福寿螺在甲氨基阿维菌素影响下的酶活性研究

摘 要：本文主要研究甲氨基阿维菌素对福寿螺酶活性影响，以几组对照试验分析甲氨基阿维菌素对福寿螺的作用机理及影响，旨在为研究福寿螺的防控措施及高效安全的杀螺剂提供依据及帮助。

关键词：福寿螺；甲氨基阿维菌素；影响；酶活性

中图分类号：S482.3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161233025

近几十年来，福寿螺在我国多个省份迅速蔓延，严重的影响农产品的质量与产量，并且由于福寿螺是广州管圆线虫的寄宿主之一，一旦人类感染常会引起急性头痛、发热、四肢无力、皮肤过敏等症状，严重者可致痴呆或者死亡。

1 实验准备

按标准参照傅先元的分级标准，选取成螺个体重量为151.5g，在相同条件下进行试验预处理，之后再分别进行对照实验。

浸螺法进行毒力测定：称取一定量的90.2%甲氨基阿维菌素原药，用丙酮溶解后配置成母液，加水稀释，成螺的处理浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg/L，均设清水为对照处理，每个浓度重复3次。用小桶（8.75cm×8.75cm×16.5cm）盛500mL药液和清水，每桶投螺15只。在25±1℃的恒温室浸泡福寿螺，隔6h观察福寿螺的行为，分别于24h、48h统计死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

酶液提取：采用浸螺方法对成螺进行毒力测定，用DPS 6.55软件建立毒力回归方程，并设置LC25、LC50、LC75 3个质量浓度和空白对照，试验开始后，分别于6h、12h、24h、48h取样。快速称取1 g肝脏置于研钵中，用剪刀剪碎，加入一定量的液氮后快速研磨，分别加入相应的试剂检测各种酶含量。

1.1 实验方法

1.1.1 谷胱甘肽S一转移酶（GSTs）活性测定

用移液枪依次加入4x10-3mol/L CDNB 50?L、13.33mmol/L GSH60?L、50?L酶液、0.06 mol/L pH7.0磷酸缓冲液90?L于96孔酶标板中，总体积为250?L，反应条件于26℃下，用酶标仪在340nm波长下测定其吸光度值。每30 S读数1次，共记录15min内OD值变化。对照孔中加入50?L磷酸缓冲液代替酶源液，其他参数一样。GSTs单位定义：lmg组织中lmin催化分解1?mol底物为1个酶活力单位（U）。以反应速度表示GSTs酶活性（OD/mg pr./min）。

1.1.2 乙酰胆碱酯酶（ACHE）活性测定

用移液枪准确地移取150?L酶源上清液和50?L 0.1mol/LPH8.0的磷酸缓冲液于96孔酶标板中，然后依次加入0.01 mol/L二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）溶液50?L、O.075 mol/L碘化硫代乙酰胆碱ATchI溶液50?L，在酶标仪测定下405nm波长测定其吸光度值。该反应于26℃15min内（30s为间隔）的OD值变化。以磷酸缓冲液作为空白对照，以反应速度表示乙酰胆碱酯酶活性（OD/mg pr./min）。

1.1.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

邻苯三酚自氧化速率测定：依次加入0.1mol/L Tfis.Hcl 4.5ml缓冲液、4.2 mL二次蒸馏水，对照管加入10 mmol/L0.3mLHcl，样品管加入2.5mmol/L0.3mL邻苯三酚，总体积为9mL。置于倾入光径lcm比色杯中并计时，于325nm波长下测定吸光度值A0，30s读数1次，共记录5min内的吸光度值，并以时间、吸光度值作坐标图，邻苯三酚的自氧化速率AA0是用该线性方程的直线斜率表示。每次测定重复4次，确保实验结果的准确性。

此操作方法同上，但在加入邻苯三酚之前，一定先加入300?L的酶源上清液。并减少加入二次蒸馏水确保蒸馏水一样。迅速倒入1cm比色皿中，以0.01mol/L HCl缓冲液为参比，于325nnl波长下测定吸光度，每隔0.5min 计数，连续测定5 min。邻苯三酚自氧化速率测定用蒸馏水代替酶源上清液。每次实验重复4次，记录该曲线的斜率即为△ASOD.SOD酶活力单位定义为在25℃、pH 8.2时每1 min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量。

邻苯三酚自氧化的抑制率定义为：

抑制率（E）=（△A0--△ASOD）/△A0×100%；

单位酶活力（U/mL）=（E×V1×N）/（50%×V2）；

SOD活力（U/mg）=单位活力/测定样品浓度；

（E：邻苯三酚自氧化的抑制率；V1：反应液总体积；V2：测定样品体积；N：样品稀释液的倍数）

酶活的抑制率（%）=[（对照组的酶活力一受试组的酶活力）/对照组的酶活力]×100。

1.1.4 酚氧化酶（PO）活性测定

采用磷酸钠盐缓冲体系，在2mL的测活体系（含0.1mol/LpH6.8的Na2HP04—NaH2P04缓冲液和8mmol/L邻苯二酚中加入200?L酶源上清液，28℃检测波长为430nm处的吸光度值，并以时间、吸光度值作坐标图，酚氧化酶活力用所得的直线斜率来表示。在27℃时每l min增加吸光度值l?的酶量为PO酶活力单位（u）。PO酶量（U/g）通常以1g组织中所含的u的量来表示，每次测定重复3次，取平均值，确保实验结果的准确性。

1.1.5 过氧化氢酶（CAT）活性测定

在恒温25℃条件下，将CAT酶提取液加H202-磷酸盐缓冲液中，采用1cm比色皿在250nm波长处每隔10 S测其吸光度数值。以常温下100 S分解过氧化氢一半时的酶蛋白量作为过氧化氢酶活性单位。

2 甲氨基阿维菌素对福寿螺主要酶活性实验结果分析

处理12h内，甲氨基阿维菌素低（LC25）、中（LC50）浓度对成螺肝脏内GSTs和AChE酶活力均高于对照组，12h达到高峰后开始持续下降并在48h低于对照水平（P<0.01），除低浓度（LC25）组成螺肝脏AChE酶活力仍高于对照组水平。

甲氨基阿维菌素中、高浓度组对成螺肝脏PO酶活力在6h时达到最大值，之后逐渐下降，至48h时其极显著低于对照组水平。

在不同药剂浓度处理下，福寿螺肝脏CAT活性总体表现为上升—下降的趋势。随着时间的延长，福寿螺肝脏内CAT酶活力逐渐降低，在48h时下降至最低值，并与对照组差异显著。

甲氨基阿维菌素低浓度（LC25）组的福寿螺肝脏SOD酶活力变化不大，其在长时间（48h）的染毒下，较对照组仍差异不显著：中（LC50）浓度组的福寿螺肝脏内的酶活力在24h达到最大值，48h其酶活力才被显著抑制；而高（LC75）浓度组的SOD酶活性比低（LC25、LC50）浓度组在更快的时间（6h）达到高峰，之后就开始持续下降并在24h时被极显著抑制。因此，SOD的上升与下降反映了福寿螺抵抗甲氨基阿维菌素的能力。

3 结语

根据实验可以得出，在不同的处理时间（6、12、24、48h）内，不同浓度的甲氨基阿维菌素对福寿螺的解毒酶、抗氧化酶等酶活性的影响程度不同。在胁迫期间，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等活力变化，是在一定的剂量范围或者时间段内体现出的剂量和时间效应，酶活力受毒物剂量的影响，当浓度较低时，毒物对代谢有一定的促进作用，各浓度组福寿螺肝脏CAT酶、SOD酶、PO酶等活力均呈现先上升后下降的变化趋势。

参考文献

[1]黄秀枝，蔡瑷安，尚战峰，等.甲氨基阿维菌素胁迫下福寿螺肝脏抗氧化酶活性及显微结构的变化[J].江蘇农业学报，2015（3）.

[2]刘晓漫.福寿螺不同地理种群抗药性及其生理生化差异研究[D].广西大学，2011.

[3]刘晓漫.福寿螺不同地理种群抗药性及其生理生化差异研究[D].广西大学，2011.

作者简介：陈琳（1984-），女，江西赣州，博士，讲师，主要研究方向：生物技术。