西藏高原青稞中真菌毒素高效液相色谱串联质谱法检测技术研究

张一帆 魏娜 张飞龙

摘 要：研究建立高效液相色谱-串联质谱联用技术检测青稞中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素（FB1）9种生物毒素的方法。样品采用酸化乙腈溶液提取，以2mmol/L（含0.1%甲酸）乙酸铵-甲醇（70：30，V/V）为流动相，采用正负离子模式对9种毒素进行检测。结果回收率在78.6%～113.6%之间。该方法准确性好、灵敏度高、抗干扰能力强，能满足我国食品安全标准的相关要求。

关键词：青稞；液质联用；真菌毒素；多组分检测

中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180631002

真菌毒素是由曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）等真菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染谷物、食品以及饲料等，可致癌、致畸、致突变，威胁人畜健康[1]。目前，已发现超过400种真菌毒素，其中黄曲霉毒素（Aflatoxins， AFT）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol， DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A， OTA）、伏马毒素（fumonisin， FB）、T-2毒素等是污染谷物的主要真菌毒素，可发生在作物田间生长阶段或收获后储藏阶段[2，3]。

目前国内外检测真菌毒素的方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等方法，其中HPLC是国际上检测真菌毒素最常用的方法[4]。随着现代分析仪器的发展，液质联用技术广泛用于玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、伏马菌素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素检测 [5-9]。粮食中真菌毒素污染形式往往是多种真菌毒素的共同污染，但目前采用液质联用检测真菌毒素的方法多为单组分检测或同类毒素检测。液质联用采用选择离子监测技术，可大大提高检测的灵敏度和特异性，前处理技术可比传统方法更为简便，是同时检测多种真菌毒素的理想方法。为此本研究利用液相色谱、三重四级杆质谱仪联用对粮食中多种真菌毒素的检测技术进行研究，旨在建立多组分准确、灵敏真菌毒素检测技术方法，准确甄别、掌控粮食中真菌毒素的含量水平，为粮食安全监测与评估、食品安全有效监管工作提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

色谱纯乙腈、色谱纯甲醇、色谱纯甲酸、分析纯冰乙酸。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、OTA、FB1、T-2毒素母液从ROMER公司采购，母液浓度分别为2mg/kg、0.5mg/kg、2mg/kg、0.5mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、10mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，在-20℃避光下保存，有效期6个月。

1.2 仪器与设备

配有电喷雾（ESI）离子源的高效液相色谱-串联质谱联用仪、涡旋混合器、高速离心机、摇床、旋转蒸发仪、超声波清洗仪、资生堂C18色谱柱。

1.3 测定方法

1.3.1 色谱条件

资生堂C18色谱柱（MGⅢ-H，100 mm?2.1 mm， 3μm），柱温为30 ℃，进样量为1μL，流动相A为2mmol/L（含 0.1%甲酸）乙酸铵，B为乙腈（含 0.1% 甲酸）；梯度洗脱程序见表1。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正离子模式和负离子模式。选择反应监测（SRM），喷雾电压为5500V，鞘气为60psi，辅气为55psi，离子源温度为550℃。

1.4 样品前处理方法

1.4.1 样品提取

准确称取均质后的样品 5.00g（精确到0.02g）于50mL具塞聚丙烯塑料离心管中，加入10mL水充分浸潤之后，再加入10mL的10：90 甲酸/乙腈，充分振荡，旋涡。将离心管平置放入摇床，室温下摇床1h。加入 QuEChERS 盐包，用手大力振荡离心管 1min，在8800转/min的速度下，离心5min，取上清液过玻璃微纤维滤纸过滤，收集滤液。

1.4.2 样品净化

准备 PRi MEHLB 小柱（6cc，200mg），无需活化平衡，吸取1mL样品滤液直接加入SPE小柱，待流干后加入0.5mL乙腈洗脱，吹干，收集全部流出液。

1.4.3 溶剂转换

流出液在40℃下氮气吹至近干，乙腈水溶液（1：1）定容到 1mL，过0.22μm有机滤膜，上LC-MS/MS 测试。

1.4.4 标准工作曲线制作

分别吸取不同体积真菌毒素标准母液，逐级稀释，用乙腈至刻度线，配制成浓度为含AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA为100μg/kg；含T-2、DON、FB1、ZEN为500μg/kg的混合标准储备液后，再用乙腈，分别稀释配制出6个混合标准工作溶液点，避光 -20℃下保存，有效期7d。

分别吸取混合标准工作液，5μL、10μL、50μL、100μL、250μL、500μL、1000μL并用50%甲醇溶液（4.6）定容至1mL进样小瓶中，AFB1、AFB2 、AFG1、AFG2、OTA上机浓度分别为0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg，FB1、T-2、ZEN、DON上机浓度分别为2.5μg/kg、5μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、125μg/kg、250μg/kg、500μg/kg，上机，绘制标准工作曲线。

2 结果与分析

2.1 色谱条件与质谱条件的选择

2.1.1 色谱条件的选择

采用MGⅢ-H（100 mm，2.1 mm，3μm）资生堂C18色譜柱对标准品进行分离，当流动相为2mmol/L（含 0.1% 甲酸）乙酸铵溶液-甲醇体积配比为70：30的时候响应值最好。

2.1.2 质谱条件的选择

根据不同真菌毒素的分子质量和分子结构，选择电喷雾离子源正负离子扫描模式注射进样，对去簇电压（DP）、射入电压（EP）、碰撞电压（CE）、碰撞室射出电压（CXP）等条件进行优化，分别得出不同真菌毒素母离子、子离子和碰撞能量，见表2。

2.2 加标回收率

分别称取3份样品，每份5.00g，分别加入混合标准工作液50μL（上机浓度分别为5μg/kg或25μg/kg），按样品预处理的方法进行提取和净化后，高效液相色谱-串联质谱进行测定，结果详见表3。

2.3 方法精密度

在选定的色谱条件下，在同一天内连续5次测定混合标准溶液，每次20μL，测定各组分的峰面积，计算日内精密度。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、FB1、T-2、ZEN、DON的RSD分别为1.4%、2.5%、2.8%、3.1%、4.1%、3.6%、2.3%、1.8%、2.6%。连续5d分别测定混合标准溶液，每次20μL，测定各组分的峰面积，计算日间精密度。各真菌毒素的RSD为 3.3%～8.4%。

3 结论

本方法前处理过程简单，检测结果准确可靠，该方法可以一次性分析黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、OTA、FB1、T-2、ZEN等9种真菌毒素，灵敏度、稳定性能满足我国食品安全标准的相关要求，为高原粮食中多种真菌毒素的污染定性和定量提供参考依据。

参考文献

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作者简介：魏娜（1983-），女，副研究员，研究方向：农业质量安全与标准研究。