桑叶中1-脱氧野尻霉素降糖机制研究进展

王诗睿 赵 冲

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺陷或利用障碍导致血糖代谢紊乱，进而引起一系列生理反应的代谢性疾病，主要类型有1 型糖尿病（diabetes mellitus type 1，T1DM），为胰岛素依赖型，主要由遗传因素导致胰岛素分泌不足所致；2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM），为非胰岛素依赖型，绝大部分患者（＞90%）为该类型，主要特征是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）；以及其他如妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）等［1］。

我国最新流行病学调查研究显示，2013—2018 年间我国糖尿病患病率显著增加，2013 年我国成人糖尿病患病率为10.9%，2018年已达12.4%，其中前期糖尿病患病率高达38.1%［2］。在全球范围内，预计2045 年约有6.93 亿人将受糖尿病的影响［3］。由此可见，糖尿病形势严峻，亟需引起重视。糖代谢紊乱是糖尿病的重要病理学基础，调节糖代谢、维持血糖平衡是治疗糖尿病的重要途径之一。但目前并没有针对糖尿病的特效药，且各种药物具有一定的副作用，而通过健康饮食指导、正确的生活方式干预是除药物外防治糖尿病的良好办法。开发具有降糖功效且副作用小的食源性活性成分并研制保健产品、食品和药物已成为降糖功能因子研究的热点。

1 桑叶及桑叶提取物

桑叶是桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥叶，又名“神仙草”，2015 年被列入《食药物质目录》［4］。消渴症是糖尿病早期症状之一。在中医中早有利用桑叶治疗消渴症的记载，如《本草纲目》中有桑叶“汁煎代茗，能止消渴”“灸熟煎饮，代茶止渴”的说法［5］。大量试验证明，桑叶具有良好的降血糖、预防和控制糖尿病的作用。刘国艳等［6］给予四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠桑叶水提取液，结果表明桑叶提取物能显著降低糖尿病小鼠的血糖值，且存在剂量-效应关系。一项双盲对照试验发现，给予桑叶提取物的受试者血液中胰岛素和丙二醛水平显著降低，并提高了高密度胆固醇水平［7］。Cui等［8］研究表明，补充桑叶或桑叶提取物可显著降低空腹血糖、糖化血红蛋白以及空腹血浆胰岛素水平。

随着科学技术的不断发展，对桑叶中活性成分的研究不断深入，发现多具有良好的降糖功效。Ge 等［9］采用气相色谱-质谱法鉴定了桑叶的202种成分，其中22 种对糖尿病及其并发症具有显著疗效，包括桑叶黄酮、多糖和生物碱等活性成分。1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑叶降糖的主要活性成分之一。

2 1-脱氧野尻霉素（DNJ）降糖功效

DNJ 是一种多羟基生物碱，可从桑叶和根皮中提取，也存在于其他植物和微生物中，结构为（2R，3R，4R，5S）-2-羟甲基-2，4，5-三羟基哌啶，分子式为C6H13NO，结构式见图1［10］。

图1 DNJ的化学结构Fig.1 Chemical structure of DNJ

目前已证明DNJ具有多种生理功能，如降脂、抗病毒、抗肿瘤等，其中研究和应用较为广泛的是降血糖作用［11］。有研究显示，每日给予高脂血症小鼠50 mg·kg-1b.w.的桑叶DNJ 冻干粉可显著降低小鼠餐后血糖、总胆固醇含量以及胰岛素抵抗指数，还可改善糖尿病前期小鼠的糖脂代谢，降低患T2DM 的风险［12］。在高糖高脂饲喂联合链脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射的高血糖SD 大鼠模型中，灌胃给予大鼠一定量DNJ 6 周后，试验组大鼠的血糖水平、肾肥大指数以及肾脏损伤程度均低于模型组［13］。自由饮用含10% DNJ 水的T2DM 模型小鼠的肝纤维化程度显著降低［14］。在一项前瞻性研究中发现，12 mg 桑叶DNJ 是减轻餐后高血糖的最小有效剂量，可使空腹血糖降低3.86 mg·L-1，糖化血红蛋白降低0.11%，同时未见明显的胃肠道反应［15］。

上述研究表明，DNJ 对糖尿病前期和患糖尿病的动物模型均有良好的降血糖功效，同时可改善糖尿病带来的多种并发症，如肝、肾的损伤等。

3 DNJ降糖机制

3.1 抑制α-糖苷酶

α-葡萄糖苷酶可水解葡萄糖苷键释放葡萄糖，在碳水化合物的消化中起着重要作用。DNJ对小肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，可有效阻碍糖类分解，延缓肠道内单糖的吸收与利用，从而促使餐后血糖平稳［16］。李有贵等［17］利用液相色谱-质谱法（liquid choromatography-mass spectro meter，LC-MS）分离纯化得到了纯度大于95%的桑叶DNJ，进一步研究发现DNJ 对α-蔗糖酶表现为非竞争性抑制作用，其半抑制浓度IC50为5.67 mg·mL-1，抑制常数Ki为6.73 mg·mL-1。DNJ 纯度越高，抑制作用越强，纯度在15%左右时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于阿卡波糖片（拜糖平）［18］。

DNJ主要通过与糖苷酶结合抑制其酶活性。有研究表明，DNJ 可与α-葡萄糖苷酶的Asp202、Glu271 和Asp333 残基形成稳定的氢键，同时存在与Asn331 和His332 残基的疏水作用和静电吸引增强作用力，从而牢牢结合在α-葡萄糖苷酶口袋内部［19］。也有研究表明，DNJ 分子与α-葡萄糖苷酶中的Gln438、Arg437 和Phe455 结合位点相互作用形成6 个氢键，也能与异麦芽糖酶中的Gln279 和Val216 结合位点形成4 个氢键，抑制异麦芽糖酶的活性，但对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于对异麦芽糖酶的作用［20］。

郭时印等［21］模拟了生理条件下DNJ 与α-糖苷酶的相互作用，运用紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色光谱法获取蛋白质主链的二级构象信息，结果显示DNJ能使α-糖苷酶的α-螺旋结构含量降低，而β-折叠、β-转角和无规卷曲含量不同程度上升，即二级结构发生重排，诱导活性位点关闭，使底物与酶的结合作用减弱。

因此，DNJ 抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要机制可能是与酶上的一些氨基酸残基以氢键的形式结合，并通过疏水相互作用和静电吸引加强作用力，改变了α-糖苷酶二级结构构象，发生重排，导致活性位点关闭、分解能力减弱。

3.2 影响肝脏糖脂代谢

肝脏是糖代谢的核心器官，具有双向调节作用，能通过肝糖原的合成与分解、糖异生等途径调节血糖。在正常情况下糖异生能补充糖供应的不足，维持血糖水平的稳定，但肝糖异生紊乱导致的葡萄糖生产和输出增加，是糖尿病发病的重要原因。因此，抑制过度糖异生、减少内源性葡萄糖的生成对糖尿病的治疗具有重要意义［22-23］。

胡雪芹［24］对DNJ 处理和未处理的db/db 小鼠肝脏基因表达情况进行分析，发现两组小鼠基因表达的差异富集于42个信号通路217个代谢途径，包括碳代谢、能量代谢通路等；同时利用定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法对糖、脂代谢有关的12 个基因和其他6 种酶蛋白基因进行验证，结果显示，DNJ可以显著降低糖异生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6P）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）的基因表达，同时上调己糖激酶（hexokinase，HK） mRNA表达。这3 个基因表达的变化表明DNJ 可以促进糖酵解、抑制糖异生。对高脂饲料诱导的高脂血症小鼠灌胃DNJ 也有类似结果，且上调线粒体脂肪酸氧化限速酶肉碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase1，CPT1）活性，显著减少了肝脏脂滴数量［25-26］。Li 等［27］利用LC-MS分析小鼠尿液，发现DNJ处理组尿液中3-磷酸甘油醛、半乳糖醇的含量显著低于未处理组，而顺乌头酸的含量有所提高，表明DNJ 促进了葡萄糖进入三羧酸循环。在细胞水平也观察到DNJ增加了HepG2细胞葡萄糖摄取［28］。上述结论与曾艺涛等［29］的研究结果一致，即DNJ 是通过上/下调肝脏中糖代谢限速酶的表达，而非直接激活来促进肝脏中葡萄糖的吸收和降解，减少葡萄糖的生成从而调节血糖。

3.3 保护胰岛β细胞，降低胰岛素抵抗

胰岛素抵抗是指机体对胰岛素生物调节作用的敏感性和/或反应性降低，也是T2DM 的主要病因［30］。T2DM早期细胞对葡萄糖的敏感性下降，胰岛β细胞为代偿则分泌更多的胰岛素，增加β细胞负荷，易发生内质网蛋白错误折叠，引起内质网应激加速细胞凋亡和功能的衰竭［31］。DNJ 作用于糖尿病小鼠后，苏木精-伊红染色结果显示胰岛损伤减轻，并且内质网应激标志蛋白p-PERK 和p-eIF2Α 表达下降，表明DNJ 可抑制内质网应激直接保护胰岛β 细胞，维持胰岛素分泌功能［32］。

此外，DNJ 可增强靶器官对胰岛素的敏感性。视黄醇结合蛋白-4（retinol-binding protein 4，RBP4）可作为胰岛素抵抗的生物标志物，结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）增加反映机体处于应激状态。有研究表明，DNJ长期干预者的血浆RBP4和Hp水平更低，胰岛素抵抗和炎症降低［33］。骨骼肌是胰岛素刺激状态下葡萄糖吸收的主要部位，DNJ 提高了骨骼肌中葡萄糖摄取的蛋白表达，db/db 小鼠骨骼肌PI3K/AKT 信号通路被激活，从而促进葡萄糖转运蛋白Glut4向膜的转运，糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）增加，糖原合酶（glycogen synthase，GS）蛋白水平提高，肌肉的胰岛素抵抗得以缓解［34-35］。脂肪细胞分化障碍可能引起胰岛素抵抗的发生。过氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）是主要表达于脂肪组织的一种核转录因子，可调节脂肪细胞分化，在糖尿病的信号传导中具有重要作用，DNJ 可增加脂肪细胞3T3-L1 中PPARγ 表达，促进分化［36］。同时，DNJ可促进多种细胞胰岛素受体（insulin receptor，IR）和胰岛素受体底物 1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）蛋白磷酸化，激活胰岛素信号通路［37］。

综上所述，DNJ 可保护胰岛β 细胞，维持胰岛素分泌功能正常，同时影响胰岛素靶器官相关因子的表达，调节胰岛素信号通路相关蛋白，增强靶器官对胰岛素的敏感性，从而促进糖脂代谢，维持血糖平衡。DNJ的主要降糖机制见表1。

表1 DNJ的主要降糖机制Table 1 Factors of response surface test design

4 结论与展望

桑叶作为药食两用的物质，具有很高的营养、保健和药用价值，其独特的功能作用吸引了越来越多人的关注。作为降血糖的功能性食品，多种形式以桑叶为原料的食品，如桑叶面、桑叶饼干、桑叶酒、桑叶饮料（例如：桑叶茶）等不断上市，具有良好的研发前景［39］。但仍存在利用效率不高、效果不明显或副作用强等现象。针对上述问题，提出以下几点解决方法。

4.1 与其他物质协同作用

不同物质之间因作用方式、作用靶点不同，联合使用后可能产生协同增效，同时可降低使用剂量，减少副作用。有研究发现，将DNJ 与葫芦巴籽按一定比例混合后，可以上调PPARγ 的蛋白表达，进一步增加GLUT4 蛋白表达水平，协同促进细胞葡萄糖摄取，降低胰岛素抵抗［40］。DNJ与黄芩素组合表现出明显的协同抑制α-糖苷酶的作用，由于黄芩素作为变构抑制剂与α-糖苷酶发生非竞争位点结合，改变了蛋白活性位点构型，增加了DNJ 与酶的亲和力［41］。同时，除DNJ外，桑叶中还含有许多其他降糖物质，如桑叶多糖具有抗氧化能力，可促进胰岛β细胞修复，同时可促使肝糖原合成增加；DNJ-多糖可通过调节肝糖代谢降低高脂-链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖［42］。目前，针对DNJ与其他活性成分相互作用是否具有协同或降低副作用的效果，以及如何配伍以起到精准降糖的作用仍有待深入研究。

4.2 更有效的DNJ提取方法

目前常用的DNJ 提取方法包括化学方法，如酸提法、醇提法等，但存在提取率低、对DNJ 破坏与分解的可能性大、费时费力等问题，因此，开发更高效、安全、提取率高的方法可能成为开发DNJ 相关产品的瓶颈。谷绪顶等［43］采用发酵里氏木霉提取桑叶DNJ，微生物预处理降解桑叶细胞壁纤维素的无定形区域，破坏细胞壁，使细胞中的DNJ易于释放，提取率较蒸馏水浸泡组增加了18.20 倍，但该法会增加工业化生产提取桑叶DNJ 的成本。使用纤维素酶、果胶酶等酶可使植物细胞壁疏松、破裂，加速细胞内有效成分的释放，提高植物活性物质的提取效率［44］。此外，为克服桑叶中DNJ 含量低以及化学合成困难等问题，微生物生产因其安全性高、生产成本低以及周期短等优势，正成为一大趋势［45］。

4.3 药物缓释，延长作用时间

DNJ 由消化道完整吸收再通过尿液进行排泄，在体内的半衰期仅约2 h，释放不平稳，不仅药效小，增加剂量还易导致胃肠道反应或血糖过度降低等副作用［46］。有研究表明，以羟丙基甲基纤维素酞酸酯或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素为控释包衣材料制成控释微丸，可在设定时间内自动以设定的速度在体内进行释放，增强DNJ的生物利用度［47-48］。因此，如何利用可生物降解机制延缓DNJ 的释放时间，维持肠道DNJ 浓度，对提升DNJ的药用价值具有重要意义。