菲对蒿柳生理生化特性的影响

李 霞 马晓东 程运河 翟飞飞 刘俊祥 孙振元 韩 蕾

(1中国林业科学研究院林业研究所/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091；2菏泽学院农业与生物工程学院(牡丹学院)，山东 菏泽 274000；3北京市林业果树科学研究院，北京 100093；4 河南理工大学建筑与艺术设计学院，河南 焦作 454000)

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)主要来自工业生产(如焦炭和煤焦油的生产、原油及其衍生物的精炼和分馏等)以及有机物的不完全燃烧等过程，广泛分布于大气、土壤和水体中[1]。 PAHs 具有诱变和致畸特性[2-3]，可被植物或动物吸收，进入食物链威胁人类健康。 在中国东部109 个农业土壤点收集的表层土壤样本中，PAHs 的总浓度介于8.8～3 880 μg·kg-1之间[4]。 菲是三环的PAHs，因其在环境中浓度较高，且是美国环保局选定的16 种PAHs 优先污染物之一，已成为植物与PAHs 互作机制研究的代表[5]。 植物可以通过直接吸收[6]、根系分泌物降解[7]及与微生物互作[8]等方式来降解PAHs。 与草本植物相比，木本植物具有生物量大、生命周期长、根系空间分布更广等优势。 与生长较快的洋白蜡(Fraxinus pennsylvanica)、 杨树(Populusdeltoides×P. nigraDN 34)相比，黑柳(Salix nigra)对土壤中PAHs 的降解率更高[9]。 而蒿柳(Salix viminalis)对土壤中PAHs 也具有较好的降解效应。 研究表明，将蒿柳种植于PAHs 含量较高的杂酚油土中，10 周后，蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘的含量分别降低67%、79%、77%和43%，而未种植蒿柳土壤中，荧蒽和芘的浓度分别降低35%和19%，蒽和苯并[a]芘未降解[10]。

植物长期种植于PAHs 污染土壤中，其生长会受到抑制，高浓度PAHs 会导致植物细胞坏死，从而影响植物对环境的修复效应。 土壤中芴浓度超过一定阈值时，小麦(Triticunt aestivum)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和向日葵(Helianthus annuus)的株高、干重和鲜重均受到抑制[11]。 Alkio 等[12]将拟南芥(Arabidopsis thaliana)移植到含菲的培养基上，6 h 后就检测到死细胞，12 h 后50%的植株死亡。 因此，研究PAHs 对植物生理生化的影响机制非常重要。 光合作用是植物代谢的能量来源，光合器官的损伤会影响植物细胞的生理活动，抑制植物生长。 对番茄(Lycopersicon esculentum)叶片喷施荧蒽，30d后，气孔导度( stomatal conductance，Gs)、PS Ⅱ的最大光化学效率(maximal photochemical efficiency，Fv/Fm)、叶绿素a(chlorophyll a，Chl a)和叶绿素b(chlorophyll b，Chl b)均显著降低[13]。 Jin 等[14]将黄瓜(Cucumis sativus)叶片浸在菲溶液中4 h，发现PSⅡ活性(photosystem Ⅱactivity，PSⅡactivity)和Fv/Fm显著降低，电子传递速率受到抑制。 渗透调节是植物抵御逆境的重要机制之一。 而关于PAHs 对光合及渗透调节影响的研究多基于草本植物，缺乏对木本植物的研究，尤其对蒿柳的影响鲜见报道。

本研究以蒿柳为试验材料，通过水培的方式，研究不同浓度菲处理对蒿柳株高及生理的影响，在此基础上选用对植物生长具有显著抑制的最低浓度进行16 d的菲处理，从气体交换参数、光合色素、Rubisco 活性、叶绿素荧光参数及渗透调节物质的变化分析菲对蒿柳光合特性和渗透调节物质的影响机制，旨在为探究PAHs 对植物的毒害机制及加强植物的修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2019年3月中旬剪取种植于中国林业科学院试验基地蒿柳(引种于中科院沈阳生态所植物园)同一无性系的一年生枝条，直径1.0±0.2 cm，在水中剪成10 cm 长插条，扦插在灰色塑料箱(容量20 L)内，用PVC 板支撑并用海绵固定。 用自来水培养2 周后保留一个枝芽，改为用1/2 Hoagland′s 营养液培养，每3 d 换一次营养液，继续培养8 周后，用于后续试验。供试有机污染物为菲(纯度＞97%)，25℃纯水中溶解度为7.3 μmol·L-1。

1.2 试验设计

将长势一致的蒿柳移入玻璃容器中适应1 周后再进行后续处理。 先用甲醇溶解菲，再与蒸馏水配制的改良1/2 Hoagland′s 营养液混合，制成菲浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.2 mg·L-1的处理液，以未加菲的蒸馏水配制的改良1/2 Hoagland′s 营养液为对照(CK)，pH 值6.0。 营养液(CK 与处理)中甲醇浓度为0.05%，甲醇浓度小于0.1%的营养液对植物根系生长无影响[15]。 容器外壁用锡箔纸包裹，保持根系和溶液避光且防止菲的光降解。 每2 d 更换一次处理液，每4 d 随机交换容器在温室中的位置，自然光照，对培养液全程通氧。 于试验第0 和第8 天测定蒿柳的株高，第8 天测定根系活力以及根系和叶片的电导率。

根据前期试验结果，选择对植物生长有显著抑制的最低浓度，处理方法同上。 于试验第0、第4、第8、第12 和第16 天测定光合色素、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质含量以及Rubisco 活性；第5、第10 和第15 天测定植株气体交换参数和叶绿素荧光参数。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 株高、电导率和根系活力的测定 随机选取4组植株作为4 个重复，每组3 株，用直尺测量植株基部至顶梢的长度。 叶片电导率取植株中上部叶片，根系电导率取中下部分，采用高俊凤[16]的方法测定。 根系活力取根系中下部分，采用TTC 法测定(根系活力试剂盒，北京雷根生物公司生产)。

1.3.2 气体交换参数的测定 CK 与处理各设置4 个重复。 选取蒿柳上部第5 片完全展开叶，采用Li-Cor 6400 便携式光合测定仪(LI-COR，USA)进行气体交换参数测定，包括净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、胞间CO2浓度(inter cellular CO2concentration，Ci)、Gs 和蒸腾速率(transpiration rate，Tr)。 测定前，植株先在光下活化30 min，测定时控制叶室CO2浓度为400 μmol·mol-1，红蓝光源光强为1 200 μmol·m-2·s-1，温度25℃，叶室内叶片长度为3 cm，叶室两头及中间叶宽用直尺测定，叶片面积按2 个梯形计算。 然后将实际叶片面积输入Li-Cor 6400 的输出文件，自动重新计算各参数。

1.3.3 光合色素含量和Rubisco 活性测定 CK 与处理各设计3 个重复。 取蒿柳中上部叶片，去除主脉后剪成0.3 cm×0.3 cm 大小。 称0.2 g 叶片置于试管中，用80%丙酮溶液定容至20 mL，黑暗浸提48 h 后，测定663、645 和470 nm 波长处的吸光度值，并计算Chl a、Chl b 和类胡萝卜素(carotenoid，Car)含量[17]。取蒿柳中上部叶片剪碎混匀，放入液氮迅速冷冻，冷冻研磨后称取0.1 g，加入1 mL 提取液(Tris-盐酸，KCl，EDTA)，冰浴匀浆后超声破碎，然后4℃、8 000×g离心10 min，取上清，测定340 nm 波长处的吸光度值，计算Rubisco 活性[18]。

1.3.4 叶绿素荧光参数测定 CK 与处理各设置4 个重复。 选取蒿柳上部第5 片完全展开叶，使用FluorPen FP100 手持式叶绿素荧光仪(北京澳作生态仪器有限公司)，在叶片暗适应30 min 后读取蒿柳中上部叶片的叶绿素荧光参数，包括Fv/Fm、PSⅡ潜在活性(PSⅡpotential activity，Fv/F0)、非光化学淬灭系数(non photochemical coefficient，NPQ)和光化学淬灭系数(photochemical coefficient，qP)。

1.3.5 渗透调节物质的测定 CK 与处理各设置3个重复，取蒿柳中上部叶片剪碎混匀，放入液氮迅速冷冻，冷冻研磨后称量。 脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法[19]，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[20]，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[21]。

1.4 数据分析

生理指标数据采用Excel 2016 统计整理，采用GraphPad Prism Version7.0(GraphPad software，La Jolla，CA，USA)作图，并进行单因素、双因素方差分析和多重比较。 试验数据均为重复测定的平均值±标准误差。

2 结果与分析

2.1 不同浓度菲处理对蒿柳株高及生理的影响

由表1 可知，与CK 相比，0.2 和0.5 mg·L-1菲处理对蒿柳的株高增长量、根系活力及电导率均无显著影响；1.0 和1.2 mg·L-1菲处理株高增长量、根系活力及电导率均具有显著影响。 1.0 与1.2 mg·L-1菲处理之间的根系活力和根系电导率差异显著，株高增长量和叶片电导率无显著差异。 表明菲浓度≥1.0 mg·L-1时，蒿柳生长受到抑制，且对生理指标具有显著影响，后续选用1.0 mg·L-1菲浓度进行试验。

表1 不同浓度菲对蒿柳株高及生理的影响(第8 天)Table 1 Effects of different phenanthrene concentration on relative height and physiology of Salix viminalis (at 8th day)

2.2 菲胁迫下蒿柳叶片光合特性的变化

2.2.1 菲胁迫下蒿柳气体交换参数的变化 由图1可知，菲胁迫下，蒿柳叶片的Pn、Gs、Ci 和Tr 整体较CK 显著或极显著降低。 与CK 相比，Pn、Gs、Ci 和Tr在第5、第10 天的降幅较大，第5 天分别降低23.0%、33.3%、3.5%、25.7%，第10 天分别降低14.1%、47.0%、19.6%和35.5%。

2.2.2 菲胁迫下蒿柳光合色素和Rubisco 活性的变化 由图2 可知，菲胁迫下，蒿柳叶片的Chl a 和Chl b整体较CK 降低，且Chl a 在处理第12 天，Chl b 在处理第8 天较CK 显著降低；Car 含量与CK 差异不显著；Rubisco 活性在整个处理过程中均极显著低于CK，在处理第4、第8、第12 和第16 天分别为CK 的65.7%、84.6%、85.0%和85.7%。

2.2.3 菲胁迫下蒿柳叶绿素荧光参数的变化 由图3 可知，与CK 相比，菲胁迫后蒿柳叶片的Fv/Fm和Fv/F0均未发生显著变化；NPQ 仅在第5 天时较CK显著降低，为CK 的82.2%；qP 则一直显著或极显著低于CK，在处理第5、第10 和第15 天分别为CK的46.4%、86.5%和80.5%。

图1 菲胁迫下蒿柳Pn、Ci、Gs 和Tr 的变化Fig.1 Changes of Pn，Ci，Gs and Tr of Salix viminalis under phenanthrene treatment

2.3 菲胁迫下蒿柳叶片渗透调节物质的变化

图3 菲胁迫下蒿柳Fv/Fm、Fv/F0、qP 和NPQ 的变化Fig.3 Changes of Fv/Fm， Fv/F0，qP and NPQ of Salix viminalis under phenanthrene treatment

渗透调节物质的合成，是植物抵御逆境的生理机制之一。 菲胁迫下，蒿柳叶片的脯氨酸含量在第8、第12、第16 天较CK 极显著上升，分别为CK 的1.2、1.15和1.17 倍(图4-A)；可溶性糖含量在处理第4 和第8天极显著上升，为CK 的1.14 和1.21 倍(图4-B)；可溶性蛋白质含量则与CK 均无显著差异(图4-C)。

图4 菲胁迫下蒿柳渗透调节物质的变化Fig.4 Changes of osmotic regulators of Salix viminalis under phenanthrene treatment

3 讨论

3.1 不同浓度菲对蒿柳的影响

在环境胁迫下，植物体生长和生理遭受伤害都有一定的浓度阈值。 土壤中芘浓度大于50 mg·kg-1时，菠菜苗期的株高、根和茎叶的鲜重显著降低，芘浓度大于100 mg·kg-1时，收获期的根和茎叶干重受到抑制[22]。 本研究通过分析不同浓度菲处理下蒿柳株高、根系活力、根系电导率和叶片电导率发现，1.0 mg·L-1菲处理开始使蒿柳根系膜透性增大，根系活力受到抑制，株高增长量显著下降，因此选用该浓度研究菲对蒿柳光合特性和渗透调节物质的影响机理。

3.2 菲对蒿柳光合特性的影响

光合速率的降低是多种因素共同作用的结果，包括气孔和非气孔因素。 气孔的开度对控制植物和环境之间CO2、O2和H2O 的流动至关重要。 本研究中菲胁迫使蒿柳叶片的Gs 和Ci 降低，影响其CO2吸收。 有研究发现紫花苜蓿吸收菲后，菲主要分布在气孔保卫细胞及附近的表皮细胞[23]，但是否由于保卫细胞和副卫细胞失水、膨压降低，造成气孔的开闭受到影响[24]，尚待进一步研究。 此外，蒿柳叶片Gs 和Tr 降低，可以减少水分散失，提高保水能力，是植物对不利环境的一种适应性策略，但CO2输入的减少对光合作用是不利的。

光合作用包括光反应和暗反应，光合色素是植物光反应的重要部分，光合色素通常包括Chl a、Chl b 和Car。 Chl a 可将光能转化为化学能，Chl b 则收集与传递光能，过量的光能会损伤光合系统，Car 可快速淬灭激发态叶绿素，发挥光保护剂的作用。 研究表明，PAHs 可以破坏植物的光合色素，对豌豆进行1 mg·L-1的荧蒽处理，25 d 后其光合色素含量显著降低[25]。 本研究中菲胁迫下蒿柳叶片的Chl a 和Chl b均在处理中期低于CK，说明菲对Chl a 和Chl b 具有一定的影响，导致植物体对光能的吸收能力有所下降。CO2同化酶Rubisco 是光合作用碳反应的主要催化剂[26-27]，卡尔文循环的第一步羧化反应由叶绿体中Rubisco 催化完成。 Huang 等[28]研究表明，蒽抑制了浮萍(Lemna gibba)的碳固定，从而降低了光合作用。本研究结果与之类似，菲胁迫后，蒿柳叶片的Rubisco活性均显著低于CK，导致CO2同化受到抑制，说明Rubisco 活性降低，从而碳固定受到影响，导致菲胁迫后光合速率下降。

Fv/Fm是指原初光化学反应的最大量子产额，通常用来衡量PSⅡ利用光能的能力。Fv/F0代表植物受胁迫后PSⅡ潜在活性的变化。 NPQ 反映PSⅡ反应中心对天线色素吸收过量光能后的热耗散能力及光合机构的损伤程度[29]。 Jajoo 等[30]将拟南芥种植于土壤和蛭石(1 ∶1)中，分别用25 μmol·L-1的萘、蒽、芘每天浇灌，5 周后，植物生长受到抑制，PSⅡ活性显著降低。 本研究与其结果不同，1.0 mg·L-1菲胁迫下，虽然蒿柳生长受到抑制，但其Fv/Fm和Fv/F0均无显著变化，说明PSⅡ原初光能转化效率和潜在活性未受到影响，这与PAHs 的浓度以及植物的种类有关，说明蒿柳在一定浓度的菲胁迫下，首先受影响的不是PSⅡ潜在活性。 NPQ 在菲胁迫第5 天较CK 显著降低，之后与CK 相比差异均不显著，说明蒿柳在菲胁迫初期，通过热耗散减轻过剩光能伤害的能力降低，导致其容易受到高温等逆境的伤害。 光化学淬灭反映了PSⅡ原初电子受体QA 的氧化还原状态和PSⅡ开放中心的开放程度，其系数qP 可以反映PSⅡ的电子传递活性的大小[29]。 qP 在菲胁迫第5 和第15 天显著低于CK，说明类囊体膜中光化学电子传递的份额有显著变化，这与Kummerová 等[25]和Jin 等[14]的研究结果一致。Duxbury 等[31]利用14C 标记PAHs，发现PAHs 可在植物的类囊体膜上积累，从而影响叶绿体的有序排列，干扰电子传递。 此外，PAHs 转化的产物，特别是醌类化合物，可能影响PSⅡ和PSI 的电子运输[32]。 本研究中，菲抑制了PSⅡ电子传递活性，但其影响机制尚不清楚，应结合菲在植物体内的分布和代谢做进一步研究。

3.3 菲对蒿柳渗透调节物质的影响

渗透调节物质的积累是植物提高自身耐性的一个重要途径，不同植物其渗透调节物质的响应机制不同。如秋茄[Kandelia candel(L.)Druce]叶片的可溶性糖含量随着PAHs 浓度的增加而增加[33]，而拟南芥叶片的可溶性糖含量则随着蒽胁迫浓度的增加而减少[34]。Sivaram 等[35]通过代谢组学研究得出芘可诱导玉米叶片的脯氨酸含量显著上升。 本研究中，菲胁迫后蒿柳叶片的可溶性蛋白质含量与CK 相比无显著差异，而脯氨酸和可溶性糖含量显著增加，说明蒿柳可以通过这2 种渗透调节物质抵御菲胁迫，增加细胞内的溶质浓度，调节渗透势，增强其适应性，其中可溶性糖主要参与对菲的早期响应。

4 结论

随着菲浓度的增加，蒿柳的生长和根系活力受到抑制，膜透性增大，表明菲对蒿柳具有毒害作用。 菲浓度为1.0 mg·L-1时，蒿柳叶片的光合能力降低。 菲胁迫使qP 显著下降，PSⅡ的电子传递活性受到抑制，光反应受到影响；同时Gs 和Ci 下降、Rubisco 活性显著降低，CO2供应和同化减少，暗反应受到抑制，导致叶片光合作用下降。 此外，脯氨酸和可溶性糖是抵御菲胁迫的重要渗透调节物质。 本研究为探究菲对木本植物的毒害机制奠定了基础，今后还需进一步研究菲抑制Rubisco 活性的原因，探究是否由于菲在植物体内发生了代谢，改变了胞内环境，从而影响了该酶的激活。