光合作用抑制剂DCMU对三角褐指藻岩藻黄素含量和叶绿素荧光特征及关键基因表达的影响

郑小恽 龚一富 李申睿 方清姝 王何瑜 唐道军

(1宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315832；2宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315832)

岩藻黄素(fucoxanthin)是一种在藻类中普遍存在的类胡萝卜素。 研究表明，岩藻黄素具有多种促进健康的功能，如抗氧化[1]、抗肥胖[2]、抗糖尿病[3]、降血压[4]和抗癌[5]等。 其中，岩藻黄素的抗氧化特性被认为是发挥作用的主要原因[6]。 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)属于硅藻门(Bacillariophyta)，是研究硅藻的模式藻类之一。 研究表明，三角褐指藻含有一定量的岩藻黄素，具有生长繁殖速度快、环境适应能力强等特点[7]。 硅藻是光合自养型生物，它们每年通过光合作用可为地球制造约20%的原初生产力[8]，这与硅藻细胞内含有的捕光复合物岩藻黄素与叶绿素a/c 结合蛋白(fucoxanthin Chl a/c binding proteins，FCPs)密不可分。 FCPs 能够吸收蓝绿区域中的光线，较好地进行光吸收和光传递[9]，在光合作用通路中发挥重要作用。 岩藻黄素与光合作用色素叶绿素a 和叶绿素c 结合形成FCPs，这是否表明岩藻黄素含量与光合作用相关? 是否能明确光合作用的增减会影响岩藻黄素含量? 尚未明确。 因此，探明两者之间的相关性更有利于探明岩藻黄素生物合成的调控机理。

二氯苯基二甲脲(DCMU)，又名敌草隆，是一种特异性强、灵敏度高的人工合成的光合作用抑制剂[10]。它可以结合到光系统Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)反应中心QB的结合位点上，影响电子从QA传递到QB，从而阻断质体醌与PSⅡ之间的电子传递，使光合作用无法正常进行[11]。 DCMU 作为除草剂在农业上已有较为广泛的运用，但其会残留在土壤中破坏植物的光合作用[12]，而且会流入水体造成危害[13]，浮游生物首受其害[14]。 但DCMU 是否抑制三角褐指藻的光合作用，进而影响三角褐指藻岩藻黄素的含量，目前还鲜见相关报道。

本研究采用不同浓度DCMU 处理三角褐指藻，以探究外源DCMU 对三角褐指藻中岩藻黄素含量、叶绿素含量和叶绿素荧光特征及相关关键基因表达的影响，探究三角褐指藻应对光合作用条件变化调节自身岩藻黄素含量的机制，即岩藻黄素的生物合成与光合作用之间的关系。 以期通过改变光合作用效率来改变三角褐指藻岩藻黄素含量，为通过调控光合作用效率来规模化生产岩藻黄素奠定一定的理论基础，也为探明三角褐指藻岩藻黄素积累的生理生化和分子机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 三角褐指藻藻种

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由宁波大学教育部海洋生物工程重点实验室藻种室提供。

1.2 三角褐指藻的培养与DCMU 胁迫处理

试验藻用f/2 培养基培养于250 mL 三角瓶中，置于光照培养箱中培养[15]。 具体培养条件参考刘浩等[16]的方法。 在三角褐指藻培养第4 天时，分别用0(CK)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg·L-1DCMU 处理三角褐指藻。

1.3 三角褐指藻生长曲线的测定

三角褐指藻的标准生长曲线参考徐润洁等[15]的测定方法。 从胁迫处理试验初始，每天定时利用UV-5200 型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定三角褐指藻藻液OD680值。 根据标准生长曲线计算各处理组对应的细胞密度，建立不同浓度DCMU 处理后三角褐指藻的生长曲线。

1.4 三角褐指藻岩藻黄素含量的测定

在三角褐指藻进入平台期后利用有机溶液提取法提取岩藻黄素。 具体提取方法和岩藻黄素含量计算方法参考文献[17]。

1.5 三角褐指藻叶绿素含量的测定

取生长至平台期末的藻液，利用乙醇提取测定叶绿素含量。 取30 mL 藻液，5 000 r·min-1离心10 min，保留沉淀，即藻泥。 按藻泥∶95%乙醇=0.2 g ∶10 mL的比例在藻泥中加入95%乙醇，避光浸提24 h 至藻体发白，5 000 r·min-1离心10 min 后弃沉淀，利用UV-5200 型紫外分光光度计测定上清液A645和A663吸光值。 按照公式计算三角褐指藻叶绿素含量(C):

1.6 三角褐指藻叶绿素荧光参数的测定

取经24、48 和72 h 处理的各组三角褐指藻藻液1 mL，暗适应10 min 后测量诱导曲线。 在Water-PAM 叶绿素荧光仪(德国WALZ 公司)上可读出PSⅡ最大光化学效率(Fm/Fv)、PSⅡ实际光化学量子效率[Y (Ⅱ)]、光化学淬灭系数(photochemical quenching，qP)、非光化学淬灭系数(non-photochemical quenching，NPQ)、相对电子传递速率(relative electron transport rate，rETR)和快速光曲线初始斜率(α)。

1.7 三角褐指藻总RNA 的提取及岩藻黄素、光合作用相关合成通路的基因表达分析

三角褐指藻岩藻黄素合成通路关键基因番茄红素β-环化酶基因(lcyb)和八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)及光合作用PSⅡ通路的关键基因D1 蛋白基因(psbA)、Rubisco 酶大亚基基因(rbcL) 采用Primer Premier 5.0 软件设计荧光定量引物序列(表1)，内参Actin的基因序列参考文献[19]。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

取100 mL 三角褐指藻藻液(DCMU 处理24 h)，在5 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min，收集底部沉淀后提取三角褐指藻总RNA，然后将RNA 进行反转录得到cDNA。 用β-actin为内参基因，目的基因和内参基因反应体系和程序相同。 荧光定量反应体系参考徐润洁等[15]的反应体系。 运用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.8 数据统计与分析

运用Mircosoft Office Excel 2013 和SPSS 22.0 分别对三角褐指藻细胞密度、岩藻黄素含量、叶绿素含量、叶绿素荧光参数及关键基因的表达水平进行数据分析。 设3 次生物学重复。 使用皮尔森(Pearson)相关系数来分析DCMU 处理后岩藻黄素含量与相关叶绿素荧光参数之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 DCMU 浓度对三角褐指藻细胞生长、岩藻黄素和叶绿素含量的影响

由图1-A 可知，随着DCMU 浓度的增加，三角褐指藻细胞生长速率较CK 明显下降，且当DCMU浓度为1. 0 mg·L-1时，DCMU 对藻细胞生长的抑制作用最明显。 试验过程中出现了藻体发白、大量死亡的现象。 表明DCMU 会抑制三角褐指藻的细胞生长。

由图1-B 可知，随着DCMU 浓度的增加，三角褐指藻岩藻黄素含量总体呈下降趋势，不同浓度DCMU处理均降低了三角褐指藻内岩藻黄素含量，且当DCMU 浓度超过0.4 mg·L-1后，其极显著抑制了盐藻黄素含量(P＜0.01)；当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，岩藻黄素含量最低，较CK 降低了26.98%。 表明DCMU 可抑制三角褐指藻中岩藻黄素的生物合成及积累。

由图1-C 可知，当DCMU 浓度为0.1～0.8 mg·L-1时，不同浓度DCMU 均提高了三角褐指藻内叶绿素含量，叶绿素含量增长率在26.78%～47.95%之间。 当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，叶绿素含量极显著升高(P＜0.01)，较CK 增加了167.81%。 说明，在一定浓度范围内，DCMU 可促进三角褐指藻内叶绿素含量的积累。

2.2 DCMU 浓度对三角褐指藻叶绿素荧光特征的影响

由图2 可知，随着DCMU 浓度的增加，Fv/Fm并未发生显著变化，Y(Ⅱ)、rERT、NPQ、qP 和α 数值均呈下降趋势。 其中，在DCMU 处理48 h 后NPQ 和Y(Ⅱ) 数值，DCMU 处理24 h 后rETR、qP 和α 数值，均在DCMU 浓度达到0.2 mg·L-1后显著降低(P＜0.05)。 随着DCMU 处理时间的增加，NPQ、qP 和rETR 都有小幅度的增加，但不显著，而Y(Ⅱ)和α基本保持不变。

2.3 DCMU 浓度对岩藻黄素合成和光合作用相关基因表达的影响

图1 DCMU 浓度对三角褐指藻细胞生长、藻岩藻黄素含量和叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of DCMU concentration on cell growth，fucoxanthin content and chlorophyll content ofPhaeodactylum tricornutum

由图3 可知，DCMU 处理后岩藻黄素生物合成关键基因pds、lcyb及光合作用相关基因rbcL的表达量均极显著低于CK，说明DCMU 抑制岩藻黄素合成与岩藻黄素合成途径以及光合作用相关通路基因的表达有关。 当DCMU 浓度为0.1 ～0.4 mg·L-1时，psbA表达水平低于CK，且随着DCMU 浓度的增加呈上升趋势；当DCMU 浓度为0.8 mg·L-1时，psbA表达水平较CK高，且当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，psbA表达极显著上调(P＜0.01)。

2.4 岩藻黄素含量与叶绿素荧光参数的相关性分析

图2 DCMU 浓度对三角褐指藻叶绿素荧光特征的影响Fig.2 Effect of DCMU concentration on chlorophyll fluorescence characteristics of Phaeodactylum tricornutum

图3 DCMU 浓度对三角褐指藻岩藻黄素、光合作用相关合成通路的基因表达的影响Fig.3 Effects of DCMU concentration on gene expression of fucoxanthin and photosynthesis-related synthetic pathways

对三角褐指藻岩藻黄素含量与叶绿素荧光参数中除Fv/Fm外其他有明显变化的参数进行相关性分析，当DCMU 浓度为1 mg·L-1时藻体大量死亡，参考意义较小，故剔除对应数据。 相关性分析结果表明(表2)，岩藻黄素含量与Y(Ⅱ)、qP 和α 数值之间存在显著正相关性，与rERT 和NPQ 无显著相关性。 上述结果表明，三角褐指藻岩藻黄素合成与光合作用相关，但不同的光合作用机理和生理状况之间存在差异。

表2 岩藻黄素含量与叶绿素荧光参数之间的相关系数Table 2 Correlation coefficient between fucoxanthin content and chlorophyll fluorescence parameters

3 讨论

PSⅡ是类囊体膜中进行光吸收的叶绿素-蛋白质复合体，具有吸收光能和光传递的作用。 P680 是原初电子供体，位于D1 和D2 蛋白上，之后电子依次传递到去镁叶绿素(Pheo)、QA和QB[20]。 而DCMU 的作用机理则是打断QA到QB的电子传递，从而影响植物的光合作用，且是不可逆过程[21]。 李今等[22]研究发现，10 μmol·L-1DCMU 会抑制铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的细胞生长；张继民等[23]发现，当DCMU浓度达到 0.8 μmol·L-1时，眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata) 的细胞生长抑制率达到80%。 本研究也发现，DCMU 胁迫下三角褐指藻的细胞浓度明显低于对照组，当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，出现了藻体死亡的现象，可能是因为三角褐指藻为光合自养型生物，而DCMU 阻断了藻细胞正常的光合作用，营养物质无法合成，导致生长速率慢、死亡率增加。

岩藻黄素是天然类胡萝卜素中的一种，在硅藻中属于次生代谢产物，能够在光合作用中辅助吸收光能[24]。 Sivan 等[25]发现对照组紫球藻(Porphyridiumsp.UTEX 637)的色素含量低于DCMU 抗性株。 本研究结果表明，岩藻黄素含量随着DCMU 浓度的增加而降低，当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，岩藻黄素含量较对照组下降了26.98%，说明添加DCMU 使次生代谢途径中岩藻黄素的合成受阻，推测是由于光合作用被抑制，导致岩藻黄素前体物质合成不足。

叶绿素是光吸收环节中的核心物质，是光合作用中最重要的色素之一。 本研究发现不同浓度的DCMU均能有效提高三角褐指藻内叶绿素含量，这与岩藻黄素含量变化相反。 可能是因为DCMU 抑制了光合作用吸收光能之后的电子传递过程，使后续的反应缺少能量无法进行，植物体可能通过负反馈调节来弥补这种不足，即试图提高叶绿素含量从而吸收更多的光能进行传递。 此外，DCMU 除了具有打断光合作用电子传递的作用，还可抑制叶绿体活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[26]。 植物体内的ROS 具有抗逆信号转导的作用[27]，但过量的ROS 积累会使蛋白质氧化活性降低。 孙锦等[28]发现海水胁迫下菠菜叶绿体内的ROS 与叶绿体代谢密切相关，ROS 可使叶绿体降解；罗黄颖等[29]也发现NaCl 胁迫处理会使番茄幼苗内的ROS 积累。 植物体内的各种生理生化反应是非常复杂的，原本植物体内ROS 含量增加，对叶绿素有降解现象，但DCMU 在一定程度上抑制了ROS 的产生，从而出现叶绿素含量上升的现象。 DCMU 对不同藻类的叶绿素含量的作用效果不尽相同，余利红等[30]也发现DCMU 对鱼腥藻(Anabaenasp.PCC7120)的叶绿素有显著的抑制作用，而对集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)的叶绿素无明显影响。 当DCMU 浓度为1.0 mg·L-1时，叶绿素含量极显著上升，较对照组增加167.81%，推测是由于藻体大量死亡，植物体内叶绿素积累。

岩藻黄素与叶绿素a 和c 组成捕光复合物FCPs，在光合作用中起到重要的作用。 而本研究发现DCMU处理后，处理组盐藻黄素含量总体较对照组降低，而叶绿素含量上升，这可能是因为，虽然它们共同组成捕光复合物，但叶绿素在其中起到更主要的作用，所以植物在逆境胁迫下，体内更多的物质和能量被用于合成叶绿素。 有关逆境胁迫下岩藻黄素和叶绿素合成的相关机制、它们在FCPs 中如何发挥作用以及在其中的地位还待有进一步深入研究。

叶绿素荧光技术可以快速、灵敏地测定植物光合作用对逆境的应答机制[31]。 刘晶等[32]发现用4 μmol·L-1DCMU 处理普通小球藻和铜绿微囊藻能获得差异显著的叶绿素荧光诱导曲线；Gaevsky 等[33]采用DCMU 诱导的荧光方法鉴定浮游植物藻类的具有生态学意义的显性优势群。 DCMU 会抑制PSⅡ通路的电子传递效率，本研究中，随着DCMU 浓度的增加，除Fv/Fm外各荧光参数均呈下降趋势，电子传递速率降低，光保护能力减弱，甚至在DCMU 浓度为1 mg·L-1时出现电子完全阻断现象；随着处理时间的延长，qP、NPQ 和rETR 有小幅度的增强，而三角褐指藻内的实际光合效率基本不变。 推测加入DCMU 后PSⅡ的光合作用的能力可能并未发生巨大变化，但降低了实际光合作用强度，随着处理时间的增加，DCMU 的作用功效减弱。

pds和lcyb是岩藻黄素合成通路中的关键基因，不同浓度DCMU 处理下，其表达量下调，说明岩藻黄素含量的下降是基因表达的结果。 光合作用合成的相关基因psbA是光合作用PSⅡ反应中心复合物(D1-D2-Cy599)的D1(32KD)蛋白的编码基因[34]，rbcL是Rubisco 酶的大亚基基因[35]，D1 蛋白和Rubisco 酶在电子传递链中分别位于DCMU 电子打断处的上、下游。PSbA与rbcL基因表达水平都呈现先下调后上调的趋势，推测是由于DCMU 打断了电子链传递造成电子传递不畅，rbcL和psbA的表达在低浓度DCMU 处理时被抑制，而当电子传递被抑制到一定程度时，出于自我保护机制，进行负反馈调节，基因表达水平有所上调。

本研究结果表明，三角褐指藻内岩藻黄素的含量与实际光合效率、光化学淬灭和光器官光能利用率之间存在显著正相关性(P＜0.05)，而与相对电子传递速率和非光化学淬灭系数并不显著，说明三角褐指藻内岩藻黄素的生物合成与积累与光合作用有关，但不同生理状况起到的作用不尽相同，其中光化学淬灭和光器官光能利用率与岩藻黄素合成的调控过程相关性更高。 臧正蓉等[36]研究也指出，7 200 lx 的光照强度可促进三角褐藻内岩藻黄素含量的积累，但并未对岩藻黄素及光合作用通路之间的相关性进行探究。

4 结论

本研究发现外源DCMU 可抑制三角褐指藻的细胞生长，并随着DCMU 浓度的增加，其抑制效果增强。高浓度DCMU 处理，岩藻黄素含量极显著降低，而叶绿素含量显著上升。 三角褐指藻的荧光参数Y(Ⅱ)、rETR、qP 和α 随着DCMU 浓度的增加而降低。 岩藻黄素合成关键酶基因pds、lcyb及光合作用相关基因rbcL的表达水平也与其含量变化趋势相同。 三角褐指藻内岩藻黄素含量与实际光合效率、光化学淬灭和光合器官光能利用率的相关性进一步说明岩藻黄素含量与光合作用有关。 本研究为进一步探明三角褐指藻岩藻黄素生物合成机理，明确光合作用与岩藻黄素含量的相关性提供了理论依据，也为提高三角褐指藻内岩藻黄素含量提供了一定的思路。