低氧下牦牛、黑白花牛肾间质成纤维细胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表达差异研究

姚一凡 张伊阳 董仕慧 李 睿 张 兰 周熳琳乔自林 杨 琨 ，

（1西北民族大学生物医学研究中心，甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2西北民族大学生物医学研究中心，生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

氧气是动物生长发育必需的条件之一，而低氧是高原动物生存所面临的最大挑战之一［1］。前人研究发现，低氧分压会导致机体组织中的氧气供应不足，从而影响动物正常的生理功能［2］。与平原地区动物相比，生活在高原极端环境下的动物对低氧环境具有独特的适应机制［1］。牦牛作为青藏高原上的特有物种，是研究低氧环境适应良好的模式动物，具有重要的研究价值［3］。黑白花牛是中国黄牛和荷兰荷斯坦牛的杂交品种，长期生活在平原地区，与牦牛的生活环境有较大的海拔差异，因此可作为牦牛的对照模型加以研究。

低氧条件下，动物机体可以通过改变体内某些物质代谢活性，增强氧气摄入和转运能力，维持组织间氧气水平，促进其生长、发育和繁殖，同时降低缺氧对机体的损害［3］。此外，高原动物还可通过调控线粒体氧化代谢相关的信号通路，使机体在组织与细胞层面发生一系列的生理生化反应，确保动物能在缺氧的环境中正常生活［4］。肾脏作为动物循环系统的重要组成部分，在高原动物适应缺氧环境过程中发挥重要功能［5］。有研究表明，环境缺氧和不同疾病引起的肾脏局部缺氧可能导致肾功能严重受损，引起慢性肾炎、慢性间质性肾炎、肾病综合征、无症状性蛋白尿等慢性疾病［5-7］。肾脏在这些疾病的发生过程中，均存在着不同程度因缺氧而产生的肾间质细胞纤维化，因此，肾间质成纤维细胞（renal interstitial fibroblasts，RIFs）在低氧所致各类肾源性疾病的肾间质纤维化过程中起决定性作用［8］。

丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）是调节线粒体丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）活性的四种PDK 同工酶（PDK1、PDK2、PDK3、PDK4）之一［9］。在糖代谢过程中，PDK1 通过作用于丙酮酸脱氢酶，将丙酮酸转化成乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，1ACOH）并进入线粒体参加三羧酸循环［10］。在低氧条件下，低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）对PDK1有显著的调控作用，使其在机体内的表达随氧浓度的变化改变，并通过不同途径如PDK1/AKT 通路、TGF-β/Smad2 通路等参与到细胞生长代谢过程，进一步调节Bcl-2、Caspase3/9 等下游凋亡因子诱导细胞凋亡、自噬［11-12］。

目前低氧慢性病相关研究所采用的动物模型主要集中于小鼠和大鼠［13-15］，针对高原动物本身的研究还存在部分空白。为进一步探索高原动物的低氧适应机制，本研究通过观察低氧对PDK1及其下游因子TGF-β/Smad2、Caspase3/9等在牦牛和黑白花牛RIFs中的表达差异，分析不同海拔牛种RIFs 低氧的应激差异，探究牦牛肾脏低氧适应机制，旨在为治疗低氧导致的慢性肾病提供治疗思路，为高原医疗提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 牦牛肾组织样本分离自甘南藏族自治州，黑白花牛肾组织样本采集自西安市某屠宰场。

1.1.2 主要设备及试剂 CCL-170B-8 三气箱，购自新加坡艺思高科技有限公司；CX31 光学显微镜、IX73倒置荧光显微镜，购自奥林巴斯（中国）有限公司；IE1000 细胞计数仪，购自上海睿钰生物科技有限公司；Multiskan SkyHigh 酶标仪，购自美国赛默飞世尔科技公司；CFX96 实时荧光定量PCR 仪，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。新生牛血清（newborn bovine serum，NBS)，购自兰州民海生物工程有限公司；高糖（DMEM/HIGH GLUCOSE）培养基、0.25%胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），购自北京赛澳美技术有限公司；PDK1、Smad2、Caspase3、Cytokeratin-18 和Vimentin 抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；荧光二抗、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色液（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），购自上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒采购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；4×蛋白上样缓冲液、增强型化学发光试剂盒（enhanced chemiluminescence，ECL）、细胞培养用青链霉素混合液（100×），购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牦牛、黑白花牛肾原代细胞分离、培养 将青链霉素混合液100倍稀释后按1∶10比例加入生理盐水内得到10%双抗生理盐水，分别取两种牛完整肾脏浸泡于上述试剂中，由屠宰场运输至实验室，喷洒75%酒精消毒后移入超净台。剖开肾脏肾间质组织，用含有10%双抗的PBS 清洗后用眼科剪剪成约1 mm3小块。每瓶12 块组织均匀铺于T25 细胞瓶底部，将细胞瓶背面朝上并在每瓶中加入2 mL 含有10%NBS 的DMEM/HIGH GLUCOSE 培养基。在37 ℃、5%CO2培养箱中静置12 h，待组织块贴壁后翻转细胞瓶使组织块浸入培养液后继续培养。细胞从组织块分裂出并贴壁融合率达到约90%后，用PBS洗去组织块后按照1∶4比例传代或冻存。

1.2.2 牦牛、黑白花牛RIFs 纯化 依据成纤维细胞贴壁较快的特点，利用差速贴壁法纯化细胞。将细胞用0.25%胰酶消化制成悬液后按1∶4的比例传代至新T25 培养瓶中培养3～4 h，观察细胞贴壁情况。细胞贴壁率约70%时换液，除去未贴壁细胞后得到纯度较高的成纤维细胞。继续培养，待细胞生长至80%左右后传代或冻存。

1.2.3 牦牛、黑白花牛RIFs 鉴定 在六孔板中铺设细胞爬片，将传代至第五代的细胞按每孔5×105个接种于六孔板中培养24 h，待细胞贴爬片生长至约80%后用PBS漂洗；在固定液中固定15 min后再次漂洗，用0.5%曲拉通X-100处理20 min增加细胞膜通透性；漂洗后滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭1 h；吸干封闭液后分别滴加一抗角蛋白-18（Cytokeratin-18，CK18）和波形蛋白（Vimentin），37 ℃条件下孵育2 h；PBS漂洗后滴加荧光二抗山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS 漂洗后滴加DAPI 染液处理细胞核5 min；清洗并封片后观察并拍摄荧光照片。

1.2.4 牦牛、黑白花牛RIFs生长曲线测绘 自第0天起将黑白花牛、牦牛肾间质成纤维细胞第五代分别以每孔5×103个的数量各接种于24 孔板内，每种细胞设置24 个复孔并分为低氧培养（氧浓度1%）和常氧培养（氧浓度21%）两组，每24 h 每组细胞消化3 孔计数至细胞生长进入平台期，绘制增殖曲线并计算倍增时间，计算公式为：

式中，X为细胞接种密度，Y为细胞生长峰值前一天的细胞密度，T为计数时间点。

1.2.5HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2、Caspase3、Caspase9基因表达水平检测 取低氧（1%）和常氧（21%）组细胞，用Trizol 法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书的步骤将其反转录成cDNA 后进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR），引物序列见表1。反应体系共20 μL：2× Universal SYBR Green Fast qPCR MIX 10 μL、cDNA 模板0.2 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL，ddH2O 9 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火32 s，45 个循环。每个基因设置3 个复孔。用2-△△CT法计算基因的mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR

1.2.6 PDK1、Smad2、Caspase3 蛋白表达水平检测 取低氧和常氧组细胞在冰上用放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液进行蛋白裂解，将提取的蛋白定量后按照3∶1 的比例加入4×loading buffer，恒温金属浴100 ℃中10 min 至变性。取10 μL 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide glue，SDSPAGE），用湿转法将其蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脱脂奶粉配置封闭液并室温封闭2 h，HIF-1α（1∶1 000）、Smad2（1：250）、Caspase3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）稀释于脱脂奶粉、4 ℃条件下孵育过夜。二抗（1∶1 000）稀释于脱脂奶粉室温孵育1 h，滴加ECL（enhanced chemi-luminescene）化学发光液用于显影。每组重复测定3 次，Image J 1.0 软件对条带进行灰度值测量并以内参蛋白为参照进行相对定量。

1.2.7 数据统计分析 采用SPSS 19.0软件的ANOVA分析法对不同组别的基因和蛋白表达差异进行统计学分析，并使用Graphpad8.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 细胞分离、纯化与培养

植块法处理牦牛和黑白花牛肾组织后第4 天，可见细胞从组织中分裂出并贴壁（图1-A、B），黑白花牛、牦牛肾原代细胞在光学显微镜下形态学观察可见原代细胞呈不规则多边形或梭形，完全融合后部分呈漩涡状，部分呈铺路石状。经差速贴壁法纯化后得到纯度较高的梭形，漩涡状生长的成纤维细胞（图1-C、D）。

图1 牦牛、黑白花牛RIFs分离、纯化与培养（40×）Fig.1 Isolation，purification and culture of RIFS from yak and Holstein （40 ×）

2.2 细胞鉴定

上皮类细胞特异性蛋白标志物CK-18 在纯化后的牦牛和黑白花牛细胞表达均为阴性（图2-A、B），波形蛋白（vimentin）为成纤维细胞特异性标志物，在两种细胞内均呈阳性表达且荧光信号较强（图2-C、D）。试验结果表明，培养的细胞为牦牛和黑白花牛肾间质成纤维细胞且纯度较高，可用于后续试验。

图2 牦牛、黑白花牛RIFs免疫荧光染色鉴定Fig.2 Identification of RIFS in yak and Holstein by immunofluorescence staining

2.3 牦牛、黑白花牛RIFs生长曲线

细胞生长曲线测定结果显示，牦牛肾间质成纤维细胞在第5～第6天进入对数生长期，第6天之后进入平台期，潜伏期（第1～第4天）低氧与常氧细胞增殖速度无明显差异，对数生长期常氧组增殖能力较强（图3-A）。低氧和常氧培养的黑白花牛RIFs均在第5天进入对数生长期，第6天进入平台期，潜伏期（第1～第4 天）两组细胞增殖速度无明显差异，对数生长期过程中常氧组细胞生长速度明显高于低氧组（图3-B）。根据细胞生长曲线测得细胞生长峰值数量代入1.2.4 中公式计算得到：潜伏期内牦牛细胞低氧组倍增所需时间约为48 h，黑白花牛细胞低氧组倍增时间约为44 h，牦牛RIFs在低氧条件下生长速度明显低于黑白花牛。

图3 黑白花牛、牦牛低氧和常氧组生长曲线Fig.3 Growth curves of Holstein and yak in hypoxia and normoxia groups

2.4 HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2、Caspase3、Caspase9基因表达水平检测

细胞生长曲线测得牦牛和黑白花牛RIFs 倍增时间约为44～48 h，故选择细胞分裂周期48 h、中点24 h以及第二个分裂周期中点72 h，这3 个时间点制备基因和蛋白样品。qRT-PCR 结果表明，两种牛RIFs 的HIF-1α、PDK1、Smad2基因在低氧培养条件下对比常氧组均存在显著或极显著上调（图4-A～C）。其中黑白花牛PDK1基因随低氧培养时间增加而上调，24 h时与0 h 相比无显著差异，48 h 时差异显著（P＜0.05），培养72 h 时差异极显著（P＜0.001）；而牦牛RIFs 中的PDK1则在24～72 h 时均极显著上调（P＜0.001），在24 h 时达到峰值（图4-B）。黑白花牛的HIF-1α和Smad2在低氧培养至72 h 时极显著上调，而牦牛则在24 h 达到峰值，随后下调至与对照无显著差异。AKT1基因在黑白花牛RIFs 低氧培养至48 h 时表达量有显著下调，在牦牛中则在低氧培养24 h 时显著上调（图4-D）。此外，凋亡因子Caspase3在黑白花牛和牦牛RIFs 的不同低氧培养时间均有极显著上调，其中黑白花牛为72 h，牦牛为24 h（图4-E）。另一种凋亡因子Caspase9在低氧培养至48 和72 h 时均极显著上调，但不同的是48 h时牦牛的上调倍数比黑白花牛更高（图4-F）。综上，牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3、AKT1基因整体上于24 h显著上调，之后下调，而黑白花牛基因则整体上随时间呈递增趋势。

图4 PDK1相关基因表达检测Fig.4 Expression detection of PDK1 related genes

2.5 PDK1、Smad2和Caspase3蛋白表达水平检测

蛋白免疫印迹结果显示在低氧诱导条件下，黑白花牛和牦牛RIFs 中PDK1 蛋白表达量均极显著上调，其中黑白花牛PDK1 蛋白表达量上调倍数随培养时间延长而增加，牦牛的PDK1 蛋白前48 h 也随培养时间延长而增加，但在72 h 时比48 h 有所下降（图5-B）。黑白花牛RIFs 的Smad2 蛋白仅在被低氧培养至72 h时显著上调，牦牛中则在整个低氧培养过程中（24～72 h）均有显著上调（P＜0.01）（图5-C）。两种牛RIFs内的Caspase3 蛋白均上调，但黑白花牛的Caspase3 上调倍数高于牦牛（图5-D）。

图5 PDK1相关蛋白表达检测Fig.5 Detection of PDK1 related protein expression

3 讨论

成纤维细胞的分离培养常用方法包括植块法、胰酶消化法、流式细胞分选法以及免疫磁珠法等［16-17］。本试验选用了对细胞损伤最小的植块法［18］对细胞进行分离，所得原代细胞中成纤维细胞比例约占总数的80%，杂细胞约占总量20%。为获得更纯净的成纤维细胞，利用成纤维细胞贴壁较快的特性［19］，通过差速贴壁的方式，待细胞贴壁率约70%时舍弃剩余的大部分杂细胞和小部分成纤维细胞获得纯度较高的成纤维细胞。细胞免疫荧光染色鉴定所得结果证明本研究选用的原代细胞分离与纯化方法体系可行。本研究选用高糖型DMEM 培养基添加10%新生牛血清进行培养。经验证，差速贴壁法纯化后的RIFs在10代之前的细胞冻存复苏后仍能保持较好的增殖能力，可用于功能验证。

在低氧对糖尿病小鼠模型的研究中，Zheng 等［20］发现低氧会增加糖尿病动物的循环活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量；HIF-1α 在糖尿病动物肾脏及其他缺氧细胞中表达受到抑制。此时，受抑制的HIF-1α 通过下调PDK1 间接调控线粒体呼吸反应，导致线粒体ROS 减少，对糖尿病动物起到肾脏保护和抗细胞凋亡作用［21］。这说明HIF-1α 可通过调控PDK1活性，参与细胞增殖和凋亡过程［1，22］。已有证据表明PDK1、Smad2和Casp3在小鼠和人的信号通路中有直接调控关系并在表型验证中起主要作用［23-24］，且本研究结果中相应基因在牦牛RIFs 和黑白花牛RIFs 间表达差异具有显著性，故本试验选择PDK1、Smad2和Casp3作为主要蛋白靶点进行下一步验证，发现低氧诱导下牦牛PDK1 的基因和蛋白表达均有显著上调，且上调程度均大于黑白花牛；基因层面，牦牛RIFs 低氧处理24 h 时达到峰值，随后显著下调，而黑白花牛则随时间呈递增趋势。不仅证实了低氧对HIF-1α 和PDK1 的上调作用，也证明两种牛对低氧环境的适应性存在差异。

已有研究表明，PDK1通过调控TGF-β可诱导成纤维细胞转化为成肌纤维细胞［25］。此外，在低氧细胞培养研究中发现，低氧通过诱导线粒体中蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的积累和磷酸化，激活AKTPDK1信号，促进PDK1的磷酸化，并上调Smad表达，从而促进TGF-β/Smad信号转导，影响TGF-β的表达［14］。同时，PDK1 与TGF-β 之间存在中间信号分子丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白（serine-threonine kinase receptor-associated protein，STRAP），可与PDK1 形成体内复合物，进而稳定TGF-β/Smad 信号［26］。TGF-β 调控Bcl-2 的表达，抑制细胞凋亡，继而使细胞进一步活化、增殖与迁移，活化的细胞产生大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）［27］。本研究通过检测黑白花牛和牦牛RIFs内Smad2和AKT1基因表达发现，这两种基因在低氧培养的细胞内均呈上调趋势，与前期研究一致［26］，牦牛RIFs 于24 h 达到峰值后下调，黑白花牛RIFs 随时间延长呈递增趋势，进一步证明低氧对牦牛的各因子的诱导作用与平原牛种存在种属差异。此外，两牛种细胞凋亡标志物Caspase3/9 因子的表达差异也符合以上理论，牦牛RIFs 于24～48 h 达到峰值后下调，证明其在短期应激后适应了低氧环境，未出现明显的凋亡趋势，而黑白花牛RIFs 则随低氧培养逐渐上调，出现了明显的凋亡趋势。Zou等［28］通过药物抑制大鼠TGF-β1通路，发现其肾纤维化程度因TGF-β1/Smad3通路的抑制而减轻。此外，前期研究表明，低氧引起的HIF-1α 转录复合物上调可诱导TGF-β 激活［29］。结合本研究中PDK1 和Smad2 在基因和蛋白水平上随低氧而产生的调节预测，低氧诱导的PDK1/TGF-β/Smad2通路激活可能是促使黑白花牛肾纤维化程度加深，引发其肾源性高原疾病的主要原因之一。

Chen 等［23］发现，沉默PDK1 和AKT 等因子会导致细胞的增殖能力降低，Shi 等［30］和Ikushima 等［31］也分别从不同层面证明了TGF-β/Smad 通路在成纤维细胞增殖中的调控作用呈正相关。低氧上调HIF-1α 和PDK1，进而上调下游因子TGF-β/Smad2和AKT1基因的表达量，从而促进了RIFs 增殖能力提高。牦牛在物种进化过程中已产生对低氧环境的适应性，故其肾脏在低氧下的纤维化程度较平原牛更轻［8］，本研究中牦牛RIFs 增殖速度在低氧下比常氧低，可能是肾脏为适应低氧环境对纤维化加深产生抵抗所致。此外，低氧培养至对数生长期后牦牛和黑白花牛RIFs的增殖能力远低于常氧，推测其主要原因是1%浓度的极端低氧启动了TGF-β下游的凋亡相关因子［24，28］，导致Caspase3/9显著上调，打破了低氧下细胞增殖和凋亡的动态平衡，促进RIFs 细胞大量凋亡并引起增殖缓慢。同一因子在mRNA 和蛋白水平表达趋势不一致可能是由于mRNA 与蛋白半衰期不同，低氧应激造成基因层面瞬时变化且在指导蛋白质合成过程中有其他转录因子的参与，从而影响蛋白的最终表达。牦牛和黑白花牛RIFs 的低氧下增殖能力的不同证实了两物种对高原环境的适应性存在差异。但低氧通过以上因子在牛RIFs 内对增殖能力和凋亡等表型的产生差异性作用的原因和具体调控机制仍需进一步研究。

4 结论

低氧下黑白花牛和牦牛RIFs 中HIF-1α、PDK1、AKT1、Smad2和Caspase3/9基因和PDK1、Smad2、Caspase3蛋白表达相较于常氧组存在显著上调，且牦牛RIFs 于低氧24～48 h 达到峰值后下调，黑白花牛则随低氧培养时间增长而逐渐上调，黑白花牛RIFs 低氧下增殖能力明显高于牦牛，以上可能是引起低海拔动物低氧肾纤维化程度加重的原因之一，同时也证明了牦牛对低氧环境具有更好的适应性。