超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物的不确定度分析

李绪鹏 彭家杰 胡浩光 刘少彬 莫炯怀 郭少忠

（东莞市海洋与渔业环境监测站，广东 东莞 523002）

超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物的不确定度分析

李绪鹏 彭家杰 胡浩光 刘少彬 莫炯怀 郭少忠*

（东莞市海洋与渔业环境监测站，广东 东莞 523002）

评定了超高效液相色谱串联质谱法检测水产品中硝基呋喃类代谢物含量的测量不确定度。该方法测量不确定度的主要来源有：标准曲线拟合；标准溶液配制；同位素-内标配制；样品的称量；样液的定容；加标回收率；测量重复性。通过建立数学模型，对结果进行分析和量化，发现该方法的测量不确定度主要由加标回收率、标准曲线拟合及测量重复性引起，其它因素是次要的。实际操作过程中可通过增加混合标准工作液的测定次数及平行样品的测定，对分析方法进行优化以保证方法的可靠性和数据的准确性等来减少不确定度。

液相色谱串联质谱法；硝基呋喃类代谢物；水产品；不确定度；测定

硝基呋喃类药物是人工合成的抗感染类药物[1]，此类药物可在动物机体内与蛋白结合产生代谢物并发生基因突变，其代谢速度快[2]，滞留时间久[3]，具有高致癌、高致畸和高毒性[4]，给食用者的健康带来潜在风险，引起人们的高度重视。目前，全球大多数国家均禁止将该药物作为兽药使用，并采用液质方法[5-10]对硝基呋喃类代谢物进行测定，限量值为1.0 μg/kg[11]。

为确保硝基呋喃类代谢物残留量检测结果的准确性，工作试验中应根据相关权威技术规范[12]要求进行测量不确定度的评定。测量不确定度是说明被测量之值分散性的参数，是判断测量结果的依据和评定测量水平的参数指标[13]。本文依据《测量不确定度评定与表示》[14]和《化学分析中不确定度的评估指南》[15]规定的基本方法和程序，对农业部783号公告1-2006[16]液相色谱-串联质谱法测定水产品中的硝基呋喃类代谢物残留量的不确定度进行分析评定，建立数学模型，找出影响不确定度的主要分量，并对其不确定度进行了评定和表示，以保证方法的可靠性和数据的准确性，从而提高检测质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

API4000+液相色谱-串联质谱联用仪，配ESI离子源（美国AB SCIEX公司）；LXJ-IIB 型离心机（上海安亭）；ZWY-110X50 往复式水浴恒温振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；MS3 Digital 漩涡振荡器（德国IKA公司）；N-EVAP 24 氮吹仪（美国Organomation公司）；超纯水机（Milli-Q公司）。

1.2 标准品与试剂

AOZ、AMOZ、AHD·HCl、SEM·HCl、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C-15N2以上标准品均购自Sigma 公司；甲醇、乙酸乙酯、二甲亚砜、2-硝基苯甲醛，甲酸为色谱纯，购自Fisher scientific 公司；盐酸、磷酸氢二钾、乙酸铵为优级纯，购自广州化学试剂厂；实验用水为超纯水。

1.3 样品前处理方法

样品：称2 g 样品于50 mL 离心管中，加入50 μL浓度为100 ng/mL的同位素-内标混合标准溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀50 s后，置于往复式水浴恒温振荡器中37℃避光振荡16 h。

取出离心管待冷却至室温，加入4.2 mL磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋混匀50 s，4000 r/min离心10 min，转移上层清液至10 mL玻璃离心管中，于40 ℃下N2吹干。准确加入1.0 mL甲醇水溶液溶解残渣，过0.45 μm滤膜，待液质测定。

标准溶液：分别在5支50 mL离心管中分别加入10、50、100、250、500、1000 μL浓度为10 ng /mL的混合标准溶液。除不加样品外，按照上述样品处理方法处理后，进行液相色谱串联质谱测定分析。

2 结果与分析

2.1 数学模型

根据测定方法，建立样品中硝基呋喃类代谢物含量的数学模型如下：

式中：X为样品中待测物含量（μg/kg）；R为样液中的待测物与同位素内标峰面积比值；c为标准溶液中待测物浓度（ng/mL）；Rs为标准溶液中的待测物与同位素内标峰面积比值；V为样液最终定容体积（mL）；m为试样的质量（g）。

2.2 测量不确定度的来源及合成

样品中硝基呋喃类代谢物测量不确定度来源主要有以下几个方面：标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(c0)；标准溶液配制过程中的相对标准不确定度urel(cs)；同位素-内标引入的相对标准不确定度；样品的称量过程中引入的相对标准不确定度urel(m)；样液浓缩的最终定容体积引入的不确定度urel(V)；加标回收率引入的相对标准不确定度urel(R)；样品上机重复测量引入的不确定度urel(frep)。方差合成标准不确定度的数学模型为：

2.3 各项相对标准不确定度的分量计算

2.3.1 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(c0)

本试验以SEM为例，对SEM梯度标准工作溶液（C）进行检测，每个浓度检测1次，以峰面积比（Ai）与标准溶液浓度（Ci）采用最小二乘法拟合，标准曲线测定结果及线性回归（）见表1。曲线拟合引入的不确定度为：回归直线标准偏差；Ai 为第i个标准溶液峰面积比值；a 为线性回归方程的截距；b 为斜率；Ci 为第i点的质量浓度值；C0为样品的测定值；为标准溶液质量浓度的平均值；n=6为标准溶液浓度点。计算结果见表1。

表1 SEM的标准曲线测定结果和不确定度计算

2.3.2 标准溶液配制过程中的相对标准不确定度urel(c的数学模型为

表2 标准溶液配制过程中的相对标准不确定度

表2 标准溶液配制过程中的相对标准不确定度

?

表3 同位素-内标引入的相对标准不确定度

2.3.4 样品的称量过程中引入的相对标准不确定度urel(m)

根据称量样品所用天平计量证书查得U= 0.03 g，按矩形分布，k=。称量样品为2.00 g，天平称量过程中引入的不确定度为：

2.3.5 样液浓缩的最终定容体积引入的不确定度urel(V)

样液最终定容使用1mL吸液器，按照JJG196-2006[17]要求，1mL吸液器的允许误差为± 1.5 %，按照均匀分布，k=3，样液定容引入的不确定度为

2.3.6 加标回收率引入的相对标准不确定度urel(R)

根据农业部783号公告1-2006 标准文本的实验方法，在空白样品中添加1.00 μg/kg水平的混合标准，进行6次加标回收试验，用公式算样品加标回收的相对标准不确定度，按均匀分布，k=，计算结果见表4。

表4 样品加标回收引入的相对标准不确定度

2.3.7 样品上机重复测量引入的不确定度urel(frep

在同一未检出样品中添加同一浓度的混合标准溶液，按照1.3方法进行处理和液质上机测定，重复测定6次，用贝塞尔公式进行计算，最后计算结果见表5。

表5 重复测定结果和不确定度计算

2.3.8 合成不确定度及检测结果表述ucrel

以上各项不确定度分量相互独立，不考虑分量间的相关性，将上述SEM各值代入公式（2）中，最终检测结果取包含因子k=2（近似95 %置信概率），用扩展不确定度U=k ⋅ucrel表示，AOZ、AHD和AMOZ的评定结果同理，见表6。

表6 相对标准不确定度评定结果

3 结论

本文参考多篇不确定度评定文献[18-22]及其相关测定方法，结合实际操作情况，按照测量不确定度的评定标准，分析不确定度分量因素，建立数学模型，进行不确定度各分量的评定，得出最终的不确定度主要来源于样品试验处理过程中的标准曲线拟合、加标回收率以及样品重复测量这3方面，其他因素来源于实验员配制标准溶液过程中带来的不确定度。因此，为保证最终结果的准确性，可在实际操作过程中通过增加混合标准工作液的测定次数及平行样品的测定，对分析方法进行优化以保证方法的可靠性和数据的准确性，同时样品的采集与制备对试验过程带来的不确定度也不容忽视。

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O657.7

A

10.11974/nyyjs.20161232001

李绪鹏（1985-），男，助理工程师，研究方向：海洋与渔业环境监测，水产品质量安全监控；郭少忠（1965-），男，高级工程师，研究方向：水产品质量安全监控、海洋与渔业环境监测、水产养殖。

东莞市科技计划资助项目（项目编号：K10017K）

*为本文通讯作者