电子束辐照对鲈鱼小清蛋白生化性质及抗原性的影响

洪天畅 朱恒杏 邵孟茹 潘家荣

（中国计量大学生命科学学院，浙江省特色农产品品质与危害物控制技术重点实验室，浙江 杭州 310018）

鲈鱼（Bass）肉味鲜美，肉质细嫩，综合营养价值高，是“中国四大淡水名鱼”之一，是人们品尝美味、获取优质蛋白的不二选择，但其含有过敏原，可使人体产生过敏反应。食物过敏是过敏人群食用某种食物引发的异常免疫反应，医学上过敏属于免疫变态反应［1］。近年来水产品过敏人口数量持续上升，已成为重大公共健康问题之一［2-3］。卢睿祺等［4］研究发现鲈鱼主要过敏原是小清蛋白（parvalbumin，PV），是一种存在于鱼类肌肉组织中的小型钙结合蛋白［5］。有报道证实，导致70%～100%的鱼类和鱼制品过敏反应的主要诱因是小清蛋白［6］，其分子量通常为10～13 kDa，等电点介于4.1～5.2 之间［7］。小清蛋白分子由于构象、折叠能力和抗原表位的不同及特殊性，其经过高温、酸碱和各种变性剂处理后仍具有过敏性［8-10］，不同加工方式能降低鱼过敏原IgE 的结合能力，但会产生新的具有IgE 结合能力的被修饰蛋白［11］，因此常规方法难以达到对鱼肉脱敏的作用。

辐照具有促进蛋白质降解、交联和分子构象变化的作用，是有效降低食物过敏的技术，颇具应用前景［12］。目前已有辐照水产品过敏原的报道［13-16］，并证实辐照可破坏水产品中的过敏原，其中顾可飞等［17］研究发现液态虾过敏原较固态过敏原对辐照更敏感，水分子的存在会影响辐照效果。但关于辐照消减鱼类过敏原的研究较少，且未见鲈鱼小清蛋白辐照脱敏的相关报道。因此，本研究以实验室提取纯化的鲈鱼小清蛋白溶液及冻干粉为对象，分析不同电子束辐照剂量对不同状态鲈鱼小清蛋白生化性质和抗原性的影响，旨在为鲈鱼及其制品的消敏研究提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲈鱼：市售

甘氨酸（glycine，Gly）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulphate，SDS）、甲叉双丙烯酰胺（bis-acrylamide，Bis）、巯基乙醇、N，N，N，N-四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED）、8- 苯氨基-1- 萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris］、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自上海麦克林生化科技股份有限公司，硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC）、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG、改良型Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，预染Marker 购自北京索莱宝科技有限公司，小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体PARV-19 购自美国Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

DR-3000 酶标仪，无锡华卫德朗仪器有限公司；SpectraMax M3 荧光酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；DZ-10/20 高能电子直线加速器，中国原子能科学研究院；MOS-500 圆二色光谱仪，英国应用光物理公司；Watersl-class plus 高效液相色谱，沃特世科技（上海）有限公司；Thermo-QE 质谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鲈鱼小清蛋白的提取、纯化与鉴定 鲈鱼小清蛋白的提取参考陆宗超［18］的方法：新鲜海鲈鱼去骨去鳞，制备鱼糜，取10 g 鱼糜用10 mmol·L-1Tris-HCl-0.5 mmol·L-1Gly-1 mmol·L-1DTT 溶液浸提，10 000 r·min-1离心20 min，取上清。鲈鱼小清蛋白的纯化参照马涛等［19］的方法：上清液经硫酸铵（60%和100%）沉淀，离心取沉淀，透析36 h，然后用DEAESepharose Fast Flow 纯化得小清蛋白溶液，所得溶液等体积均分至10 份4 mL EP 管中，取其中5 份进行冻干得冻干粉，其余直接-80 ℃冻存。辐照后的冻干粉加入10 mmol·L-1Tris-HCl 溶解至4 mL。利用免疫印迹法、紫外分光光度法及质谱法对纯化后的小清蛋白进行鉴定。

1.3.2 多克隆抗体的制备与效价测定 参照孙登瑶［20］的方法进行小清蛋白多克隆抗体制备：小鼠皮下多点注射，每只100 μg，每2周免疫1次，免疫后1周采血测效价，共免疫7 次，免疫后小鼠进行眼球取血，间接酶联免疫法吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测抗血清的效价，血液于3 000 r·min-1离心5 min，上清于-40 ℃保存。

1.3.3 辐照处理 取小清蛋白溶液和小清蛋白冻干粉于EP 管中，室温下以0、3、5、7、9 kGy 辐照处理，剂量率为250 Gy·min-1。辐照后立即存于-20 ℃中，冻干粉溶于10 mmol·L-1Tris-HCl 中，进行免疫印迹、蛋白浓度、浊度、疏水性、分子量和抗原性测定。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 免疫印迹 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分离的小清蛋白，参照陈献雄等［21］的方法，用Tris-HCl 缓冲盐溶液加吐温-20（TBS 加Tween-20，TBST）浸泡分离胶及硝酸纤维素膜5 min，制作“三明治”后进行电转，转移电流100 mA，时间为1 h。转印完的硝酸纤维素膜用蒸馏水清洗后，再用5%奶粉封闭液浸泡，摇床上升温缓慢摇1 h，TBST 漂洗3 次。将膜放入稀释5 000倍的一抗（小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体PARV-19或小鼠抗鲈鱼小清蛋白多克隆抗体）浸没，37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤3 次。用稀释20 000 倍的兔抗小鼠辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤3 次。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）避光显色15 min，加入蒸馏水终止反应。

1.4.2 鲈鱼小清蛋白浓度、浊度、疏水性及分子量的测定 鲈鱼小清蛋白浓度测定：采用Bradford 法，标准组离心管中加入100 μL 相应浓度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），样品组中分别加入100 μL 小清蛋白稀释液，每管加入1 mL Bradford 工作液，室温反应10 min，利用紫外分光光度计测定各管在595 nm 下的吸光值，每个样品测定3次。浊度测定：以280 nm 下的吸光度值表示，每个样品测定3 次。疏水性测定：参照余晶梅［22］的方法，向100 μL 辐照后的小清蛋白溶液中加入2 μL 8 mmol·L-1的8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）液混匀，室温放置2 h，在激发波长385 nm、发射波长420～550 nm 的荧光酶标仪下进行荧光强度扫描，每个样品测定3 次。分子量测定：小清蛋白溶液80 μL 与20 μL上样缓冲液混合，沸水浴5 min，快速离心上样，浓缩胶浓度为5%，电泳电压为80 V，时间为30 min，分离胶浓度为15%，电泳电压为100 V，时间为1.5 h，待溴酚蓝指示剂接近胶底5 mm 处停止电泳，取下分离胶，考马斯亮蓝R-250中染色15 min，倒掉染色液，加入脱色液脱色至背景无色，条带清晰。

1.4.3 间接竞争ELISA（Ci-ELISA）方法 参照于滢［23］的方法并稍作修改。（1）抗原包被：未辐照鲈鱼小清蛋白用包被液稀释为1 μg·mL-1，加100 μL 到96 板中，37 ℃孵育2 h或置于4 ℃过夜。（2）洗涤：次日取出恢复至室温，甩干包被液，用PBST 洗涤3 次，每次5 min，甩干。（3）封闭：每孔加入5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育1 h。洗涤甩干。（4）竞争反应：将每个辐照剂量的小清蛋白稀释成0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-17个梯度，50 μL 辐照后的鲈鱼小清蛋白和50 μL PBST稀释的小鼠多克隆抗体在酶标板外反应1 h后，加入有包被抗原的酶标孔，每孔内加入50 μL PBS和50 μL抗原，不加样品或抗原的为无竞争反应体系，37 ℃孵育1 h。同（2）洗涤。（5）加酶标二抗：每孔加入100 μL 1∶200 00 稀释的酶标二抗（兔抗小鼠IgG-HRP），37 ℃孵育1 h。同（2）洗涤。（6）显色：将100 μL反应底物加入到酶标板的孔内，并置于37 ℃避光反应15 min。（7）终止反应：每孔加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4终止反应。（8）比色：在450 nm 处测定吸光值，每组重复3 次。（9）IC50值计算：以小清蛋白浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制竞争抑制曲线，拟合出标准曲线。计算每个辐照剂量竞争抑制率50%时的抗原浓度，该浓度即为IC50值。每个处理重复3次。抑制率的计算公式为：

式中，OD无为不加样品反应孔的吸光度值，OD样品为辐照后小清蛋白的吸光度值，OD空白为空白孔的吸光度值。

1.4.4 二级结构测定 利用圆二色谱（circular dichroism，CD）检测辐照前后小清蛋白二级结构。

1.5 数据处理

液质联用质谱结果利用搜库软件Maxquant 及UniProt数据库检索匹配得到相关数据，辐照后浓度、浊度及疏水性测定所得数据用SPSS 26.0进行单因素方差分析及独立样本T检验，圆二色谱数据用Dichroweb处理得辐照后蛋白质二级结构各构象成分相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 鲈鱼小清蛋白的提取与鉴定

由图1 可知，鲈鱼蛋白粗提后含有多条蛋白带，但煮沸后仅有3 条明显的蛋白带，说明煮沸能除去多条蛋白。经硫酸铵沉淀后仅有1 条清晰蛋白带。同时由表1 可知，煮沸之后的滤液去除了大部分杂蛋白，100%硫酸铵盐析所得沉淀可能主要为所需的小清蛋白。图2 为DEAE-Sepharose Fast Flow 洗脱图，蛋白主要存在于7 管和8 管。图3 为两管的SDS-PAGE 图，可以明显看出8号管纯度更高。

表1 鲈鱼蛋白提取过程中蛋白含量变化Table 1 Changes of protein content during the extraction of bass protein

图1 鲈鱼蛋白提取过程中SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE during the extraction of bass protein

图2 鲈鱼粗提蛋白洗脱图Fig.2 Elution diagram of crude protein extract of bass

图3 鲈鱼粗提蛋白洗脱样品SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of crude protein elution sample from bass

图4 为8 号管的紫外扫描分析图，259.2 nm 处存在吸收峰。由于小清蛋白的氨基酸组成中有较高的酪氨酸和苯丙氨酸比率，且缺乏色氨酸，260 nm 会出现特征吸收峰，符合小清蛋白特征。

图4 鲈鱼粗提蛋白洗脱样品8号管紫外扫描图Fig.4 UV scan of tube 8 of bass crude protein elution sample

图5为利用小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体PARV-19［24］进行的免疫印迹图，纯化后的鲈鱼小清蛋白在10～12 kDa处有杂交带。

图5 鲈鱼小清蛋白纯化后免疫印迹Fig.5 Immunoblotting after purification of bass parvalbumin

为了进一步验证提取蛋白的种类，利用液质联用仪（liquid chromatography mass spectrometry，LC/MS）对蛋白进行质谱鉴定。图6 为鲈鱼纯化蛋白的质谱图，利用搜库软件Maxquant及UniProt数据库解析谱图，根据理论序列和谱图匹配出碎裂的离子，通过碎裂方式进行拼接得到肽段，从肽段水平匹配到蛋白水平，得到部分数据结果如表2 所示。可以看出，分子量为11.6 kDa 的蛋白覆盖率为59%，鉴定出6 条肽段，匹配到53 个二级谱图，等电点为4.86，蛋白得分为205.98（＞60），结果可信，因此可以确定该蛋白为小清蛋白。

表2 小清蛋白LC/MS质谱结构鉴定分析结果Table 2 Structure identification and analysis results of parvalbumin by LC/MS mass spectrometry

图6 小清蛋白LC/MS质谱结构鉴定谱图Fig.6 Structure identification spectrum of parvalbumin by LC/MS mass spectrometry

2.2 鲈鱼小清蛋白多克隆抗的制备

图7 为小清蛋白多克隆抗体效价测定结果，抗体效价达1∶128 000，满足后续试验要求。利用该多克隆抗体进行免疫印迹测定，得图8，鲈鱼粗提蛋白和纯化的小清蛋白能与该多克隆抗体结合，反应条带在12 kDa 左右，没有进行多抗孵育的阴性对照组未与抗体结合，进一步说明小清蛋白多克隆抗体纯度已经较高。

图7 小清蛋白多克隆抗体效价测定结果Fig.7 Result of polyclonal antibody titer determination of parvalbumin

图8 小清蛋白多克隆抗体免疫印迹Fig.8 Immunoblotting with a polyclonal antibody against parvalbumin

2.3 电子束辐照对鲈鱼小清蛋白浓度、浊度、疏水性和分子量的影响

利用Bradford法测定595 nm处的吸光度，以吸光度值表示浓度，由表3可知，相同状态下，随着电子束辐照剂量的增加，冻干粉及溶液处理的A595nm值均整体显著降低，说明电子束辐照能使鲈鱼小清蛋白浓度降低，这是由于辐照处理使蛋白降解，导致溶液中的蛋白碎片增多，蛋白溶解度降低。溶液经7 kGy 辐照后浓度增大，原因是蛋白碎片增多，溶液浊度增大，透明度降低［25］。相同辐照剂量下（3、5、7 或9 kGy），与冻干粉处理相比，溶液处理的A595nm值更低，均达到显著差异水平。

表3 辐照下鲈鱼小清蛋白A595 nm的变化Table 3 Changes of bass parvalbumin in the A595 nm under irradiation

以280 nm处的吸光度值表示蛋白浊度。由表4可知，相同辐照剂量下，溶液处理的蛋白浊度显著大于冻干粉处理。相同状态下，随着辐照剂量的增加，冻干粉及溶液的浊度均整体显著增大，该结果与蛋白浓度的变化趋势一致，即：蛋白浓度越低，浊度越高，产生的蛋白碎片越多。

表4 辐照下鲈鱼小清蛋白A280 nm的变化Table 4 Changes of bass parvalbumin in the A280 nm under irradiation

表5 是不同电子束辐照剂量下的蛋白荧光强度变化，荧光探针ANS 的荧光强度越大，反映蛋白疏水性越强。相同状态下，随着辐照剂量的增加，冻干粉处理及溶液处理均使荧光强度显著增大，说明经过电子束辐照处理后，蛋白的的疏水性显著增大，辐照使小清蛋白的疏水性基团大量暴露在分子表面，使鲈鱼小清蛋白疏水性提高。同时可以看出，在3～7 kGy 辐照剂量范围内，冻干粉处理的蛋白疏水性较大，溶液处理的蛋白疏水性较小，均达到显著差异，而在9 kGy 剂量处理下，结果则相反。

表5 辐照下鲈鱼小清蛋白荧光强度的变化Table 5 Changes of fluorescence intensity of bass parvalbumin under irradiation

SDS-PAGE 电泳分析（图9-A 和图10-A）表明，随着辐照剂量增大，小清蛋白带逐渐模糊，9 kGy 时条带较低剂量辐照条带更模糊，说明溶液状态下，辐照使部分小清蛋白发生断裂和破坏，辐照剂量越大，破坏越严重。而冻干粉处理的条带变化始终不明显。

图9 不同电子束辐照剂量处理鲈鱼小清蛋白溶液条件下的SDS-PAGE电泳图和免疫印迹Fig.9 SDS-PAGE electrophoretograms and immunoblotting of parvalbumin solution from bass treated with different electron beam irradiation doses

图10 不同电子束辐照剂量处理鲈鱼小清蛋白冻干粉条件下的SDS-PAGE电泳图和免疫印迹Fig.10 SDS-PAGE electrophoretograms and immunoblotting of parvalbumin lyophilized from bass treated with different electron beam irradiation doses

2.4 电子束辐照对鲈鱼小清蛋白抗原性的影响

表6 是不同电子束辐照剂量处理下的鲈鱼小清蛋白半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值的变化，反映小清蛋白的抗原性变化，IC50值越小，抗原性越高。结果表明，辐照剂量为9 kGy 时，冻干粉IC50值比0 kGy 增大40 倍，溶液IC50值比0 kGy 增大43 倍，随着辐照剂量的增加，溶液和冻干粉状态处理小清蛋白的IC50值均增大。说明随着辐照剂量增大，小清蛋白的抗原性降低。从相同辐照剂量处理看，溶液状态处理的IC50值较大，冻干粉处理较小，说明溶液状态处理的抗原性降低更明显。从图9-B 和图10-B 的免疫印迹结果同样可以看出，随着辐照剂量的增大，免疫印迹条带越来越淡化。

表6 不同电子束辐照处理下鲈鱼小清蛋白IC50值的变化Table 6 Changes of IC50 value of bass parvalbumin under different electron beam irradiation

2.5 电子束辐照后鲈鱼小清蛋白二级结构的变化

利用圆二色谱（circular dichroism，CD）测定辐照处理后小清蛋白二级结构的变化，结果如图11和图12所示，可见波形和波幅发生了变化。由表7可知，与0 kGy相比，冻干粉状态及溶液状态辐照后的蛋白α-螺旋及无规则卷曲比例均升高；相同剂量下，溶液状态处理无规则卷曲升高明显，冻干状态处理α-螺旋升高明显，但不同辐照剂量之间无明显差异。同时可以看出，辐照处理β-折叠及β-转角比例较未辐照处理无明显变化。说明辐照破坏了蛋白的二级结构。

表7 CD鉴定鲈鱼小清蛋白二级结构含量变化Table 7 Change of secondary structure content of bass parvalbumin identified by CD

图11 鲈鱼小清蛋白溶液CD图Fig.11 CD diagram of bass parvalbumin solution

图12 鲈鱼小清蛋白冻干粉CD图Fig.12 CD diagram of bass parvalbumin powderr

3 讨论

辐照通过电离辐射与物质相互作用对食品进行加工处理［26］。食品辐照已被证明是一种安全、高效的物理加工手段，逐步应用于食品杀菌、脱敏等方面［27］。与顾可飞［28］在研究辐照对虾过敏原影响中得出的随着辐照剂量增大，过敏原溶液浓度显著增大，过敏原粉浓度未发生显著变化的结果不同，本试验结果表明，不同剂量辐照处理溶液和冻干粉浓度均较未辐照处理显著减小，浊度则均显著增大，可能是由鲈鱼和虾的蛋白结构及辐照破坏程度不同所致。相同辐照剂量下，溶液和冻干粉的浓度及浊度表现出差异，可能是由于辐照处理具有射线的直接破坏作用和通过超自由基的间接破坏作用，溶液处理除了直接作用还具有间接作用，蛋白质破坏效应更明显，蛋白浓度更低，浊度更大。

溶液和冻干粉疏水性随辐照剂量的增大而显著提高，这与张明琦等［29］研究辐照对蟹过敏蛋白影响的结果相近，可能是由鲈鱼小清蛋白中亲水性基团对辐照作用更为敏感所致。3～7 kGy 剂量处理时，冻干粉处理的蛋白疏水性较大，溶液处理的蛋白疏水性较小，而9 kGy 剂量处理时，结果则相反，可能是由于溶液状态水分子与小清蛋白中的亲水基团结合成氢键，低剂量辐照不足以使氢键断裂，疏水性基团不易显露，而在高辐照剂量下，氢键断裂，疏水性基团大量暴露，疏水性显著增大［30］。SDS-PAGE 结果表明，随着辐照剂量增加，小清蛋白的含量逐渐减少，推测小清蛋白多肽链断裂成小肽段或交联成更长的肽链。相同辐照剂量下，溶液状态处理的抗原性较冻干处理降低更明显，抗原位点破坏更多，这同样可能是由于溶液状态存在水分子，辐照处理容易形成超自由基所致。过敏原与抗原位点结合激发免疫反应，抗原位点包括立体结构位点和一级结构位点，辐照处理有可能既破坏通过氢键、二硫键等连接的立体结构，又破坏蛋白一级结构位点，使有效抗原位点显著减少，鲈鱼小清蛋白与抗体的结合率降低。结合浓度、浊度及SDS-PAGE结果推断，电子束辐照使小清蛋白发生多肽链断裂、抗原位点破坏等一级结构改变，导致抗原性降低，这也证实了前人的研究结果，即辐照能降低鲈鱼小清蛋白的抗原性［31］。

辐照处理使鲈鱼小清蛋白二级结构破坏，虽然β-折叠及β-转角变化不明显，但α-螺旋及无规则卷曲比例升高，张振山等［32］在研究霉变和辐照对大豆蛋白质理化性质和结构的影响时也得出相同结论。结合免疫印迹及间接竞争ELISA 结果，小清蛋白的抗原性变化与无规则卷曲比例变化趋势一致，推测辐照对小清蛋白抗原性的影响主要与无规则卷曲有关。辐照后小清蛋白α-螺旋及无规则卷曲比例升高，疏水性基团暴露，改变小清蛋白的构象及聚合形式，同时改变二级结构及三级结构，进而改变蛋白的生物学功能［29］，但辐照降低鲈鱼小清蛋白抗原性的机理还有待进一步研究。

此外，本研究发现溶液状态和冻干粉状态辐照处理效果显著不同，溶液状态的辐照处理效果更明显，这是辐照的直接作用和间接作用所致，直接作用是射线直接切断活性基团或化学键，从而使蛋白断裂、结构破坏；而由于水分子的存在，辐照处理容易形成超自由基，间接作用于蛋白分子，从而破坏蛋白一级结构和立体结构。不同状态的鲈鱼小清蛋白对辐照的敏感性不同，溶液比冻干粉对辐照更为敏感。该结果为未来脱敏技术的发展提供了新思路，过敏原的状态对达到最佳脱敏效果是否存在较大影响，仍需要进一步研究。

4 结论

电子束辐照处理溶液状态和冻干粉状态的鲈鱼小清蛋白后，蛋白浓度显著减低，浊度显著增加，疏水性显著提高，过敏条带逐渐变浅，免疫印迹条带变浅甚至消失，说明辐照使鲈鱼小清蛋白空间构象改变；与对照组相比，9 kGy 剂量辐照的冻干粉IC50值增大40 倍，溶液IC50值增大43 倍，小清蛋白与抗体的结合能力显著减弱，表明辐照可以显著降低鲈鱼小清蛋白抗原性；鲈鱼小清蛋白二级结构被破坏，辐照对小清蛋白抗原性的影响主要与无规则卷曲有关。与冻干粉状态相比，辐照处理对溶液状态效果更明显，溶液状态辐照处理可作为降敏辐照加工的主要方式。