非热处理对蜂花粉杀菌效果及品质的影响

延 莎 王斐然 赵柳微 吴黎明

(1中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

蜂花粉由天然花粉与花蜜、蜜蜂分泌物混合而成，富含碳水化合物、蛋白质、脂类、维生素以及多酚等植物化学成分，是兼具营养与药用价值的“完美食品”[1]。 蜂花粉除了对前列腺炎有良好的治疗作用，还具有抗氧化、抗癌、增强免疫力等活性[2]，越来越受到消费者的青睐。 目前市场上几乎没有蜂花粉的深加工食品，蜂花粉仅作为膳食补充剂或一些慢性疾病的治疗剂被人们直接食用[3]。 花粉受环境等各方面因素的影响而携带大量微生物；采集过程中，蜜蜂携带的微生物也会对花粉造成污染；此外，在形成花粉团时，蜜蜂所分泌的唾液也是造成蜂花粉污染的原因之一。若要在较长时间内维持蜂花粉的食用品质使其不发生腐败变质，必须对蜂花粉进行适当的灭菌处理。 蜂花粉属于高糖(约30%)、高蛋白质(约20%)食品，热杀菌处理会造成不良的颜色和风味，而且也会降低其营养价值[4]，因此常规的热杀菌技术并不适宜蜂花粉。目前关于蜂花粉杀菌的相关研究并不多，仅有采用微波、辐照等方法对蜂花粉进行灭菌的报道。 潘建国等[5]研究表明，采用微波处理蜂花粉灭菌条件应在50℃左右，且需要较长时间，较难实现大规模应用推广。 目前，市场上存在的灭菌蜂花粉基本都是辐照产品。 我国也颁布了相应的蜂花粉杀菌方法标准，对蜂花粉辐照剂量等操作要点进行了规定[6]。 随着食品安全事件的频发，生产者为了达到更好的灭菌效果，辐照剂量往往超标。 过高的辐照剂量，一方面难以保证辐照产品的质量安全，另一方面也受到蜂花粉进口国设置的技术壁垒限制。 随着对辐照技术(irradiation，IR)研究的深入，发现辐照后产生的“辐照味”主要是脂质氧化和含硫氨基酸分解产生的不良气味[7]。 高剂量辐照会改变食品的营养组分，如蛋白质的交联降解、脂质氧化[8]以及反式脂肪酸含量增加等[9]。 寻求温和、效果好且经济的非热杀菌技术对蜂花粉产业的发展至关重要。

超高压杀菌(ultra-high pressure，UHP)又被称为高静压杀菌技术，是将食物置于以水或油作为传压介质的装置中，施加100 ～1 000 MPa 的压力，在非热条件下达到杀菌的目的[10]，能较好地保持食品的色、香、味及功能和营养品质[11]。 高压静电场杀菌(highvoltage electrostatic field，HVEF)也是一种非热处理技术，空气在电场的作用下产生臭氧和活性氧，通过影响细胞膜的渗透率和酶活性从而抑制微生物的生长繁殖[12]。 HVEF 技术不仅可以改善胡萝卜汁的品质还能延长其货架期[13]。 在果蔬贮藏保鲜方面HVEF 技术应用也较广泛，如柑橘类水果中的青霉在电场中会受到抑制[14]。 但鲜见有关这2 种非热杀菌技术在蜂花粉中的报道，故本研究对比辐照、超高压和高压静电场3 种非热杀菌技术的杀菌效果及对蜂花粉品质的影响，旨在开发更适宜蜂花粉杀菌的方法，为非热杀菌技术在蜂花粉加工产业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉原料购于四川夸克科技发展有限公司，含水量约7%。

氢氧化钠、无水乙醇、冰醋酸、石油醚，北京化工厂；铁氰化钾、钼酸铵、乙酸钠、亚硝酸钠、福林酚，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、三氯化铁、三氯乙酸，上海麦克林试剂公司；硝酸铝、没食子酸，上海生工生物工程股份有限公司；芦丁、α-淀粉酶、中性蛋白酶、糖化酶，购自上海源叶生物科技有限公司。 化学试剂均为分析纯。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基、营养琼脂培养基，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

YXQ-LS-75SJi 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ-500DE 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RXZ 智能人工气候箱，宁波江南仪器厂；JA2003 电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TGL-20M 低温高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；Ⅴ-850 旋转蒸发仪，BUCHI 公司；MA-01503 氮吹仪，美国Berlin 公司；HHP-650 超高压处理设备，包头科发高压科技有限责任公司；CM-5色差仪，日本KONICA MINOLTA 公司；7890A 气相色谱-5975C 质谱联用仪，美国Agilent 公司；SpectraMax i3 多功能酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司；DSHZ-300A恒温水浴振荡器，太仓实验设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 蜂花粉非热处理杀菌 将蜂花粉原料用中草药粉碎机粉碎后过80 目筛，于-20℃贮藏备用。

1)辐照杀菌处理:辐照处理在北京大学化学与分子工程学院完成，放射源为60Co，辐照剂量分别为0、3、5、7、9、11 kGy，每次辐照样品量为15 g。

2)超高压杀菌处理:超高压杀菌处理在中国农业大学食品科学与营养工程学院完成，每次取15 g 蜂花粉置于超高压设备中，分别在0、300、400、500、600 MPa 的压强下处理，10 min 后取出。

3)高压静电场杀菌处理:高压静电场杀菌处理在山西农业大学食品科学与工程学院完成，每次取15 g蜂花粉置于高压静电场设备中，两层板间的距离为5 cm，分别在0、15、20、25、30 kV 的电压产生的场强下处理，1 h 后取出。

1.3.2 菌落总数测定 参照食品安全国家标准GB 4789.2-2016[15]。

1.3.3 霉菌和酵母菌总数测定 参照食品安全国家标准GB 4789.15-2016[16]。

1.3.4 蜂花粉营养成分测定 选取各种方法最佳杀菌条件下的样品进行后续营养成分的测定。

1)蛋白质含量测定:参照国家标准GB 5009.5-2016[17]。

2)脂类含量测定:参照国家标准GB 5009.6-2016[18]。

3) B 族维生素含量测定:参照国家标准GB 5009.84-2016[19]和GB 5009.85-2016[20]。

4)纤维素含量测定:参照国家标准GB 5009.88-2014[21]。

5)灰分含量测定:参照国家标准GB 5009.4-2016[22]。

1.3.5 蜂花粉黄酮含量测定 参考Nahed 等[23]的方法，并稍作改动。 取7 mL 蜂花粉的乙醇提取液(料液比1 ∶5，超声提取2 h)，加入1 mL 5% NaNO2，避光静置5 min，再加入1 mL 10% Al(NO3)3，避光静置5 min，最后加入10 mL 40 mg·mL-1NaOH，用蒸馏水定容至25 mL，充分震荡混匀后于室温下避光静置15 min，于510 nm 波长处测定其吸光值。 黄酮含量以每克干质量等同于芦丁的质量(mg)表示。 芦丁的标准曲线回归方程为Y=1.343 8X+0.029 8，R2=0.994 1，Y为吸光值，X为质量浓度(mg·mL-1)。

1.3.6 蜂花粉酚酸含量测定 参考文献[24]。 在避光处分别取0.5 mL 适宜浓度的蜂花粉乙醇提取液，加入1.25 mL 福林酚，避光静置5 min。 然后加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，蒸馏水定容至10 mL，在室温下避光反应2 h 后于760 nm 波长处测吸光值。 酚酸含量以每克干质量等同于没食子酸的质量(mg)表示。 没食子酸的标准曲线回归方程为Y=4.116 1X+0.050 8，R2=0.999 2，Y为吸光值，X为质量浓度(mg·mL-1)。

1.3.7 蜂花粉醇提物对DPPH 自由基清除力测定 参考文献[25]，并稍作改动。 蜂花粉乙醇提取液稀释至不同倍数，分别取0.2 mL 各稀释液，加入3 mL 100 μmol·L-1DPPH 乙醇溶液，震荡20 s 后立即置于暗处反应40 min，在517 nm 波长处测其吸光值。 以自由基清除率为纵坐标，稀释液的终浓度为横坐标，计算自由基清除率为50%时的稀释液浓度，即IC50。

式中，A2为无水乙醇(空白)与DPPH 溶液混合液的吸光值；A1为花粉提取物稀释液与DPPH 溶液混合液的吸光值；A0为花粉提取物稀释液与无水乙醇(空白)混合液的吸光值。

1.3.8 蜂花粉醇提物总还原力测定 取不同稀释倍数的蜂花粉乙醇提取液各1 mL，加入0.5 mL 0.2 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 值6.6)和2.5 mL 1% K3Fe(CN)6(现用现配)，于60℃水浴恒温振荡器中反应20 min。 用冰水充分冷却至室温后，再分别加入2.5 mL 10%三氯乙酸，充分混匀后静置5 min，8 000 r·min-1离心5 min，取3 mL 上清液加入0.4 mL 新配的0.1% FeCl3溶液和2 mL 蒸馏水，充分混匀后，静置10 min 于700 nm 波长处测定其溶液吸光值。 以吸光值为纵坐标，稀释液浓度(mg·mL-1)为横坐标，计算吸光值为0.5 时的稀释液浓度，即IC50。

1.3.9 蜂花粉醇提物总抗氧化活性测定 参考文献[26]。 分别取稀释不同倍数的蜂花粉乙醇提取液0.2 mL，加 入0.2 mL 0.6 mol·L-1硫 酸、0.2 mL 28 mmol·L-1磷酸钠、0.2 mL 4 mmol·L-1钼酸铵，充分混匀后置于90℃水浴中恒温100 min，取出用冰水冷却至室温后，静置5 min，在695 nm 波长处测其吸光值。 以吸光值为纵坐标，稀释液浓度为横坐标，计算吸光值为0.5 时的稀释液浓度，即IC50。

1.3.10 蜂花粉色差测定 将色差仪调整至L*a*b*模式，对不同杀菌处理的蜂花粉进行色差分析。 其中L*表示明度，+a*表示偏红，+b*表示偏黄。

1.3.11 蜂花粉风味测定 蜂花粉挥发性成分的提取:准确称取4 g 蜂花粉样品，置于15 mL 顶空瓶中，50℃平衡10 min。

气相色谱条件:HP-5 MS 毛细管色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；初始温度40℃，保持3 min，以5℃·min-1升温至200℃，保持1 min，再以12℃·min-1升温至260℃，保持1 min；进样口温度260℃；载气He，流速1.0 mL·min-1，不分流进样，进样量2 mL。

质谱条件:电离方式EI；电子能量70 eV；离子源温度230℃；接口温度280℃；扫描质量范围45 ～550 amu；各组分经过NIST 标准谱库检索和Wiley 谱库相匹配，选取匹配度大于80 的化合物。

1.4 数据处理

试验所有测定均设置3 次重复，采用Excel 2010计算平均值及标准差；采用IBM SPSS Statistics 22 进行多重比较、聚类分析，并制图。

2 结果与分析

2.1 不同非热杀菌处理蜂花粉的杀菌效果

2.1.1 辐照处理蜂花粉的杀菌效果 由表1 可知，经不同辐照剂量处理的蜂花粉中微生物含量极显著降低，且随着辐照剂量的增加杀菌效果更好。 蜂花粉中初始菌落数为3.78 lg(CFU·g-1)，真菌数为3.66 lg(CFU·g-1)。 当辐照剂量为7 kGy 时，菌落总数和霉菌数均达到GB 31636-2016《食品安全国家标准 花粉》[27]中即食预包装蜂花粉产品的微生物限量标准(霉菌＜200 CFU·g-1，菌落总数＜10 000 CFU·g-1)。 这与罗志平等[6]研究辐照对茶花粉杀菌效果中发现辐照剂量为6 kGy 时杀菌率高达99%的结果相一致。

表1 蜂花粉辐照杀菌效果Table 1 Effect of irradiation sterilization for bee pollen /lg(CFU·g-1)

2.1.2 超高压处理蜂花粉的杀菌效果 由表2 可知，经超高压处理后蜂花粉中的菌落总数极显著降低，尤其是对霉菌、酵母杀菌效果十分明显。 当压强大于500 MPa 时，继续增大压强，效果并不显著。 柴文博等[10]指出酵母和霉菌会在压力达到300 MPa 以上时死亡。 超高压对微生物的作用，除受压力影响外，还受温度、pH 值等因素的影响[28]，尤其是抗性强的芽孢。Ramaswamy 等[29]研究发现芽孢对温度比对压力更敏感，在高温条件下，压力大于900 MPa 才有较好的杀菌效果。 本研究是在室温条件下中进行的，如果高温和超高压联合作用，可能会达到更好的杀菌效果。

表2 蜂花粉超高压杀菌效果Table 2 Effect of UHP sterilization for bee pollen /lg(CFU·g-1)

2.1.3 高压静电场处理蜂花粉的杀菌效果 由表3可知，蜂花粉经高压静电场处理可明显抑制微生物的生长繁殖，尤其是对霉菌、酵母，在15 kV 的电场下，蜂花粉中的真菌已全部杀死。 随着场强的增大，蜂花粉中的菌落总数极显著减少，在试验场强中，30 kV 的场强下杀菌效果最好。 在高压电场中，空气被电离后会产生臭氧、空气负离子，这些物质可抑制或杀死微生物，且臭氧的产生量与电场强度成正比[30]。 高压电场对大肠杆菌作用时，干燥介质对大肠杆菌的灭活效果更好[31]。 蜂花粉是含水量较低的固态，有利于高压电场发挥作用。 本试验虽未检测大肠杆菌数量，但菌落总数间接说明高压电场对细菌确实有抑制作用。 然而，与辐照和超高压杀菌相比较，高压静电场对细菌的杀菌效果较差，继续增大场强和作用时间也许会改善，但由于所用设备已不能满足提供更大场强的要求，因此未开展相关试验。

表3 蜂花粉高压静电场杀菌效果Table 3 Effect of HVEF sterilization for bee pollen /lg(CFU·g-1)

2.2 不同非热杀菌蜂花粉的营养组成比较

由表4 可知，3 种杀菌处理对蜂花粉蛋白质、灰分、可溶性膳食纤维素、非可溶性膳食纤维素的含量无显著影响。 经超高压杀菌处理后，蜂花粉的脂类含量极显著升高，这可能是由于超高压导致细胞破裂，促使更多的脂类物质溶出。 3 种非热杀菌方式均导致蜂花粉维生素B2含量极显著降低，且维生素B1、B2均对压力较敏感。 综上，蜂花粉经超高压处理后，脂类含量会显著增加。 此外，辐照、超高压、高压静电场3 种非热杀菌方法对蜂花粉的其他主要营养组分影响较小。

表4 不同非热处理对蜂花粉各营养素含量的影响Table 4 Effect of different non-thermal treatments on the contents of bee pollen nutrients

2.3 不同非热杀菌蜂花粉的活性成分及抗氧化活性比较

由表5 可知，蜂花粉经超高压处理后，其黄酮、酚酸含量极显著增加，而经高压静电场和辐照杀菌处理后其含量极显著降低。 超高压可以作为辅助手段提高一些小分子活性成分的提取率，如Jing 等[32]利用超高压技术辅助提取香附叶总黄酮，显著提高了其提取率。然而，具有抗氧化活性物质的含量并不能完全决定样品的抗氧化活性[33]。 经辐照处理后，蜂花粉提取物对DPPH 自由基清除力极显著提高，而高压静电场处理后极显著下降。 经3 种杀菌方式处理后，蜂花粉提取物总还原力、总抗氧化性都有所下降，且高压静电场处理的影响最大，超高压和辐照处理差异不显著。 推测原因，在高压静电场处理过程中会产生活性氧，这些活性氧可能会消耗多酚类化合物导致其抗氧化活性降低。

表5 不同非热处理对蜂花粉活性成分含量及抗氧化活性的影响Table 5 Effect of different non-thermal treatments on the contents of active components and antioxidant activity for bee pollen

2.4 不同非热杀菌蜂花粉的色差比较

由表6 可知，3 种杀菌方式均会影响蜂花粉的色泽。 蜂花粉经辐照处理后，L*变化不显著，a*极显著降低，b*显著提高，表明经辐照处理后蜂花粉颜色变浅。 这可能是由于辐照促进了脂质氧化[7]，在此过程中其他氧化反应也可能会发生，如蜂花粉的脂溶性色素被氧化，故黄色稍有褪去。 蜂花粉经高压静电场处理后其L*极显著降低，a*极显著升高，b*变化不显著，表明经高压静电场处理后，蜂花粉的颜色偏深偏暗。 蜂花粉经超高压处理后，L*、a*差异不显著，b*显著升高，表明蜂花粉经超高压杀菌后颜色更黄。 胡萝卜汁经超高压作用后，组织细胞内的呈色物质(如类胡萝卜素、酚类物质)溶出，原被蛋白质包裹、结合的色素分子会释放，从而改善原料的色泽[33]。 综上，蜂花粉经超高压灭菌，颜色与对照更为接近。

表6 不同非热处理对蜂花粉色差的影响Table 6 Effect of different non-thermal treatments on the chroma of bee pollen

2.5 不同非热杀菌蜂花粉的风味比较

由表7 可知，对照组蜂花粉中共检出28 种挥发性物质，主要包括甲苯、己酸乙酯、苯甲酸甲酯和苯甲醛等化合物，其中酯类物质种类较多，且含量最大。 经辐照(7 kGy)处理的蜂花粉中共检出25 种挥发性化合物，主要有1-戊烯-3-醇、4-甲基庚烷、正己醛和2，4-二甲基-1-庚烯等化合物，其中醇类物质含量最大。经超高压(500 MPa)处理的蜂花粉中共检出28 种挥发性化合物，含量较大的有2，4-二甲基-1-庚烯、苯甲醛、苯甲酸甲酯、邻苯二甲酸酯和安息香双甲醚等化合物，其中烃类、酯类物质种类较多，且含量最大。 经高压静电场(30 kV)处理的蜂花粉中主要检出31 种匹

配度高的挥发性化合物，主要有甲苯、2，4-二甲基-1-庚烯、苯甲醛、2，2，5-三甲基癸烷、苯甲酸甲酯和邻苯二甲酸酯等化合物，其中烃类、酯类物质种类较多，且含量较大。 其中这3 种非热杀菌处理后共有但对照组未检出的成分为2-甲基-1-戊烯-3-醇、1，2，4-三甲基环己烷、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸酯，但是不同处理后这些化合物含量差异较大。

表7 不同非热杀菌处理对蜂花粉挥发性成分的影响Table 7 Effect of different non-thermal treatments on the volatile components of bee pollen

将非热杀菌处理所得的挥发性成分进行聚类分析，见图1。 高压静电场和超高压2 种杀菌方式先聚为一类，之后二者与未处理的蜂花粉聚为一类，与辐照杀菌结果相差较大。 蜂花粉经辐照处理产生更多的醇类、烃类、醛类化合物。 辐照会引起脂类、蛋白质的氧化，脂类的进一步氧化会形成烃类、醛类、酮类、醇类等小分子化合物[34]。 一些醛类化合物可以作为脂类氧化分解的标志物[35]，如本研究发现经辐照处理蜂花粉产生了较多的正己醛。 综上，高静压电场、超高压杀菌方式较辐照对蜂花粉风味的影响小。

图1 非热处理蜂花粉中挥发性成分的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of volatile components in non-heat treated bee pollen

3 讨论

随着人们对食品安全性和营养性需求的提高，急需杀菌效果好且更安全的蜂花粉灭菌方式。 俞秀玲[36]比较了湿热、微波、辐照、紫外等杀菌方式对细菌数量和维生素C 含量的影响，结果表明微波和辐照灭菌效果较好，而湿热和紫外灭菌能更好地保留维生素C。 然而仅将细菌数和维生素C 作为指标来比较不同杀菌方式的效果并不能完全说明问题。 罗志平等[6]研究了60Co-γ 辐照对茶花粉杀菌效果及品质的影响，结果表明，10 kGy 以下的辐照剂量对茶花粉的主要营养成分无影响，这与本研究结果一致。 原料经辐照杀菌后，醛酮类、含硫、含氮化合物增加，这些化合物被认为是“辐照味”的特征物质。 李阳等[37]仅用2.2 kGy剂量辐照风干武昌鱼，己醛含量就上升了30.09%，变化非常明显。 本研究结果发现，蜂花粉经辐照后己醛含量高于其他处理组，这些醛类物质是脂类氧化分解的标志物。 在实际生产中，经辐照后的花粉开封后会有明显的哈败味，这也是本研究探寻更优蜂花粉杀菌方式的重要原因。

作为新兴的杀菌技术，超高压已成功应用于实际生产中[38]；高压静电场技术则主要用于果蔬贮藏保鲜。 高压静电场可以抑制果蔬中的微生物，降低果蔬的腐烂率[12]。 本研究首次将这2 种非热处理技术应用到蜂花粉杀菌中，发现这2 种杀菌方式对霉菌、酵母的抑制效果较好，但对细菌的作用远不如辐照杀菌。本研究还发现，蜂花粉经超高压处理后，其脂类物质含量显著升高。 然而，Lingham 等[39]研究高静水压对牡蛎物理、化学特性的影响，发现经300 ～500 MPa 的高静压处理，牡蛎总脂变化不显著。 这与本研究结果不一致，可能与物料中所含脂类的具体构成有关。 非热杀菌处理对蜂花粉脂类物质影响的研究中，总脂仅是一个参考指标，后续将会展开对脂类构成变化的研究。另外，经超高压杀菌后，蜂花粉中的多酚类化合物含量显著增加，这与文献中报道超高压可作为辅助手段提高一些活性成分的提取率相符合[32]。 本研究在辐照蜂花粉中检测到了己醛，更加验证了很多文献中报道的辐照会产生“辐照味”，然而超高压和高压静电场处理对蜂花粉的风味影响较小。

超高压技术可较好地保持食品原有的营养、口感、风味和色泽，符合健康食品的条件，目前在果汁生产中已成功商业化，但在固态食品中的应用较少。 本研究首次将其应用于蜂花粉的杀菌，初步试验取得了较好的效果，但商业化应用的过程中还需进一步完善，如投料量、温度、时间和受压强度等参数。 本研究发现超高压对蜂花粉中细菌的抑制作用有限，与传统的辐照灭菌相比存在劣势。 后续研究应探究蜂花粉初始菌量及菌的种类与超高压杀菌效果的关系，寻找更合适的蜂花粉预处理方式使其达到更好的杀菌效果。

4 结论

辐照、超高压、高压静电场3 种杀菌方式均对蜂花粉中的微生物有抑制作用，辐照对细菌的抑制效果较好，超高压和高压静电场对真菌的抑制效果较好。 不同处理方法对蜂花粉主要营养成分影响不大，但对活性成分及抗氧化活性、色泽和风味产生了不同程度的影响。 500 MPa 超高压处理可增加蜂花粉活性成分含量，且抗氧化活性下降程度最小，色泽和风味最接近未处理蜂花粉原料。 综上所述，超高压采菌技术可以应用于蜂花粉杀菌。 进一步探究结合超高压杀菌技术的蜂花粉预处理方式，有望开发出更安全、有效、便于推广的蜂花粉杀菌方法。