大豆低植酸突变体籽粒的抗氧化性分析

袁凤杰 竹龙鸣 郁晓敏 傅旭军 杨清华 金杭霞 吕晓男

(1 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江 杭州 310021；2 农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021)

大豆是重要的植物蛋白来源，在人类和动物的营养中具有极其重要的作用。大豆籽粒中60%～80%的磷元素以植酸(肌醇六磷酸)形式存在[1]。植酸与大豆籽粒中的钙、铁、镁、锌等二价阳离子螯合，形成不可溶的植酸盐；在种子萌发过程中，在内源植酸酶的作用下，这些植酸盐被分解释放出金属离子和磷元素，用于调节植物体中金属离子的含量和分布，并满足种子萌发过程中代谢活动的需求，维持植物体中无机磷的水平[1-3]。因此，植酸在种子萌发过程中具有重要的作用。体外试验结果表明，植酸通过螯合铁离子来抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的形成和脂质氧化过程，植酸的这种功能确保了种子在含有二价铁离子、氧以及不饱和脂肪酸的情况下仍能保存较长的时间[4-6]，因此植酸的抗氧化性对于作物籽粒的耐储性具有重要的意义。然而植酸本身存在抗营养性，并会带来环境问题[4,7-8]，研究人员希望降低籽粒中植酸含量以提高大豆的营养特性，解决磷元素的浪费和对环境的污染问题。目前已有关于大豆等作物的低植酸突变体及其特性和突变机制的相关研究报道[9-12]。

由于植酸的抗氧化性能，以及对种子储存、萌发和幼苗生长所具有的重要功能，低植酸突变体势必改变籽粒的抗氧化能力，进而造成籽粒活力下降，成苗率降低，这种现象在大豆[13-16]、大麦[17]、水稻[18]、玉米[19]、小麦[20]、拟南芥[21]和蚕豆[22]的低植酸突变体中已有相关报道。关于玉米低植酸突变体的研究发现，植酸在籽粒成熟后期发挥重要的抗氧化作用，直接或间接影响与抗氧化相关的游离铁离子浓度、自由基浓度、蛋白质羰基化程度、DNA损伤程度和维生素E含量[5]。在大豆低植酸突变体籽粒中，籽粒活力下降尤为突出，目前所报道的突变体中除Gm-lpa-ZC-2外，其余突变体均存在籽粒活力和耐储性不同程度下降的问题[23-26]，表明低植酸性状籽粒活力在不同突变体中表现不尽相同，这可能与不同的突变基因相关，如突变体Gm-lpa-TW-1的低植酸性状由肌醇-3-磷酸合成酶基因(MIPS1)缺失突变引起[27]，籽粒的萌发和田间出苗率均显著降低；而突变体Gm-lpa-ZC-2的低植酸性状由GmIPK1基因的1个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)突变所导致，籽粒活力无明显下降[16,23,28]。此外，由低植酸引起的籽粒活力下降是可以改变的，Gm-lpa-TW-1-M为Gm-lpa-TW-1自然突变体，保持了GmMIPS1基因突变引起的低植酸性状，同时籽粒活力无明显下降，但其调控机制尚不明确。关于植酸含量下降，植酸突变基因对植物籽粒活力所造成的伤害机理，目前也有一些探索性的研究报道，如拟南芥中MIPS1的突变研究表明，突变体中肌醇、脱落酸、磷脂酰环己六醇和鞘脂类的含量发生改变，而这些物质对于拟南芥籽粒的正常发育、种子的抗非生物胁迫和抑制细胞死亡的发生是必须的；突变导致了植株长势矮小、叶片卷曲和籽粒中组织坏死[29]。但目前大豆籽粒中植酸含量变化是否通过影响籽粒氧化能力以及其他抗氧化物质的含量和活力进而导致籽粒活力下降还不明确。

本研究通过测定低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2、Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-TW-1-M和野生型亲本浙春3号、台湾75大豆籽粒发育过程中总抗氧化能力、抗氧化性物质谷胱甘肽和氧化反应产物(脂质氧化产物、丙二醛和蛋白质羰基化产物)含量，以及抗氧化酶类(过氧化物酶、过氧化氢酶)活力变化，研究大豆籽粒中植酸含量改变可能导致的籽粒抗氧化能力变化及相关物质代谢差异，旨在探明大豆植酸含量下降是否影响籽粒抗氧化能力，为进一步研究低植酸突变体籽粒活力下降机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料及样品的制备

供试材料为低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2、Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-TW-1-M和野生型亲本浙春3号、台湾75的大豆种子。其中，浙春3号由浙江省农业科学院选育并提供；台湾75由亚洲蔬菜研究中心引进，浙江省农业科学院提供，为沿海地区出口加工的鲜食大豆品种；低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2由浙春3号通过辐射诱变获得；低植酸突变体Gm-lpa-TW-1是台湾75通过辐射诱变而得[8-9]；Gm-lpa-TW-1-M为Gm-lpa-TW-1的自然突变体，二者低植酸性状具有相同的突变位点，但Gm-lpa-TW-1-M的发芽特性显著优于Gm-lpa-TW-1[28]。

低植酸突变体Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-TW-1-M、Gm-lpa-ZC-2 以及其野生型亲本台湾75 和浙春3号种子于2015年春季种植于浙江省农业科学院试验田。每种材料种植3个平行小区(1.2 m×6 m)，种植行距为40 cm，株距为20 cm。播种日期为2015年4月5日，待植株进入籽粒成熟期，即R6～R8期开始取样，每隔7 d取样1次。取样方法为每株每个结荚位点取1个荚，每个小区所取荚混合，每个材料3个种植小区为3个生物重复；取样时间分别为6月25日，7月2日，7月9日，7月16日和7月23日。样品采集后剥出籽粒用超纯水洗净后分装，液氮迅速冷冻，置于-80℃冰箱保存。取适量冷冻的籽粒，在CryoMill MM400组织冷冻混合球磨仪(Verder Retsch Shanghai Trading Co., Ltd.)中冷冻研磨，取1 g冻干粉状组织，加入9 mL生理盐水，制成10%大豆组织匀浆液，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 植酸磷含量的测定 取100 g大豆籽粒样品(最后一个时间点的样品)，去杂选净，置于真空干燥箱中，60℃真空干燥72 h，LK-400B旋风粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)粉碎，过60目网筛后置于干燥器中，低温干燥保存。

提取：将大豆样品用索氏抽提法进行去油处理。取0.4 g无油大豆样品于50 mL离心管，加入20 mL 0.4 mol·L-1HCl提取液4℃震荡18～24 h后，15 000 r·min-1、 4℃离心30 min，保留上清液。取10 mL上清液至50 mL离心管中，加入10 mL ddH2O和5 mL混合液(15 mmol·L-1FeCl3和0.2 mol·L-1HCl)，沸水浴30 min，冰浴冷却后10 000 r·min-1、4℃离心15 min，弃上清液，然后向沉淀中加入1 mL 1.5 mol·L-1NaOH，振荡充分反应后8 000 r·min-1离心10 min，上清液即为植酸磷提取液，于2 mL离心管中保存。

测定：取适量的植酸磷提取液用0.2 μm滤膜过滤，并稀释6倍。吸取0.5 mL稀释液通过用0.25 mol·L-1HNO3平衡的Dionex IonPac AS7(美国Dionex公司)阴离子交换柱和IonPac AG7(美国Dionex公司)保护柱。洗脱液流速为1 mL·min-1；衍生液为0.1%Fe(NO3)3和2%HClO4的混合液，流速为0.8 mL·min-1。 柱后监测器波长为290 nm。用肌醇六磷酸钠(P-3168，美国Sigma公司)作为标准样品。

1.2.2 总蛋白含量的测定 取10%大豆组织匀浆液，按照A045-2蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行蛋白含量的检测。

1.2.3 总抗氧化能力分析 取0.5 mL 10%大豆组织匀浆液，按照总抗氧化能力测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行总抗氧化能力的测定。

1.2.4 过氧化物酶和过氧化氢酶活力的测定 取0.1 mL 10%大豆组织匀浆液，按照过氧化物酶活力测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行过氧化物酶活力的测定。取0.2 mL 10%大豆组织匀浆液，按照过氧化氢酶活力测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行过氧化氢酶活力的测定。

1.2.5 谷胱甘肽含量的测定 按照谷胱甘肽(glutathione，GSH)(除蛋白)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行谷胱甘肽含量的测定。

1.2.6 脂质过氧化产物和丙二醛含量测定 按照脂质过氧化产物测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)和丙二醛测定试剂盒进行脂质过氧化产物和丙二醛含量的测定。

1.2.7 蛋白羰基化产物含量测定 按照蛋白羰基化产物测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行蛋白羰基化产物含量的测定。

2 结果与分析

2.1 大豆籽粒中植酸磷含量分析

由表1可知，野生型亲本台湾75植酸磷含量略低于浙春3号，两者差异不显著，而3个突变体中植酸磷含量均显著或极显著低于野生型亲本。此外，突变体Gm-lpa-TW-1的植酸磷含量与突变体Gm-lpa-TW-1-M无显著差异，但二者与野生型亲本台湾75相比，植酸磷含量均下降60%以上，差异达到极显著水平；突变体Gm-lpa-ZC-2植酸磷含量较浙春3号平均下降40%左右，差异达到显著水平。以上结果说明不同基因突变导致的植酸磷含量下降程度有所不同，Gm-lpa-TW-1与Gm-lpa-TW-1-M(GmMIPS1 突变)籽粒中植酸磷含量较其亲本下降量多于Gm-lpa-ZC-2(GmIPK1突变)籽粒中植酸磷含量较其亲本的下降量。

表1 大豆低植酸突变系与其亲本籽粒中植酸磷含量分析Table 1 The content of phytic acid P in the seeds of low phytic acid mutants and their wide type parents.

2.2 大豆籽粒中总抗氧化能力分析

大豆发育过程中，随着种子的成熟，所有参试材料籽粒的总抗氧化能力均呈逐步下降的趋势。其中，低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2在6月25日和7月2日样品中的总抗氧化能力显著低于野生型亲本浙春3号，随着大豆籽粒的发育成熟，突变体Gm-lpa-ZC-2与野生型亲本浙春3号的成熟籽粒的总抗氧化能力无显著差异(图1-A)。低植酸突变体Gm-lpa-TW-1的总抗氧化能力低于其野生型亲本台湾75，两者差异不显著，而突变体Gm-lpa-TW-1-M的总抗氧化能力均高于台湾75和突变体Gm-lpa-TW-1。各参试材料6月25日所采样品中总抗氧化能力最强，7月23日采集的样品最弱。在所有参试材料中，突变体Gm-lpa-TW-1的总抗氧化能力最弱，而浙春3号和突变体Gm-lpa-TW-1-M的抗氧化能力最强。上述结果说明，植酸含量的下降与籽粒总抗氧化能力的强弱无明确相关性；成熟籽粒中突变体与亲本的总抗氧化能力差异较小。突变体Gm-lpa-TW-1的总抗氧化能力最弱，且其籽粒活力也是最低的[13]，因此，籽粒的总抗氧化能力会影响籽粒活力。但在其他突变体中未发现此现象，说明植酸不是影响籽粒总抗氧化能力的主要因素。

2.3 大豆籽粒中抗氧化酶类活力分析

注：*和**分别表示低植酸突变体与野生型亲本分别在0.05和0.01水平的差异显著。下同。Note: * and ** indicate that the low phytic acid mutant and the wild type significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as following.图1 大豆籽粒发育过程中总抗氧化能力的变化Fig.1 The change of total anti-oxidative composition during the development of soybean seeds

由图2-A、B可知，大豆籽粒发育过程中，各参试材料的过氧化物酶活力均表现为下降趋势。随着籽粒的发育成熟，过氧化物酶含量呈降低趋势。参试材料之间的过氧化物酶活性差异表现为，浙春3号与其突变体Gm-lpa-ZC-2之间在籽粒发育的各个时期差异不显著；台湾75的过氧化物酶活力在7月2日所取样品中显著低于突变体Gm-lpa-TW-1-M，随着籽粒的发育成熟，台湾75的过氧化物酶活力较其突变体Gm-lpa-TW-1和Gm-lpa-TW-1-M高，7月23日采集的样品中，台湾75的过氧化物酶活力显著高于突变体Gm-lpa-TW-1和Gm-lpa-TW-1-M，且Gm-lpa-TW-1-M的过氧化物酶活力也高于Gm-lpa-TW-1。

由图2-C、D可知，大豆籽粒的发育过程中，所有参试材料过氧化氢酶活力均呈下降趋势，其中浙春3号与突变体Gm-lpa-ZC-2的酶活力，除7月16日采集的样品外，其他均无显著差异；突变体Gm-lpa-TW-1-M的过氧化氢酶活力则除7月9日采集的样品外，其余均极显著高于突变体Gm-lpa-TW-1和台湾75。总体而言，浙春3号、Gm-lpa-ZC-2和Gm-lpa-TW-1-M的过氧化氢酶活力在籽粒的整个发育过程中较高，而台湾75和Gm-lpa-TW-1的过氧化氢酶活力较低，其中低植酸突变体Gm-lpa-TW-1的过氧化氢酶活力最低。由此说明，过氧化物酶和过氧化氢酶的活力是影响总抗氧化能力的主要因子之一，也是影响籽粒活力的主要因素。

图2 大豆籽粒发育过程中过氧化物酶和过氧化氢酶活力的变化Fig.2 The change of peroxidase activity and catalase activity during the development of soybean seeds

2.4 大豆籽粒中谷胱甘肽含量分析

由图3可知，大豆籽粒发育过程中谷胱甘肽含量具有一个累积峰值，台湾75、Gm-lpa-TW-1和Gm-lpa-TW-1-M的累积峰值出现在7月2日左右，而浙春3号和Gm-lpa-ZC-2的累积峰值出现在7月9日左右；随着籽粒的发育成熟至7月23日时，各参试材料的谷胱甘肽含量降低至最低点。比较分析突变体与亲本的谷胱甘肽含量变化，发现在7月2日和6月25日采集的样品中，浙春3号的谷胱甘肽含量低于Gm-lpa-ZC-2，在累积峰值处高于突变体Gm-lpa-ZC-2；在6月25日采集的样品中，台湾75的谷胱甘肽含量显著低于突变体Gm-lpa-TW-1-M，而高于突变体Gm-lpa-TW-1，至累积峰值处(7月2日)，三者之间无显著差异，随着籽粒的进一步发育成熟，Gm-lpa-TW-1-M的谷胱甘肽含量除7月16日外，均极显著高于台湾75。大豆籽粒谷胱甘肽含量跟籽粒总抗氧化能力只在籽粒成熟中后期具有一定相关性，说明谷胱甘肽对总抗氧化能力具有一定的影响，但不是主要影响因素。此外，大豆籽粒中谷胱甘肽代谢与植酸代谢并不具有明显的关联，不是影响籽粒活力的主要因子。

图3 大豆籽粒发育过程中谷胱甘肽含量的变化Fig.3 The change of glutathione content during the development of soybean seeds

2.5 大豆籽粒中脂肪氧化产物含量分析

由图4-A、B可知，大豆籽粒发育过程中，随着种子的成熟，各参试材料脂质过氧化物含量呈逐步增加的趋势，其中7月23日浙春3号脂质过氧化物含量极显著高于突变体Gm-lpa-ZC-2。在籽粒成熟的整个过程中，台湾75与突变体Gm-lpa-TW-1脂质过氧化物含量变化趋势不明显；而突变体Gm-lpa-TW-1-M的脂质过氧化物含量增加明显，且其脂质过氧化物含量在籽粒发育后期(7月16日、7月23日)显著高于台湾75。

由图4-C、D可知，大豆籽粒中丙二醛含量与脂质过氧化物含量的变化趋势较一致。浙春3号及其突变体Gm-lpa-ZC-2的丙二醛含量在籽粒成熟后期明显增加(7月23日左右)，其中7月2日和7月16日采集的样品中浙春3号含量显著高于突变体，其他时期差异不显著。 而台湾75及其突变体Gm-lpa-TW-1、Gm-lpa-TW-1-M的丙二醛含量在整个籽粒发育过程中具有波动性，其中Gm-lpa-TW-1-M的丙二醛含量呈增加趋势，成熟后期其丙二醛含量增加明显且显著高于台湾75。

图4 大豆籽粒发育过程中脂质化过氧化物及丙二醛含量的变化趋势Fig.4 The change of lipid oxides and malondialdehyde content during the development of soybean seeds

2.6 籽粒中蛋白羰基化产物含量分析

由图5可知，大豆籽粒发育过程中，随着籽粒的发育成熟，各参试材料蛋白羰基化合物含量呈现逐渐增加的趋势。其中台湾75和突变体Gm-lpa-TW-1的蛋白羰基化合物含量增加最明显，且其含量在籽粒成熟期极显著高于突变体Gm-lpa-TW-1-M；浙春3号和Gm-lpa-ZC-2的蛋白羰基化合物含量较相近，两者差异不显著。大豆籽粒发育过程中蛋白羰基化与脂质氧化受总抗氧化能力的影响。而突变体Gm-lpa-TW-1-M籽粒中低含量蛋白羧基化产物可能是维持其高籽粒活力的原因之一。

图5 大豆籽粒发育过程中蛋白羰基化合物含量的变化Fig.5 The change of protein carbonyl compounds content during the development of soybean seeds

3 讨论

抗氧化系统对种子活力具有显著影响[30-31]，而抗氧化体系包括酶促保护体系(如过氧化物酶、过氧化空酶、多酚氧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱苷肽过氧化物酶等)和非酶抗氧化剂体系(如谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素E 等)[32]。植酸具有强酸性，其能与金属离子螯合从而缓解氧化反应的进行，同时对自由基具有较强的清除能力，是一种重要的非酶抗氧化剂[33]。本研究结果表明，大豆籽粒中植酸含量的下降对籽粒发育前期的总抗氧化能力影响较大，对成熟籽粒的总抗氧化能力影响较小。同样，作为非酶抗氧化剂的谷胱甘肽在大豆籽粒中对总抗氧化能力影响较小。随着籽粒的成熟，参试材料的总抗氧化能力均呈下降趋势，且低植酸突变体与野生型亲本的总抗氧化能力差异与过氧化物酶及过氧化氢酶的活力变化具有一定的一致性，不同之处在于总抗氧化能力差异不显著而过氧化物酶及过氧化氢酶活力在多个时间点差异显著，说明过氧化物酶及过氧化氢酶活力对总抗氧化能力具有较大的积极贡献。对比低植酸突变体和野生型亲本的总抗氧化能力发现，由于植酸磷含量的下降，突变体Gm-lpa-TW-1成熟籽粒的总抗氧化能力较其亲本台湾75有小幅下降；而Gm-lpa-ZC-2成熟籽粒的总抗氧化能力与其亲本基本无差异，表明因植酸磷含量降低而缺失的这部分抗氧化能力对于总抗氧化能力影响较小。其原因可能有两方面：一是因为非酶抗氧化剂植酸的抗氧化能力在大豆籽粒总抗氧化能力中的占比不大。二是可能存在代谢补偿，因植酸含量降低而缺失的这部分抗氧化能力通过其他抗氧化代谢途径或代谢物得到补偿。虽然具体的补偿机制尚不明确，但低植酸突变体Gm-lpa-TW-1-M具有比亲本高的总抗氧化能力，说明这种补偿途径是客观存在的。

植酸具有很强的铁离子螯合能力，能够抑制铁离子驱动的活性氧形成，具有较强的抗氧化功能[5]。植物籽粒成熟后期脱水过程中常伴随着ROS的积累，过多的ROS会破坏种子细胞氧化还原平衡，导致种子劣变，而籽粒活力低是低植酸突变体的一个明显特征，也是限制其在育种中应用的重要因素[34]。因此，籽粒成熟期保持较高的抗氧化能力水平，有利于维持种子活力，减少氧化反应带来的损伤。前期研究表明，低植酸突变体Gm-lpa-TW-1的籽粒活力较其亲本显著下降，而Gm-lpa-TW-1-M显著高于Gm-lpa-TW-1；Gm-lpa-ZC-2籽粒活力较其亲本浙春3号显著下降[28]。本研究表明，低植酸突变体Gm-lpa-TW-1-M、Gm-lpa-ZC-2和浙春3号的抗氧化能力处于较高水平，因此植酸含量的下降与籽粒抗氧化能力的强弱不具有相关性，但总抗氧化能力是影响大豆籽粒活力的重要因素之一。由此推测，植酸并非影响大豆籽粒活力的直接因素，低植酸突变体Gm-lpa-TW-1成熟籽粒活力下降的原因可能是由于GmMIPS1基因突变导致除植酸合成途径外其他代谢途径的调整导致的。

此外，Gm-lpa-TW-1-M是Gm-lpa-TW-1的自然突变体，突变机制目前还不清楚，而根据本研究所测的多数指标如总抗氧化能力、蛋白质羧基化和谷胱甘肽含量发现，Gm-lpa-TW-1-M与Gm-lpa-ZC-2和浙春3号较相似。这为进一步探索Gm-lpa-TW-1-M的突变机制以及提高低植酸突变体籽粒活力提供了参考。

植酸易与游离脂肪酸和过氧化氢相结合，中断或破坏油脂氧化过程的连锁反应，缓解和阻止脂质氧化反应的进行[8]。 但本研究结果显示，植酸对于大豆籽粒发育初期脂质氧化过程无显著影响，只对成熟籽粒中的脂质氧化过程产生了一定影响，如Gm-lpa-TW-1籽粒中脂质氧化产物显著高于其亲本台湾75；而Gm-lpa-ZC-2成熟籽粒中脂质氧化显著低于其亲本浙春3号。因此，脂质氧化程度对于大豆籽粒活力的影响还有待进一步研究。

4 结论

植酸具有较强的抗氧化性，对植物的生长发育具有重要的作用。本研究系统分析了3个大豆低植酸突变体与亲本之间抗氧化性能的差异，发现植酸含量与大豆籽粒发育中的总抗氧化能力及其他抗氧化性指标无相关性；综合前期研究发现，低植酸突变体的抗氧化性能与其籽粒的活力具有明确的相关性，但植酸含量与籽粒活力无明显关联。对低植酸突变体抗氧化性能力开展研究，可为提高低植酸作物的籽粒活力提供一定的理论基础。