费菜黄酮对柑橘意大利青霉菌抑制作用的研究

时间：2024-05-23

罗洁王鸿飞许凤王靖池宗豫谢柯沁吴承豪邵兴锋

(宁波大学食品与药学学院，浙江宁波 315211)

柑橘(Citrus reticulataBlanco) 为柑橘亚科(subfamily Aurantioideae)柑橘属(CitrusL.)植物，其果实营养丰富，兼具药用价值。柑橘果实在采后贮运期，由意大利青霉菌(Penicillium italicum)引起的采后青霉病较为常见，且在冷藏条件下更具危害性，可直接侵染健康果实[1]，导致果实产量和品质迅速下降，造成严重的经济损失[2-3]。目前，控制柑橘采后病害主要采用化学杀菌剂，如咪鲜胺、苯基苯酚、抑霉唑等，在柑橘上得到了广泛应用，然而杀菌剂残留物会对人体健康以及环境构成潜在的风险。费菜(Sedum aizoonL.)为景天科(crassulaceae)多年生野生草本植物，富含黄酮、多酚、多糖等功效成分[4]，具有抑菌活性，其作为植物源抑菌剂在天然保鲜防腐剂开发方面前景广阔。

黄酮(flavonoids)是一类通常由2 个具酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成的低分子量植物次生代谢产物[5]。大量研究表明黄酮类化合物通过影响细胞膜功能发挥抑菌机制[6]。 Peralta 等[7]发现高浓度(200～1 000 μmol·L-1)异戊二烯类黄酮[2′，4′-dihydroxy-5′-( 1‴，1‴-dimethylallyl ) 8-prenylpino cembrin，8PP]处理的生物膜表现出不同的扩散距离，改变了其表面结构、空隙、通道和孔隙，进而影响了生物膜基质内部的流动性。 Tsuchiya 等[8]研究表明，槐属二氢黄G( 5，7，2′，4′-tetrahydroxy-8-lavandulylflavanone，sophoraflavanone G)主要通过降低细胞膜的流动性，导致胞内物质如酶、蛋白质、离子和核苷酸等成分的泄漏。此外，也有植物源黄酮作用于菌体细胞膜达到抑菌效果的相关报道，如高良姜可以通过损伤金黄色葡萄球菌细胞质膜，致使其钾离子渗漏，造成细胞壁的渗透溶解或菌体的自我分解；蜂胶中的槲皮素可以增加细菌内膜的通透性，致使膜电位发生改变，从而增强其抑菌活性[9]。

前期研究表明，费菜黄酮通过膜损伤机制对猪肉腐败菌乳酸菌发挥抑菌作用[10]，对食源性致病菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均具有抑制效果[11]。费菜黄酮对柑橘类水果致病菌的抑菌作用尚未见报道，本研究从体外和体内两方面探讨费菜黄酮对意大利青霉的抑制作用及其机制，以期为柑橘的防腐保鲜提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

费菜采自宁波大学食品科学与工程实验基地，自然晾晒，60℃烘至水分含量小于5%后粉碎，过80 目筛，得费菜干粉；柑橘于2018年10-11月期间采摘自宁波市秋歌生态农场橘园，挑选大小均匀、色泽统一、成熟度一致、无机械损伤、无病虫害果实，立即运回实验室；意大利青霉(P. italicum)由中国农业科学院柑桔研究所提供，4℃马铃薯葡萄糖琼脂固体(potatodextrose agar，PDA)培养基斜面保存。

PDA 培养基、马铃薯肉汤(potato dextrose broth，PDB)培养基，均购于杭州微生物试剂有限公司；H2O2测定试剂盒(比色法)，南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国药分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；DNP-9162 型电热恒温培养箱，宁波江南仪器厂；B204LEDR 生物显微镜，重庆光学分析仪器厂；Biofugestratos 台式高速冷冻离心机，德国Thermo Scienific SORVALL 公司；Cary50Scan 紫外分光光度计，美国瓦里安技术中国有限公司；S-3400N 型扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 费菜黄酮的制备与测定采用乙醇超声波辅助提取法[12]。取适量费菜干粉，用90%乙醇按1 ∶40(w ∶v)料液比混合，超声波辅助提取50 min(功率400 W，温度60℃)，之后60℃水浴浸提2 h，室温抽滤，45℃旋转蒸发浓缩后加入2 倍体积无水乙醇于4℃静置过夜，除去多糖；经AB-8 大孔树脂纯化，旋转蒸发浓缩后于-40℃冷冻干燥72 h 制成粉末；取适量粉末用30%乙醇溶解，采用AlCl3比色法测定总黄酮含量。

1.3.2 孢子悬浮液的制备将意大利青霉接种至PDA 培养基上，于28±1℃培养7 d 进行活化。用无菌生理盐水(0.9%)冲洗平板洗下孢子，8 层无菌纱布过滤去除营养菌丝体，收集孢子悬浮液用血球计数板计数，调整浓度约为106spores·mL-1。

1.3.3 最低抑菌浓度 ( minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度( minimum fungicidal concentration，MFC)的测定采取倍半稀释法[13]制成费菜黄酮终浓度为0.22、0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1的含药PDA 平板，以不含费菜黄酮的平板为空白对照，接种20 μL 浓度约为106spores·mL-1的孢子悬浮液，均匀涂布。 28±1℃恒温培养48 h 后观察，以完全没有菌丝生长的最低浓度作为MIC；测出MIC 后，将MIC 下的PDA 平板继续于28℃培养7 d，观察菌丝的生长情况，以无菌丝生长的浓度作为MFC。

1.3.4 费菜黄酮对意大利青霉的抑菌活性参考Wang 等[14]的方法，将浓度分别为0、0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1的费菜黄酮与103spores·mL-1孢子悬浮液混合，于28±1℃培养16 h 后，将费菜黄酮和孢子的混合物倒入PDA 平板涂布均匀，培养72 h 后计菌落数，按照公式计算分子孢子存活率:

1.3.5 费菜黄酮对意大利青霉菌丝生长的抑制作用采用琼脂稀释培养法[15]，将费菜黄酮加至PDA 培养基中，使其终浓度分别为0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1，以不加费菜黄酮作为空白对照。取1 mL 106spores·mL-1孢子悬浮液至PDA 培养基上，涂布均匀后于28±1℃培养5 d，以备制作菌饼，打孔器打取菌饼(6 mm×6 mm)后反贴至含药平板中央，于28±1℃培养。采用十字交叉法测量菌落直径，并根据公式计算抑菌率:

1.3.6 细胞膜通透性的测定参考Yang 等[16]的方法，将浓度为106spores·mL-1孢子悬浮液接种于PDB培养基中，于28℃、135 r·min-1恒温回转摇床培养48 h，称取1 g(湿重)菌丝加入费菜黄酮使其终浓度为1 MIC，对照加入等量无菌水。于培养后0、3、6、9、12 h分别取样测定胞外电导率P1，无菌丝体的离子导电性为电导率本底值P0；菌丝煮沸10 min 冷却后测定总电导率Pk。按照公式计算相对电导率:

式中，P1为菌丝胞外电导率；Pk为总电导率；P0为电导率本底值。

1.3.7 细胞成分释放的测定将浓度为106spores·mL-1的意大利青霉孢子悬浮液加入PDB 培养基中培养48 h 后加入费菜黄酮，使其终浓度为1 MIC，对照组加入等量无菌水，于28℃、135 r·min-1摇培，12 000 r·min-1离心收集上清液。采用蒽酮法[17-18]测定菌悬液的总糖含量。

1.3.8 菌丝丙二醛(malondialdehyde，MDA)和H2O2含量的测定菌丝培养及处理方法如1.3.6，收集处理后的菌丝，使用H2O2试剂盒测定菌丝H2O2含量。参考Xu 等[19]的方法测定菌丝MDA 含量，计算公式如下:

式中，Vt为提取液总体积，mL；Vs为测定用提取液体积，mL；W 为样品重量，g。

1.3.9 意大利青霉菌丝表面形态的观察从生长7 d的菌落中洗脱孢子悬液，接种至50 mL 液体培养基中，于28±1℃，120 r·min-1摇培2 d。然后参考Wallace等[20]的方法，分别经1 MIC 和1 MFC 费菜黄酮处理12 h，以正常生长的菌丝作为对照。收集菌丝球，置于3.0%戊二醛中4℃、pH 值7.2 条件下固定过夜，经0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、乙醇梯度脱水、叔丁醇置换，冷冻干燥、粘样、喷金后，于扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)下观察并拍照。

1.3.10 发病率和病斑直径的测定果实用清水清洗干净、晾干，用75%乙醇擦拭果皮，自然晾干。用无菌枪头在果实赤道部位形成大小统一的伤口(直径3 mm，深度4 mm)，并注入20 μL 浓度分别为0(对照组)、0.3、0.6、1.2 mg·mL-1的费菜黄酮，自然晾干后于伤口处接种104spores·mL-1孢子悬浮液10 μL，待其晾干后放入塑料保鲜盒中。于25±1℃、相对湿度85%条件下培养5 d，发病后每隔1 d 测量柑橘果实的病斑直径，统计果实的发病率。每个处理27 个果实，重复2次。采用十字交叉法测定果实病斑直径，取平均值；果实病斑直径≥0.50 cm 确定为发病。

1.4 统计分析

应用SAS 8.1 软件的Duncan′s multiple-range test进行多重比较，采用Origin 9.0 对数据进行处理分析并制图。未经说明，试验重复3 次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度和最小杀菌浓度的确定

由表1 可知，费菜黄酮对意大利青霉有较好的抑制作用，培养2 d 时，当费菜黄酮浓度≥1.75 mg·mL-1时；未见明显的菌落生长，说明费菜黄酮对意大利青霉的MIC 为1.75 mg·mL-1；而培养7 d 时，当费菜黄酮浓度≥7.00 mg·mL-1时，未见明显菌落，说明费菜黄酮对意大利青霉的MFC 为7.00 mg·mL-1。

表1 费菜黄酮对意大利青霉的MIC 和MFCTable 1 The MIC and MFC of flavonoids from Sedum aizoon L. on P. italicum

2.2 费菜黄酮对意大利青霉的抑菌活性

由图1 可知，费菜黄酮对意大利青霉有较好的抑制效果，当费菜黄酮浓度为0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1时，意大利青霉菌的存活率均显著低于对照组(P＜0.05)；当费菜黄酮浓度达到7.00 mg·mL-1，意大利青霉的可见菌落百分比为0。

2.3 费菜黄酮对意大利青霉菌丝生长的影响

费菜黄酮对意大利青霉的体外抑菌效果如表2 所示，随着费菜黄酮浓度的增加，抑菌效果也随之增强，呈较好的剂量效应关系；当费菜黄酮浓度为0.44 mg·mL-1时，菌丝生长抑制率达到60.53%，当费菜黄酮浓度达到3.50 mg·mL-1时，抑菌率增加至84.91%。培养2 d 时，当费菜黄酮含量大于1.75 mg·mL-1时，菌丝基本未生长，也说明了费菜黄酮的最小抑菌浓度为1.75 mg·mL-1；培养4 d 时，7.00 mg·mL-1费菜黄酮能完全抑制意大利青霉菌丝体生长，且费菜黄酮浓度介于0.44～3.50 mg·mL-1时也对意大利青霉菌有不同程度的抑制作用。

2.4 费菜黄酮对意大利青霉细胞膜通透性的影响

由图2 可知，经1.75 mg·mL-1(1 MIC)费菜黄酮处理后，意大利青霉菌悬液相对电导率随处理时间的延长总体呈上升趋势；处理9 h 时，费菜黄酮处理组的相对电导率为19.58%，显著高于对照组(4.61%)(P＜0.05)；当处理时间延长至12 h 时，处理组的相对电导率升高至45.37%，显著高于对照组(14.43%)。表明菌体细胞膜的通透性增加，离子稳态遭到一定的破坏。

表2 不同费菜黄酮浓度对意大利青霉菌丝生长的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of different flavonoids concentrations against mycelial growth of P. italicum

图1 费菜黄酮对意大利青霉分生孢子存活率的影响Fig.1 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L.on conidia viability of the P. italicum in vitro

图2 费菜黄酮对意大利青霉菌细胞膜通透性的影响Fig.2 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L.on permeability of the P. italicum cell membrane

2.5 费菜黄酮对意大利青霉细胞成分释放的影响

由图3 可知，随着费莱黄酮处理时间的延长，对照组菌悬液总糖含量总体呈下降趋势，1.75 mg·mL-1(1 MIC)费菜黄酮处理组菌悬液总糖含量总体呈上升趋势，处理3 h 时，处理组菌悬液总糖含量为54.43 mg·mL-1，显著高于对照组(48.01 mg·mL-1)，处理时间延长至12 h 时，处理组菌悬液总糖含量达到58.63 mg·mL-1，仍显著高于对照组。表明经费菜黄酮处理后菌体胞内糖类物质泄露出胞外。

图3 费菜总黄酮对意大利青霉菌细胞胞外总糖含量的影响Fig.3 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L. on total sugars of P. italicum

2.6 费菜黄酮对意大利青霉菌MDA 和H2O2 含量的影响

由图4-A 可知，随着费菜黄酮处理时间的延长，意大利青霉菌MDA 含量总体呈上升趋势，以3 ～9 h内变化最为明显，在处理3 h 时菌丝MDA 含量达到4.06 mmol·g-1，显著高于对照组(2.24 mmol·g-1)(P＜0.05)，处理9 h 时MDA 含量增至5.66 mmol·g-1，当处理时间为12 h 时，意大利青霉菌丝MDA 含量有所降低，但仍显著高于对照组(2.04 mmol·g-1)(P＜0.05)。由图4-B 可知，经费菜黄酮处理后意大利青霉菌丝H2O2含量显著升高(P＜0.05)，处理3 h 时H2O2含量达到25.73 mmol·g-1，处理时间延长至6 h时，意大利青霉菌丝H2O2含量上升至33.77 mmol·g-1，随后H2O2含量基本稳定。表明费莱黄酮处理后菌体受到氧化胁迫，暗示细胞膜受到了损伤。

图4 费菜黄酮对意大利青霉菌MDA(A)和H2O2(B)含量的影响Fig.4 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L. on MDA (A) and H2O2(B) contents of P. italicum cells

2.7 费菜黄酮对意大利青霉菌丝形态的影响

处理前的意大利青霉菌丝呈现出正常和完整的管状结构，并且菌丝表面平滑(图5-A)。而经MIC(1.75 mg·mL-1)和MFC(7.00 mg·mL-1)黄酮处理后的菌丝发生了明显变化，MIC 处理的菌丝局部失水凹陷，表面粗糙，出现褶皱(图5-B)；MFC 黄酮处理菌丝的损伤比MIC 更为严重，菌丝结构完全破坏，严重塌陷，同时出现细胞质的流失(图5-C)。

2.8 费菜黄酮对损伤接种意大利青霉的柑橘发病率及病斑直径的影响

如图6-A 所示，费菜黄酮能抑制柑橘采后青霉病病菌的生长，且呈现一定的量效关系，即随着费菜黄酮浓度的升高，柑橘果实病斑直径变小。由图6-B 可知，接种意大利青霉后第2 天，1.2 mg·mL-1费菜黄酮处理组柑橘采后青霉发病率为25.92%，显著低于对照组(P＜0.05)；接种3 d，0.6、1.2 mg·mL-1费菜黄酮处理组的果实发病率分别为85.19%和81.48%，均显著低于对照组(P＜0.05)；接种4 d，处理组和对照组发病率均达到100%，无显著差异，说明费菜黄酮可能作用于发病前期。由图6-C 可知，接种意大利青霉后的第2天，1.2 mg·mL-1费菜黄酮处理组果实病斑直径在0.64 cm 以内，0.3、0.6 mg·mL-1费菜黄酮处理组与对照组之间差异不显著(P＞0.05)；接种后第3 天，病斑直径迅速增大，各费菜黄酮处理组果实病斑直径与对照组均无显著差异(P＞0.05)；接菌后第4 天，对照组果实病斑直径达到2.94 cm，显著高于0.6 mg·mL-1处理组(2.57 cm)及1.2 mg·mL-1处理组(2.62 cm)(P＜0.05)；接种后第5 天，病斑直径随着费菜黄酮浓度的升高总体呈减小趋势，各处理组间无显著性差异(P＞0.05)，但均显著小于对照组(P＜0.05)。

图5 费菜黄酮对意大利青霉菌丝处理后扫描电子显微镜观察Fig.5 Scanning electron microscope observation of P. italicum mycelia after flavonoids treatment

3 讨论

细胞膜是细胞选择性渗透屏障，一旦受到损伤，胞内环境稳态会失衡，造成不可逆的损伤，进而导致菌体细胞的死亡[21-22]。通过测定细胞膜通透性发现，费菜黄酮同样作用于菌体细胞膜，打破菌体的保护屏障，进而引起胞内物质泄露，导致相对电导率上升，这与冯亚净等[23]、Paul 等[24]和李珊珊等[25]的结果相似。糖类是细胞内重要的能量储备物质，本研究发现对照组菌悬液中糖类物质被意大利青霉利用而减少，处理组菌悬液中总糖含量增加，表明费菜黄酮可能作用于意大利青霉细胞膜，导致胞内糖类成分释放，进而说明细胞膜损伤后胞内功能物质大量流失。此外，本试验结果显示，经费菜黄酮处理后意大利青霉菌MDA 和H2O2含量升高，在一定程度上反映了活性氧的爆发，侧面说明意大利青霉发生了氧化损伤[26]。扫描电镜结果显示，处理组菌丝结构完整性遭到破坏，菌丝表面出现褶皱、塌陷，菌体细胞质流失，表明细胞膜损伤进而使得意大利青霉胞内成分释放，说明费菜黄酮对意大利青霉形态功能有影响。

黄酮类物质具有广谱的抑菌特性，对细菌、真菌等均具较高的抑制活性，作用于菌体使其能量代谢受到影响、破坏细胞膜的完整性、抑制核酸以及蛋白的合成表达均已被证实[27-28]。前期研究发现费菜黄酮对冷却猪肉腐败菌具有较好的抑制效果[29]，通过破坏细胞膜完整性，造成菌体内环境紊乱，抑制高分子蛋白质的表达和积累，达到抑菌和杀菌的作用。本试验所用费菜黄酮经纯化冻干其纯度为45.67%，主要含有槲皮素、槲皮苷、山奈酚等[30]，费菜黄酮对柑橘腐败菌意大利青霉表现出较好的抑菌活性，MIC 为1.75 mg·mL-1，初步探索黄酮成分可能通过破坏菌体细胞膜，进而导致功能性成分的释放，达到杀菌效果，但具体是单一黄酮作用还是多种黄酮协同作用仍需进一步研究。

柑橘果实在采后贮藏阶段易受意大利青霉的侵染，采后果实青霉病的控制成为柑橘病害的研究热点。目前，诸多研究通过抑制菌丝生长控制了柑橘采后青霉病，Wang 等[14]发现肽PAF56 具较高的抑菌活性，能较好地控制柑橘采后青霉病的发生。 Tao 等[31]利用椪柑精油对意大利青霉进行处理，发现椪柑精油中活性成分可抑制菌丝的生长。本研究发现，费菜黄酮可抑制意大利青霉菌丝的生长，且具剂量依赖效应，用费菜黄酮处理后可延缓柑橘果实的发病进程。不同抑菌方法对柑橘青霉病在体外和体内均表现出抑制效果，可能在体外抑菌测试中直接作用于病原菌导致其死亡，运用于柑橘果实，可抑制病原菌生长，从而降低发病率，减轻病菌对果实的侵害。费菜黄酮单一处理仍具有局限性，下一步研究可尝试将费菜黄酮与其他抑菌活性物质复合应用于柑橘保鲜。