明，当植株磷供应不足时，水稻根系和水稻叶肉细胞中的LePT1和LePT2表达量上调，增强水稻植株地上部分对磷元素的吸收，株高和生物量呈上升趋势；然而，当磷供应过量时，在LePT1和LePT2的过度表达会抑制水稻植株的发育，引起植株发育缓慢，株高降和分蘖数减少[45]。

3.2 番茄PHT1家族磷转运蛋白在不同磷浓度下对AMF定殖的响应

在整个大自然中，大部分维管植物都与丛枝菌根AM真菌(AMF)共生，通过编码蛋白质对磷运输进行调控[50]。AM真菌(Glomusintraradices)定殖于植物的根皮质细胞中，AM真菌对磷吸收能力的大小取决于植物与真菌的组合，利用植物的菌丝从根消耗的土壤区外吸收无机磷[51,52]。

AM真菌的定殖不仅增加了低磷条件下番茄植株的生物量，还增加了磷浓度；然而在高磷条件下，定殖植株和非定殖植株的生物量和磷浓度却没有显著差异[53,54]。RT-PCR分析表明，只有LePT3、LePT4和LePT5这3个同源基因转录本可在低磷条件下在接种的根中表达增强或特异性激活，其中LePT4在AMF定殖的皮层细胞中表达；LePT8在任何处理下都不能在2种组织中表达；其余4个同源基因的表达均不明显，在高磷条件下，LePT1、LePT2、LePT6和LePT7的转录本被显著抑制[55,56]。在高磷条件下，无论是否有AM定殖，LePT2和LePT7在根和叶组织中的转录本都急剧减少甚至完全缺失，这种下调的情况在2个平行基因LePT2和LePT7上更为明显[50]。在AMF定殖和高磷条件下，LePT1、LePT2、LePT6和LePT7这4个成员的转录本显著下调可能是由于处理后番茄植株中磷浓度的显著增加引起的[47]。尽管LePT2和LePT6因其编码序列相同而被认为是番茄PHT1家族中最接近的相关基因，但在低磷条件下，LePT6对AM共生反应的下调幅度远小于LePT2[47]。这种表达水平上的差异强烈表明，在1个相对较新的复制事件中产生的2个平行序列之后，控制LePT2和LePT6激活或抑制的调控成分发生了差异[47]。

研究表明，番茄PHT1基因在AM共生或不同磷浓度下存在特异表现且存在特殊的启动子元件如MYCS和P1BS，这2个磷调控元件能激活菌根并诱导PHT1转运蛋白基因的转录。当这2个磷调控元件中的任何1个元件缺失或突变时，就会导致启动子活性的降低甚至丧失[57]。2个磷调节元件(P1BS和W-box)和1个AM反应顺势元件(MYCS)的数量和定位在这8个PHT1基因的启动子区域中差异很大，即使一些同源基因的编码序列和表达谱高度保守[58,59]。然而，与其它双子叶植物中AM诱导的PHT1基因类似，发现MYCS基序仅存在于3个AM激活的PHT1同源物LePT3、LePT4和LePT5的假定启动子区域中，并且与磷调节的P1BS元件非常接近[47,60]。

3.3 番茄PHT1家族基因的生物学功能

3.3.1 参与番茄磷元素的吸收和转运

PHT1家族基因作为功能基因参与番茄对磷的吸收和转运。大多数的PHT1基因在根部的根毛和根表皮上表达，参与磷元素的吸收，在植物的其它部位参与磷元素的转运。在运输过程中，番茄PHT1家族基因体现出不同的转运功能，如磷酸盐在根冠处的转运、源端到库端磷酸盐的转运和从外界环境摄取磷酸盐等功能[61,62]。

在自然条件下，植物磷的吸收是通过一个依赖能量的磷酸质子共生系统进行的。当磷缺乏时，植物会通过别的方式来增加磷的吸收。番茄基因表达的研究结果表明，LePT1和LePT2的转录本在磷缺乏的条件下被高度诱导[63]。在番茄缺磷一段时间后，增加的磷吸收被认为与根对磷转运的能力更高有关，也可能是通过形成额外的磷载体[45]。磷转运蛋白的转录调控和定位直接或间接地调控着磷的获得，对番茄植株在低磷条件下动态平衡起着重要作用。Muneer等人对低磷胁迫下番茄叶片中的LePT1和LePT2转录物进行原位定位，以获得有关叶片中磷酸转运蛋白的组织特异性表达的信息；在表皮和栅栏组织中观察到LePT1和LePT2转录物的信号，说明LePT1和LePT2主要存在于叶片的表皮和栅栏组织中；然而，缺磷处理时，番茄叶片表皮的LePT1和LePT2比栅栏组织的表达量高，说明LePT1和LePT2参与了磷的吸收和转运[5,63]。

3.3.2 对番茄抗性的影响

在番茄抗性方面，张殊慧运用基因枪法将番茄中线粒体磷转运蛋白LePT3基因克隆进冬小麦中，将冬小麦分别处于不同的磷处理条件下。通过观察分析可知，在番茄磷转运蛋白LePT3基因的调控下，冬小麦缺磷时，小麦根系结构发生改变，根系活性、酸性磷酸酶活性和小麦光合能力均发生改变，呈现上升趋势；番茄线粒体磷转运蛋白LePT3基因在磷转运调控中起重要作用。当磷充足时，转基因小麦的根系结构也会发生变化。在番茄磷转运蛋白LePT3基因的调控下，将促进转基因小麦养分的运输[64]。郭珑辉等人将番茄高亲和磷转运蛋白LePT1基因进行克隆，在拟南芥突变体中进行互补表达研究其功能特性，发现缺磷培养和正常培养条件下，转基因植株比拟南芥突变体的根部有效浓度略高[5]。

3.3.3 影响植物生长发育

由于无机磷的毒性，磷转运蛋白在提高植物生长和产量方面会呈现出消极作用[65]。番茄PHT1家族基因的表达对植物生物生长发育的影响可能通过以下2条途径，影响磷元素的摄取和影响植物所需的其它营养元素合成。如，miR399在拟南芥和番茄中的过度表达导致了磷毒性和生长迟缓[66,67]。张传玲借助VIGS技术沉默番茄LePT1基因发现在正常磷处理中，LePT1、WT、TRV植株在根、茎、叶中全磷含量以及在其它表观性状上均无显著差异，但是LePT1基因沉默植株的总根面积与对照植株相比明显偏小。在低磷胁迫环境中，LePT1基因沉默植株生物量、全磷含量、总根长、总根面积都显著低于对照植株，说明LePT1基因的沉默限制了番茄植株的生长发育[39]。

4 总结和展望

我国番茄的种植面积高居世界各国种植面积前列，具有良好的发展前景。栽培生产中，番茄难以吸收利用土壤中有效磷元素以及缺磷胁迫严重影响番茄的产量与品质[11]。在分子信息的时代背景下，利用基因工程等现代分子育种技术对作物进行改良或选育，培育出能高效吸收和利用磷元素的作物弥补农业生产中磷元素缺乏限制的重要手段。

目前，尽管对番茄PHT1家族基因有了一定的研究，然而，在番茄中发现的8个PHT1家族基因，多集中在LePT1和LePT2基因的研究上，对LePT3～LePT8基因的研究较少，需补充更多的研究。关于组织表达模式的分析也集中于LePT1和LePT2基因的研究上，对LePT3～LePT8基因的表达研究不够深入，特别是LePT8基因，其在所有植物组织中还没有找到转录本。在与AM真菌的协作中，LePT8基因依旧在组织中检测不到，由于AM真菌的定殖，番茄植株的生物量在低磷条件下呈增长趋势，对土壤中的磷浓度也有所提升；在高磷条件下，部分基因成员转录本呈直线下降趋势。说明AM真菌的定殖对低磷条件下番茄植株的生长起到了积极调控作用，但是AM真菌的具体调控机制尚未明晰，还有待研究。

虽然番茄PHT1家族基因具有各自的生物学功能，并且对其功能也有所了解，如番茄PHT1家族基因可调控磷元素的吸收和转运、影响植物抗性和对植物生长发育产生影响等，但是基因与基因之间的交互作用还不清楚；还有大部分PHT1家族基因成员的磷转运机制需要阐明；磷的动态平衡与再分配也需要进行深层次的研究发掘其本质。这些对磷吸收和转运效率的提高有着重要的意义，对未来解决缺磷胁迫下如何提高番茄的产量和质量这一问题指明了方向。