发状根在大豆基因工程中应用的研究进展

于威君+李晓薇+肖洪庆+Aysha+Jameel+侯心悦+李海燕

摘 要：发状根农杆菌Ri质粒侵染植物后诱导大量发状根发生，由此发展起来的遗传转化体系已经成为一项非常重要的转基因技术，并被应用到生命科学的多个领域。大豆是重要的粮食作物和油料作物，也是目前转基因种植面积最大的作物。现有的大豆子叶节、幼胚、胚尖遗传转化体系转化效率低、周期长，而发状根遗传转化体系具有转化效率高、周期短等优点，因此发状根在大豆基因工程研究中被广泛应用。本文综述了近年来发状根在大豆基因工程中的应用研究进展。

关键词：发状根；大豆；基因工程；分子育种

中图分类号：Q-1 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170206001

大豆在我国与稻谷、玉米和小麦共同构成了四大粮食作物，同时大豆在农业生产和食物消费系统中占有重要的地位和作用[1]。近年，全球转基因大豆的种植面积已是转基因品种种植面积最大的作物。可见，转基因技术已成为大豆新品种培育的重要手段。目前应用的大豆遗传转化技术主要是以子叶节、幼胚、胚尖作为外植体，转化后诱导大豆再生植株。但是，这些方法周期较长且转化效率低，不利于快速鉴定相关基因在大豆育种中的应用潜力。发状根农杆菌介导的大豆遗传转化体系，因其周期短、转化效率高且不易产生变异等优点，越来越受到重视。本文就发状根转化体系在大豆基因工程中的应用研究做一综述，展望该项技术的应用前景，为大豆育种工作者们提供一些有用信息。

1 发状根遗传转化体系概述

发状根农杆菌中含有Ri质粒，与根癌农杆菌中的Ti质粒类似，上面含有T-DNA区，侵染植物后，T-DNA区能够转移并整合进植物的基因组中。发状根农杆菌转化侵染植物后，在侵染部位或四周产生大量的发状根，而且所产生的发状根能够合成该植物特征的次生代谢产物，因此发状根可作为植物次生代谢产物的生物反应器。另外，通过单细胞分化而来的发状根变异性低，能够稳定遗传，且更容易获得再生的转化植株，因此该项技术自产生以来迅速被应用到基因功能的研究和品种改良等。据统计有200多种植物[2]可被诱导出发状根，大多集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、伞形科、豆科、石竹科和蓼科等草本植物中，而木本植物较少有成功转化的报道[3]。这就意味着，发状根遗传转化技术在植物界，尤其是在草本植物中，具有广阔的应用前景。

发状根诱导培养过程并不复杂。发状根农杆菌侵染植物组织创伤部位（叶片、茎段、叶柄、根切片等）和发状根农杆菌共培养，其Ri 质粒中的T-DNA区转移并整合到植物基因组上。经过一段时间培养，植物组织的创伤部位诱导产生发状根。接下来按一定长度剪下发状根，转移到固体培养基上继代培养多次，以消除共培养残留的农杆菌。把每个发状根系转移到液体培养基中培养，或者进一步诱导再生出转化植株。通常认为创伤组织上，每个萌发的发状根代表一个发状根系[4]。

2 发状根在大豆基因工程中的应用

2.1 大豆发状根用于启动子的功能研究

大豆发状根转化体系具有周期短、转化效率髙、单细胞分化的发状根变异性低等优点。通过启动子在大豆发状根中可以快速表达的特性，揭示其在大豆自身中的表达活性。植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。而根特异表达基因的获得，是进一步研究其启动子如何进行基因组织特异表达的基础。现有报道，通过抗大豆孢囊线虫（SCN）诱导合成启动子，驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）在发状根中表达，验证了该合成启动子是诱导型启动子[5]。通过大豆水通道蛋白基因（GmTIPp）启动子及其缺失片段的启动子调控报告基因（GUS）在发状根中表达，进一步了解GmTIPp启动子的特异核心序列区域 [6]。发现在发状根中接种根瘤后，大豆胞外复合物（GmExo70J7、GmExo70J9）启动子的活性受到显著的抑制[7]。大豆硫转运蛋白基因（GmSULTR）启动子截取部分片段序列作为启动子，具有驱动下游GUS基因在发状根中表达的功能，而且在根毛、根表皮和中柱内表达且启动活性比CaMV35S启动子的启动活性弱[8]。在大豆发状根中比较玄参花叶病毒（FMV）启动子，木薯叶脉花叶病毒（CsVMV）启动子，草莓镶脉病毒（SVBV2）启动子，35S和E35S启动子驱动GUS基因的表达活性，证明FMV启动子在根中是强表达[9]。在大豆发状根中验证大豆疫霉诱导性基因（GmaPPO12、 GmaPR1）启动子功能，可用于转基因植物，增强对疫霉病病原体的抗性[10]。在大豆发状根中通过GUS活性测定，得到改造的乙醇脱氢酶基因（Adh）启动子可由缺氧诱导，但低温，创伤或ABA不能诱导。得到的Adh启动子可用于转基因实验中缺氧诱导的表达，以改善植物对水淹或缺氧胁迫的耐受性[11]。在大豆发状根利用光响应性验证了甲基转移酶（rbcMT-T）启动子片段对报告基因的表达能力[12]。克隆的大豆脯氨酸富集蛋白基因（GmPRP2）启动子，其表达模式表明该启动子在大豆的发状根中是根优先的。可用于提高对病原体，害虫，营养不良和其他非生物胁迫的根抗性或耐受性，减少大豆生产中的大量年产量损失[13]。

2.2 大豆发状根用于研究调控基因

大豆发状根多用于功能基因的分析尤其是抗性基因的检验，其中抗性中以旱生、耐盐碱研究为主。在发状根中氢离子焦磷酸酶类基因（GmVP）过表达能提高盐胁迫下发狀根的相对伸长率，提高发状根的耐盐性，并能提高SOD、POD、CAT活性和减低MDA含量[14]。通过对转Na+/H+逆向转运蛋白基因（GmNHX1）、Cl-/H+逆向转运蛋白基因（GmCLC1）、紫色酸性磷酸酶基因（GmPAP3）发状根的功能分析，表明其能够显著提高转基因发状根的耐盐性[15]。在发状根中，RNA沉默的大豆MYB转录因子基因（GmMYB176）导致异黄酮水平降低，显示GmMYB176是异黄酮类生物合成所必需的[16]。对转大豆20ZF转录因子基因Gm20ZF-1-RNAi基因的发状根进行异黄酮含量检测，发状根中异黄酮含量显著下降，表明Gm20ZF-1与大豆异黄酮的积累有关[17]。大豆膨胀素基因（GmEXPB2）参与发状根伸长，而影响植物生长和磷吸收，特别是在低磷水平。这一发现在改善农业作物的生长上具有很大的应用潜力[18]。

2.3 大豆發状根用于其他研究

利用大豆发状根表达蛋白可以更加简易，量产。通过大豆发状根成功生产表达人碱性成纤维生长因子（bFGF），研究证明发状根能够通过无性繁殖稳定遗传，转基因大豆发状根可作为生物反应器制备，也是安全的，同时为利用发状根生产药物实现工业化提供实验基础[19]。CRISPR/Cas9介导的基因组修饰的每个靶基因座的效率可以利用其在发状根中的表达进行快速地评估[20]。通过用大豆查耳酮合酶（CHS6）或异黄酮合成酶（IFS2）基因转化，在发状根中改变异黄酮的合成而影响植物抗毒素的合成，得到植物抗毒素在植物中对真菌感染反应中的重要作用的新证据[21]。大豆胞囊线虫转化大豆发状根可以完成其整个生命周期表达GFP。该系统可以测试基因是否抗大豆胞囊线虫病，得到抗病植株[22]。

3 展望

全球气候变化加剧，我国严寒、高温、干旱、洪涝灾害频发，同时自然灾害会引发一系列病虫灾害，生物胁迫与非生物胁迫共同威胁着大豆的产量与品质。目前正通过遗传学、分子生物学等微观层面研究大豆相关胁迫机制，并鉴定重要基因的功能，利用生物技术，生物工程手段等提高大豆的抗病抗逆性及品质，得到优良的大豆品系。发状根的发展历史虽短，但是已经深入基础研究，目前可用于培养物生产有用的活性物质，作为研究根系相关基因的验证系统，为改善大豆根的特性提供依据，如能通过组织培养大豆发状根获得再生植株，则开辟了大豆高效遗传转化的新途径，提高了大豆转化效率，为大豆育种提供新的方法，同时可以用于快速鉴定大豆相关的基因功能。大豆发状根正在广泛应用于大豆品种的改良研究，为改良大豆提供依据，获得长势更好，产量更高，抗逆性更强的新植株提供实验基础。但是开展大豆转基因品种选育和基因功能研究仍有许多限制因素需要解决。

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