稳定同位素指纹分析在车厘子产地溯源中的应用

金 俊 郑方媛 周秀雯 潘家荣

(中国计量大学生命科学学院/浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室/海洋食品加工质量控制技术与仪器国家地方联合工程实验室，浙江 杭州 310018)

对于农产品而言，产地对其品质有着重要的影响。随着国内与国际贸易系统的不断发展，消费者可消费的农产品越来越多区域化，不同产地同一产品的价格差异滋生了很多“冒名顶替”现象。 农产品产地溯源系统的建立不仅有利于加强市场的监管，保护地方名牌优质产品，还可在出现安全问题时快速锁定污染源，控制安全隐患[7]。 目前，可作为农产品产地溯源的指标较多[8-10]，包括同位素组成、矿物质含量和组成、波谱指纹等。 由于农产品深受各种地理因素如水分、气候、地质等的影响，不同产区的农产品具有特异的地理标志特征，而与产地环境息息相关的稳定同位素越来越多地被应用于农产品的产地溯源。 如Federica等[11]通过测定脂肪和脱脂鱼片中稳定同位素δ13C、δ2H、δ18O、δ15N 和δ34S 来追踪意大利北部弗留利威尼斯朱利亚和特伦蒂诺两大地区的虹鳟鱼，地理起源判别准确率高达91%。 邵圣枝等[12]采用稳定同位素质谱和电感耦合等离子体质谱测定黑龙江、江苏和辽宁3 个省份的稻米中同位素比率和矿物元素含量，并结合主成分分析-线性判别分析(principal component analysis-linear discriminant analysis，PCA-LDA)法进行产地判别分析，准确率为91%。 吴浩等[13]采用气相色谱-燃烧-同位素质谱的方法测定了来自法国、澳大利亚、美国和中国4 个国家的葡萄酒中5 种易挥发组分中的δ13C 值，发现依靠挥发组分中单一的δ13C 指标就能有效地区分4 个产区的葡萄酒。 黄岛平等[14]利用稳定同位素比率质谱仪测定了来自广西、湖南、福建、四川4个地区的柑橘果汁中δ13C 和δ2H 值，发现各地区果汁间的δ13C 和δ2H 值存在极显著差异，可以根据果汁中的δ13C 和δ2H 值来推断柑橘产地。 目前，稳定同位素已较为普遍地被应用于农产品的产地溯源，尤其是δ13C、δ2H 和δ18O 的产地溯源技术研究历史较长，然而大多数研究采用的是食品整体的同位素组成指标[15-16]。通过提取食品中的某单一组分进行同位素溯源可以减少基体组分的影响[17-18]，提高食品产地溯源的准确率，但目前相关报道还较少。 本研究拟测定不同产地车厘子的蛋白质和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 的差异以验证利用稳定同位素分析追溯车厘产地的可行性，为日后建立完整的车厘子产地溯源系统提供有力支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

车厘子样品采自澳洲、美国、智利和我国山东4 个地区。 本着准确性、随机性原则，通过出入境渠道分区域随机采集每个产地新鲜车厘子样品2 kg，分装标记，样品分2 批采集。

三氯乙酸、聚乙烯吡咯烷酮，生工生物工程(上海)股份有限公司；丙酮，杭州双林化工试剂有限公司；β-巯基乙醇，上海吉至生化科技有限公司；石油醚，杭州高晶精细化工有限公司。

1.2 主要仪器与设备

800Y 粉碎机，博欧制品五金有限公司；SH-25 真空冷冻干燥机，湖北思昊科学仪器有限公司；Microfuge 20R 高速冷冻离心机，江苏省科学器材有限公司；HH-5015 恒温水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司；vario PYRO cube 元素分析仪，德国Elementar 公司；isoprime 100 同位素质谱仪，英国Isoprime 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 每个产地随机选取40 个车厘子样品，其中20 个用于蛋白质提取，其余用于脂肪提取。人工分离样品的果肉和果核两部分，并对分离的果肉进行粉碎，粉碎样品经-80℃预冷3 h 后于冻干机内在5 Pa 真空度下冻干24 h 至干粉状态，所得样品粉末标记备用。

1.3.2 蛋白质提取 参考植物蛋白质提取方法[19-22]，选用三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)和丙酮提取车厘子样品中的蛋白质。 称取冻干样品5 g，加5 倍-20℃预冷的丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)、TCA和10% 样品重的聚乙烯吡咯烷酮( polyvinyl pyrrolidone，PVP)，混合摇匀，-20℃静置沉降1 h，10 000 r·min-1离心20 min，去上清，沉淀加入10 mL-20℃预冷的丙酮(含0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃静置沉降1 h，10 000 r·min-1离心20 min，取上清，重复洗涤沉淀2～3 次，沉淀经-80℃预冷3 h 后于冻干机内在5 Pa 真空度下冻干得蛋白质。 该方法提取的蛋白质为多种蛋白质混合的粗蛋白，参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[23]测定提取物中的蛋白质，每个样本取20 mg 蛋白质备用。

1.3.3 脂肪提取 参考植物脂肪提取方法[24-26]，选用石油醚浸提的方法提取果肉中的脂肪。 称取10 g冻干样品、加入100 mL 石油醚，混匀，室温下于通风橱中静置12 h，10 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，再向沉淀中加入石油醚浸提重复2 ～3 次，收集每次离心后的上清液于试管中，50℃水浴至重量不再变化即为脂肪。 该方法提取的脂肪为多种脂肪混合的粗脂肪，参照《GB 5009.6-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[27]测定提取物中的脂肪，每个样本取20 mg 粗脂肪备用。

1.3.4 稳定同位素δ13C、δ2H 和δ18O 的测定

1)8号煤层结构简单，埋深较浅，含气量高且具有“中部高，水公河向斜轴部高，加戛背斜轴部低”的分布特点。中部构造简单，属“汇水洼地”，且发育泥岩伪顶，多因素综合作用使得煤层含气量高；水公河向斜轴部构造简单，水位普遍较低，水动力条件弱，煤层埋深大，有利于煤层气的聚集赋存，煤层含气量较高；加戛背斜轴部构造复杂，断裂发育，且水位较高，有向中部运移的趋势，不利于煤层气的赋存，煤层含气量较低。

1.3.4.1 稳定同位素δ13C 的测定 采用元素分析-同位素比率质谱(elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)测定车厘子中δ13C 值。 称取1～2 mg 待测样品于锡箔杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，通过自动进样器送入元素分析仪，样品中的C 元素燃烧转化为纯净的CO2气体，再经稀释仪稀释后进入同位素质谱仪进行检测。 检测参数:元素分析仪的He吹扫流量为230 mL·min-1，载气He 的流量为100 mL·min-1，燃烧炉和还原炉温度分别为900℃和650℃；同位素质谱仪的检测时间为550 s，CO2做参考气，δ13C 的相对标准为V-PDB[28]。

1.3.4.2 稳定同位素δ2H 和δ18O 的测定 采用元素分析仪/高温裂解- 同位素比率质谱(elemental analyzer/high temperature pyrolysis-isotope ratio mass spectrometry，EA/HT-IRMS)测定车厘子中δ2H 和δ18O值。 称取0.2～0.4 mg 待测样品于银杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，通过自动进样器将样品送入元素分析仪，样品经裂解炉高温裂解后，其中的H 和O 元素被玻璃碳转化为H2和CO，随后产生的H2和CO 进入同位素质谱仪进行检测。 检测参数:载气He 的流量为125 mL·min-1，裂解炉温度为1 450 ℃；同位素质谱仪的检测时间为950 s，O2和H2做参考气，δ18O 和δ2H 的相对标准为V-SMOW[29]。

稳定同位素比率的计算公式为:

式中，R 为重同位素与轻同位素丰度比，即13C/12C、2H/1H、18O/16O。

1.4 数据分析与模型建立

利用SPSS 22.0 软件对数据进行差异性分析、判别分析和制图分析。 采用Fisher 线性判别分析和逐步判别分析方法选取最佳的指标组合建立判别模型，并验证模型的准确性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 不同产地车厘子蛋白质、脂肪中δ13C、δ2H 和δ18 O 的差异

由图1 可知，不同产地车厘子果肉蛋白质和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 值变化范围不同，其中δ13C、δ18O的变化范围较小，δ2H 的变化较大。 蛋白质中δ13C 的平均值范围为 -31.62‰～-28.48‰，差异范围为0.36‰～3.14‰；δ2H 的平均值范围为-86.21‰～-68.44‰，差异范围为4.37‰～17.77‰；δ18O 的平均值范围为24.05‰～25.94‰，差异范围为0.41‰～1.89‰。 脂肪中δ13C 的平均值范围为-32.84‰～-31.14‰，差异范围为0.52‰～1.70‰；δ2H 的平均值范围为-123.65‰～-112.23‰，差异范围为0.83‰～11.42‰；δ18O 的平均值范围为22.06‰～24.21‰，差异范围为0.59‰～2.15‰。 表明，基于果肉蛋白质和脂肪中δ13C、 δ2H 和δ18O 判别车厘子产地具有一定可行性。

图1 不同产地车厘子蛋白质和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 的值Fig.1 The values of δ13C，δ2H and δ18O in the protein and fat of the cherries from different origins

由表1 可知，不同产地车厘子样品的蛋白质中，澳洲样品的δ13C 值为-28.48‰，显著高于其他3 个产地，美国样品的δ13C 值最低，为-31.62‰；4 个产地车厘子样品的δ2H 值互相间均存在显著差异；4 个产地车厘子样品的δ18O 平均值范围为24.05‰～25.94‰，其中澳洲样品的δ18O 值显著低于其他3 个产地，山东样品的δ18O 值最高，与智利和澳州样品存在显著差异。

不同产地车厘子样品的脂肪中，美国样品的δ13C值最高为-31.14‰；各产地样品果肉脂肪中的δ2H 值差异范围较大，为0.83‰～11.42‰，仅智利与山东产地样品间无显著差异；美国样品δ18O 值仅为22.06‰，显著低于澳洲与山东样品。

2.2 基于不同组分中单一同位素指标的车厘子产地的判别分析

由表2 可知，不同产地车厘子蛋白质中3 种同位素的初始判别准确率为56.3%～81.3%，交叉验证判别准确率为56.3%～75.0%；脂肪中3 种同位素的初始判别率为50.0%～75.0%，交叉验证判别准确率为43.8%～56.3%。 6 个指标的初始判别准确率从高到低依次为:δ2H(蛋白质)＞δ2H(脂肪)＞δ18O(蛋白质)＞δ13C(蛋白质)＞δ13C(脂肪)/δ18O(脂肪)，交叉验证判别准确率从高到低依次为:δ2H(蛋白质)＞δ18O(蛋白质)＞δ13C(蛋白质)/δ2H(脂肪)＞δ18O(脂肪)＞δ13C(脂肪)。 表明，不同产地车厘子的蛋白质和脂肪2 种组分中均是δ2H 的判别准确率最高，但初始判别准确率最高仅为81.3%，交叉验证判别准确率仅为75.0%，单一同位素指标对车厘子产地的判别效果并不理想。

2.3 基于单一同位素指标的车厘子产地的判别分析

结合蛋白质、脂肪中相同的同位素进行产地判别分析，由表3 可知，各同位素的产地判别准确率为:δ2H＞δ18O ＞δ13C，其中δ2H 的判别准确率要远高于δ18O 和δ13C，初始判别准确率和交叉验证判别准确率分别达到了93.8%、87.5%。 表明，结合蛋白质和脂肪中的同位素指标可初步实现车厘子的产地判别，判别效果优于单一组分中同位素指标的判别。

2.4 基于不同组分中δ13C、δ2H 和δ18O 组合指标的车厘子产地的判别分析

表4 分析比较了蛋白质、脂肪对车厘子样品产地的判别效果，依靠脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 3 个指标组合的产地初始判别准确率达到了100.0%，但交叉验证判别准确率仅为68.8%；而依靠蛋白质中δ13C、δ2H和δ18O 3 个指标组合的产地交叉验证判别准确率达到了87.5%，但初始判别率仅为87.5%，低于脂肪的100.0%。 表明，2 种成分的产地判别效果明显不同。

表3 不同组分的单一同位素指标组合对车厘子产地判别的准确率Table 3 Accuracy of the discrimination of cherries by the combination of single isotope index in different components /%

2.5 基于多个指标组合的车厘子产地的判别分析及溯源模型的建立

对车厘子蛋白质、脂肪中的δ13C、δ2H 和δ18O 值6项指标进行逐步判别分析，筛选重要的建模变量。 在显著性水平下，6 项指标中有3 项被引入到判别模型中，引入的先后顺序依次为蛋白质中的δ2H＞脂肪中的δ2H＞蛋白质中的δ18O，说明这3 项指标对判别函数均有显著性作用。 由表5 可知，随着指标的加入，样品产地初始判别准确率由81.3%提高至100.0%，交叉验证判别准确率由75.0%提高至93.8%，当选用的指标达到3 个(蛋白质中的δ2H、脂肪中的δ2H、蛋白质中的δ18O)，产地判别的准确率不再随着指标的加入而升高。 可见，利用车厘子果肉蛋白质中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 等3 个指标即可有效实现车厘子的产地溯源。 利用上述选定的3 个指标做Fisher 线性判别分析，判别函数分别为:Y(澳洲)= -31.99X1-39.71X2+77.13X3-4 641.26；Y(美国)= -31.07X1-36.27X2+86.26X3-4 394.30；Y(智利)= -29.85X1-40.96X2+73.93X3-4 543.50；Y(山东)= -29.19X1-39.71X2+78.35X3-4 454.86； 各模型中的X1、X2、X3分别为蛋白质中的δ2H、脂肪中的δ2H、蛋白质中的δ18O。

表4 不同组分对车厘子产地判别的准确率Table 4 Accuracy of different components for discrimination of cherries origins /%

在实际应用中，依据所建立的判别模型，可对上述4 个产地的车厘子盲样进行判别分类。 将试验测得的各样品蛋白质中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 代入上述各模型，而盲样则归属于Y值最大的地区。

表5 多个同位素指标组合对车厘子产地判别的准确率Table 5 Accuracy of multiple isotope index combinations for discrimination of cherries origins /%

3 讨论

当前，我国线上线下销售的进口车厘子主要来自于澳洲、美国、智利3 个国家，国产车厘子大部分来自于山东、四川、福建等地区。 不同产地车厘子中稳定同位素比率和当地的地理、气候密切相关[30-32]，在植物源性食品的产地溯源研究中，稳定同位素受外界人为因素的影响较小，地理特性明显。 因此，本试验通过测定车厘子果肉中蛋白质和脂肪2 种单独组分中碳、氢、氧3 种同位素丰度的地区差异，利用显著性分析、判别分析等统计学分析手段来区分试验地区的车厘子。

蛋白质、脂肪中的同位素比率测定结果显示，不同产地车厘子中δ13C、δ2H 和δ18O 均存在显著性差异。植物中的碳元素主要来源于光合作用途径，受大气、光照、温度等外部环境因子的影响，各地区样本蛋白质中δ13C 的平均值存在差异且与产地当地气温基本呈正相关的变化趋势，可能是温度升高影响了植物碳同位素分馏的结果，这与刘贤赵等[33]和胡启武等[34]对C3草本植物δ13C 与温度关系的研究结果基本相符；但样品蛋白质中δ13C 与脂肪中δ13C 的产地变化趋势并不相同，这可能与这2 种组分在植物体中合成代谢途径不同有关。 植物中氢、氧同位素的丰度主要受当地水循环系统、气温、海拔等环境因子影响，4 个产地车厘子中δ18O、δ2H 显著差异，可能与这些地区的水循环系统存在差异有关。 此外，同位素测定结果显示，同一产区的车厘子蛋白质和脂肪之间的δ13C、δ2H 和δ18O 普遍存在显著性差异，这可能与植物体中蛋白质、脂肪的代谢途径不同有关。 基于各产地车厘子中δ13C、δ2H和δ18O 存在差异，采用判别分析的统计学方法进行产地判别，基于蛋白质或脂肪中的δ13C、δ2H 和δ18O 对车厘子产地均具有一定的判别效果，但判别准确率并不高，其中基于脂肪中同位素的产地判别准确率仅为68.8%，这可能与样品基数较小有关，后续应继续扩大采样量和增加采样地区。

近年来，气相色谱质谱联用[35]、近红外光谱[36]、拉曼光谱[37]和DNA 条形码[38]等新型分析技术逐渐应用于农产品产地溯源研究领域，这些技术所测定的指标易受农产品成熟度、人为加工等因素影响，存在一定的局限性，而植物源性农产品中的稳定同位素受这些因素的影响较小，因此，利用稳定同位素分析判别车厘子原产地具有一定的可行性，可为后续建立植物源性食品或车厘子的产地溯源平台提供一定的理论基础，具有重要的现实意义。

4 结论

本研究采用稳定同位素比率质谱仪测定澳洲、美国、智利、山东4 个产地车厘子中蛋白质和脂肪中的碳、氢、氧同位素比率。 结果发现，单一蛋白质组分对产地的初始判别准确率为87.5%，交叉验证判别准确率为87.5%，单一脂肪组分的初始判别准确率为100.0%，交叉验证判别准确率为68.8%。 结合单因素方差分析、逐步判别分析和Fisher 线性判别分析等多元统计分析手段，选用蛋白质中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 这3 个指标耦合，可有效区分4 个产地的样品，且判别准确模型的初始判别准确率达到100.0%，交叉验证判别率达到93.8%。