超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶和奶粉中五种苯并咪唑类药物

陈 瑞 杨志伟 朱凤妹 齐鹏宇 李 响李 军 张进杰

(1河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛 066600；2秦皇岛海关技术中心，河北 秦皇岛 066004)

牛奶以及奶粉是日常生活中普遍存在的食品，由于能供给机体营养和能量而被广泛食用。 牛奶及奶粉的生产原料来自于奶牛体内，所以被归类于动物源性食品。 在饲养奶牛期间，使用兽药的现象普遍存在，而我国超标使用和滥用兽药的现象非常严重，尤其是抗菌类的药物[1]。 因此，对牛奶及奶粉兽药残留监控已成为保障消费者健康的重要方向[2]。 研究表明，苯并咪唑类药物可广谱抗菌、抗真菌，被广泛用于农业、水产养殖和兽医业[3]。 阿苯达唑(albendazole)[4]、芬苯达唑(fenbendazole)[5-6]、奥芬达唑(oxfendazole)[7]、噻苯达唑(tiabendazole)[8]、 苯硫氨酯(febantel)对于驱肠虫、线虫以及控制真菌有很大作用。 此类化合物可抑制细胞活性，影响生殖功能及胚胎发育等[9-10]；如果该类药物进入人体并在体内蓄积，将会有潜在的致突变性和致畸性，危害人体健康[11-12]。所以有必要建立更快速、准确和高灵敏度的检测方法，以保证牛奶及奶粉的安全性。

多数国家已将苯并咪唑类药物列为重要的监测对象，并制定了最高残留限量标准[13]。 我国农业部2002年发布的235 号公告修订了《动物性食品中兽药最高残留的限量》，明确了乳及乳制品中苯并咪唑类药物的残留限量。 目前，检测苯并咪唑类药物的方法有液相色谱法[14-15]、液相色谱-质谱法[16-18]、毛细管电泳-质谱法[19]、荧光分析法[20]、免疫分析法[21]、气相色谱-质谱法[22]等。 液相色谱法灵敏度较高，能够满足筛选检测需要，但缺乏结构信息，不能作为确证依据；毛细管电泳法测定样品耗时较长；免疫分析方法质量难以控制；气相色谱-质谱法由于苯并咪唑类药物难以气化，需衍生后测定；而高液相色谱串联质谱法相对其他方法，定性定量更准确、检测限更低，特异性强。 本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶及奶粉中5 种苯并咪唑类药物残留量，液液萃取结合Prime HLB 固相萃取净化技术，旨在建立更高效、简便的检测方法。 同时，本研究拟对国家标准《GB/T 22972-2008》[23]中所提出的方法进行优化，简化试验过程，提高效率以及灵敏度，进而为牛奶及奶粉中阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯达唑和苯硫氨酯的快速检测提供新方法，为奶制品生产企业及相关执法部门提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

A、B、C 3 种品牌袋装牛奶和奶粉，购于当地超市。

甲酸、乙腈均为色谱纯，德国Merck 公司；氯化钠(分析纯)，天津市光复科技发展有限公司；阿苯达唑(纯度≥98%)、芬苯达唑(纯度≥99%)、奥芬达唑(纯度≥98.5%)、噻苯达唑(纯度≥98%)、苯硫氨酯(纯度≥98%)标准品，德国Witega 公司。

1.2 主要仪器与设备

Nexera UHPLC LC-30A 超高液相色谱仪，日本岛津公司；AB SCIEX 液质联用系统QTRAP ® 6500，美国AB SCIEX 公司；Prime HLB 固相萃取柱(200 mg·6 mL-1)，美国Waters 公司；TURBOVAPLV 氮气旋流浓缩仪、VOATEX-2 涡旋混合器，瑞典Biotage 公司；Milli-Q® Gradient 超纯水净化器，美国Millipore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制 分别准确称取10.0 mg 阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、噻苯达唑、苯硫氨酯标准品，用甲醇溶解定容至50 mL，0～4℃冷藏备用。

1.3.2 样品预处理

1.3.2.1 牛奶样品 准确称取2 g 牛奶于离心管中，加入15 mL 提取液，振荡10 min 后，加入0. 5 g无水氯化钠，继续振荡5 min，10 000 r·min-1离心5 min，取出10 mL 上清液。 为防止对5 种药物的提取不充分，在残渣中加入10 mL 乙腈进行二次提取，重复上述操作，合并上清液，混匀，待净化。

1.3.2.2 奶粉样品 准确称取1 g 奶粉，加入7 g 水溶解混匀，取1 g 溶解液，按照1.3.2.1 步骤操作。

1.3.3 样品净化 用6 mL 乙腈活化固相萃取柱后，净化上清液，接收流出液，40℃条件下氮吹至近干，用1 mL 20%乙腈水溶液复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.3.4 色谱-质谱条件 色谱柱:Acquity UPLC®BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温为30℃；流动相A 为0.1%甲酸水溶液；流动相B 为乙腈；进样量为10 μL；色谱梯度洗脱条件见表1。

表1 色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution programme in the HPLC analysis

离子源:电喷雾离子源(ESI)；扫描方式:正离子扫描(ESI+)；检测方式:多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；离子源温度:500℃；电喷雾电压:5 500 V；雾化气压力:345 kPa；辅助气压力:345 kPa；气帘气压力:172 kPa；其他质谱参数见表2。

1.3.5 方法优化

1.3.5.1 提取液的选择 分别比较将甲醇与乙腈作为提取液时沉淀蛋白的效果。

1.3.5.2 固相萃取柱的选择 比较HLB、Prime HLB两类固相萃取柱以及两种不同规格(60 mg·3 mL-1和200 mg·6 mL-1)的Prime HLB 固相萃取柱对牛奶及奶粉的净化效果，对含同一浓度药物的样品平行测定4次，将每种药物测定的平均峰面积与纯溶剂标准进行比较。

1.3.5.3 浓缩方法的选择 试验对比了不同温度下，旋蒸法及氮吹法对回收率的影响，对不同浓缩方法进行考察，选择合适的方法。

1.3.6 方法学考察

1.3.6.1 标准曲线及检出限、定量限 以阴性样品(牛奶、奶粉)为空白基质，分别配制质量浓度在1 ～500 μg·L-1范围内的一系列5 种苯并咪唑类药物混合标准，按照优化后的方法及仪器条件进行分析，以5 种待测物质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。 以3 倍信噪比(S/N=3)计算得到牛奶及奶粉中5 种苯并咪唑类药物的检出限。

1.3.6.2 添加回收及精密度试验 按照优化后的方法分别做添加浓度为1、2、5、10 μg·kg-1的基质标准及基质空白。 每个浓度平行测定4 次。

1.3.6.3 基质效应评价 按照优化后的方法做若干空白基质，配制浓度在1～500 μg·L-1范围内不同基质标准绘制标准曲线，并与纯溶剂标准进行比较。

按照公式计算基质效应(matrix effect，ME)[24]:ME=[1-(牛奶及奶粉基质匹配标准曲线的斜率/纯溶剂配制标准曲线的斜率)]×100%。

表2 5 种苯并咪唑类药物的串联质谱分析参数Table 2 Tandem mass spectrometry parameters of five kinds of benzimidazole

若ME 为负值，则牛奶及奶粉基质对信号有增强作用，相反则有抑制作用[25]。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

以10 μL·min-1针泵优化，分别将浓度为50 μg·L-1的5 种苯并咪唑类药物进行质谱一级全段扫描，确定其母离子。 再进行二级质谱扫描得到碎片离子并进行条件的优化。 一级质谱与二级质谱图见表3。 按照欧盟标准[26]，选择1 个母离子和2 个子离子，并依据子离子丰度比对目标物进行定性定量分析。 本试验采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式检测。

2.2 色谱条件的选择

5 种苯并咪唑类药物总离子流及定量离子MRM 见图1。 结果显示，采用Acquity UPLC® BEH C18为色谱柱，用0.1%甲酸水溶液与乙腈进行梯度洗脱，可以达到良好的分离效果。 通过对洗脱条件的优化，调节有机相与水相的比例后，4.38～6.35 min 内所有的目标物均出峰，可在10 min 左右完成一个样品的分析，其分离体系效果优越，峰形良好且极大提高了分析速度。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取液的选择 牛奶和奶粉中蛋白质含量较高，如果样品中的蛋白等杂质未除净，会影响试验结果。 前处理可以选择一定浓度的酸碱溶液、重金属盐溶液或有机溶剂作为除蛋白的提取液。 但以酸碱溶液或重金属盐溶液作为提取液时，需要溶液交换有机溶剂，步骤繁琐。 本试验在GB/T 22972-2008[23]的基础上，比较了甲醇、乙腈的提取效果。 通过观察样品中蛋白质的沉淀现象，发现甲醇所沉淀的蛋白质较少，乙腈较多，对比李琴等[27]用乙腈沉淀生鲜乳中的蛋白，陈娟等[28]用乙腈沉淀蛋白提取牛奶中的磺胺类药物的方法，最终选择乙腈作为本试验的提取液。

2.3.2 固相萃取柱的选择 Prime HLB 是一种新型的反向固相萃取柱，能选择性地吸附牛奶中的磷脂等非极性干扰物而不吸附目标药物，可除去蛋白、盐和磷脂等基质干扰物[29-30]。 由图2 可知，200 mg·6mL-1Prime HLB 固相萃取柱的净化效果优于200 mg·6mL-1HLB。 Prime HLB 固相萃取柱有不同规格，故测试对比了60 mg·3mL-1、200 mg·6mL-1固相萃取柱的效果，发现规格大的柱子效果好。 因此，后续试验采用200 mg·6mL-1Prime HLB 固相萃取柱作为净化柱。

2.3.3 温度及浓缩方法对回收率的影响 试验最初使用旋转蒸发仪在50℃条件下蒸干25 mL 流出液，5种待测物的回收率(75%～82%之间)相对较低，故改用在40℃条件下蒸干流出液，回收率提高(89%～98%之间)，猜测原因可能是温度(50℃)太高导致待测物不稳定。 但是在40℃蒸干流出液时，多次偶有某种待测物回收率不稳定的现象，分析可能是人为因素导致的，因为在同一批次的样品蒸干时，出现了温度、转速条件不稳定的现象，导致回收率不稳定。 后改进试验方案，使用40 mL 氮吹管在40℃条件下吹干25 mL 流出液，使得流出液处于同一且稳定的温度下吹干。 多次试验结果显示该条件下回收率稳定(表5)，故选择40℃氮吹作为浓缩条件。

表3 5 种苯并咪唑类药物的结构式及一级与二级质谱图Table 3 Structural，primary and secondary spectra of five kinds of benzimidazole

图3 为阴性样品谱图。 结果表明该样品中不含有5 种苯并咪唑类药物，可将其作为空白基质。 在前处理最优化条件下，图4 是在阴性牛奶和奶粉样品添加5 种苯并咪唑类药物后按照优化后的方法进行前处理并分析后得到的谱图。 结果表明，5 种苯并咪唑类药物峰形及分离度均良好，说明本试验制定的试验步骤去除杂质效果好且对药物无明显干扰。

图1 5 种苯并咪唑类药物总离子流及定量离子MRM 结果Fig.1 Total ion current and quantitative ion MRM of five kinds of benzimidazole

表4 牛奶和奶粉中5 种苯并咪唑类药物线性回归方程和相关系数Table 4 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 kinds of benzimidazole in milk and milk powder

图2 不同固相萃取柱净化效果的比较Fig.2 Comparison of purification effects of different solid phase extraction columns

图3 阴性牛奶和奶粉样品谱图Fig.3 Chromatograms of negative milk and milk powder

图4 牛奶和奶粉样品添加谱图Fig.4 Addition chromatograms of milk and milk powder

2.4 方法学考察

2.4.1 牛奶与奶粉基质标准方程及检出限和定量限 由表4 可知，线性回归方程的相关系数r均大于0.996，说明在1 ～500 μg·L-1范围内5 种苯并咪唑类药物的质量浓度和峰面积线性关系良好。

2.4.2 回收率及精密度 在提取时共使用25 mL 乙腈，只取上清液20 mL，为保持浓度一致，故基质空白管在定容前按照0.8 的倍数添加5 种苯并咪唑类药物的混标，20%乙腈水溶液定容至1 mL，基质标准与样品添加同时进样，测定回收率。 每个浓度平行测定4次，其回收率及相对标准偏差(relative standard deciation，RSD)见表5。 5 种药物的平均回收率介于91.7%～97.8%之间，且RSD 在1.4%～6.5%范围内，取得了良好的试验结果。

2.4.3 基质效应 由表6 可知，ME 均为正值，所以牛奶及奶粉基质对5 种苯并咪唑类药物的质谱信号均呈抑制作用，说明基质效应微弱。

表5 牛奶及奶粉中5 种苯并咪唑类药物加标回收率及RSD(n＝4)Table 5 Scaling recovery and RSD of 5 kinds of benzimidazole in milk and milk powder (n＝4) /%

表6 牛奶及奶粉的基质效应Table 6 The matrix effects of milk and milk powder

2.5 样品的实际测定

按照上述最佳试验条件进行测定，市购的3 种品牌的牛奶及奶粉中均未检出5 种苯并咪唑类药物。

3 讨论

本研究主要对国标《GB/T 22972-2008》[23]中的样品前处理方法进行了优化。 《GB/T 22972 -2008》[23]前处理使用乙腈、正丙醇提取5 种苯并咪唑类药物，C18固相萃取柱净化，而本研究利用乙腈提取后直接采用Prime HLB 固相萃取柱净化，通过对比所耗时间，前者预处理时间长达4 h，本研究将时间缩短至1 h。 《GB/T 22972-2008》[23]在前处理过程当中，加入正丙醇后40℃旋蒸，而正丙醇的沸点为97.4℃，为提高工作效率，本研究省去了此步骤。 《GB/T 22972-2008》[23]中5 种药物的平均回收率介于70.8%～93.6%之间；曾艳兵等[21]选用乙酸乙酯提取，Oasis HLB 固相萃取小柱净化后，5 种药物的平均回收率介于60.3%～90.9%之间，本研究利用乙腈提取后直接采用Prime HLB 固相萃取柱净化，液质联用测定5 种药物的回收率介于91.7%～97.8%之间，回收率明显提高，符合残留检测要求。 表明不同前处理方法，尤其是提取和净化条件，对试验结果影响较大[31]。 《GB/T 22972-2008》[23]中5 种药物的检出限分别为10 μg·kg-1(牛奶)和80 μg·kg-1(奶粉)，本研究中5 种药物的检出限处于0.1 ～3.0 μg·kg-1范围内，但陈莹等[32]利用乙酸乙酯提取，Oasis HLB 固相萃取小柱净化动物组织后，苯并咪唑类药物的检出限为0.1 ～0.5 μg·kg-1，结果与本研究有差异，推测可能由于基质成分的不同或前处理方法具有针对性，导致灵敏度和检出限不同，如不同种类的固相萃取柱对除油脂、蛋白质、糖分等其他杂质具有不同的效果。 因此，后续研究可针对不同基质的特性，筛选最优的净化条件，进一步降低该类药物的检出限，为相关检测技术部门提供技术支持。

本研究结果表明，在市场随机购买的3 种品牌牛奶及奶粉中均未检测到以上5 种苯并咪唑类药物。 推测其原因，在奶牛饲养过程中该类药物早期使用或未使用，且原料的选择经过一定的周期，药物随着生理活动排出体外，未造成体内残留。

4 结论

本试验通过对前处理包括提取、净化方式及色谱条件的优化，建立了固相萃取结合超高效液相色谱—串联质谱法同时测定牛奶及奶粉中5 种苯并咪唑类药物分析方法。 该方法操作简单、快速、灵敏度高、基质效应不明显，能够满足牛奶和奶粉中5 种苯并咪唑类药物的检测要求，同时在样品前处理以及仪器条件上有了较大改进，突出了Prime HLB 固相萃取净化技术的重要性及可行性，展现了仪器条件的先进性，并获得了良好的试验结果，可为检测牛奶和奶粉中的兽药残留提供检测技术支持。