辣椒重要农艺性状关联分析与优异等位变异发掘

袁欣捷 方 荣 周坤华 雷 刚 黄月琴 陈学军

(江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，江西 南昌 330200)

辣椒(Capsicumspp.)为茄科辣椒属蔬菜，2018年我国辣椒播种面积达213.3万hm2，在蔬菜作物中位居第一[1]。随着人们生活水平的提高，对辣椒品质和多样性的需求越来越高，给育种者带来了新的挑战。株高、始花节位、单果质量、果纵径、果横径、果形指数和果肉厚度是辣椒重要农艺性状，与其产量和品质密切相关，然而这些性状一般为数量性状，受多基因控制，易受外部环境因素影响[2-4]。连锁作图(linkage mapping)与关联分析(association analysis)是研究植物数量性状的主要方法，已广泛应用于农作物有益基因的挖掘[5-7]。

前人基于连锁作图方法，鉴定了辣椒株高、始花节位、单果质量、果纵径、果横径、果形指数和果肉厚度等性状的诸多数量性状位点(quantitative trait loci, QTL)，如Rao等[8]基于种间杂交的248株BC2植株检测到fw2.1等8个单果质量QTLs、fl2.1等6个果纵径QTLs、fs-3.1等4个果形指数QTLs和perwd1.1 等8个果肉厚度QTLs；Dwivedi等[9]基于重组自交系群体鉴定到株高QTL位点Qpht.iivr.5.1、果纵径QTLs位点Qfl.iivr.3.2和Qfl.iivr.3.4及果肉厚度QTL位点Qpt.iivr-2.1；Han等[10]基于120株重组自交系定位到6个株高QTLs、6个果纵径QTLs、4个果形指数QTLs和6个单果质量QTLs；周坤华等[11]联合应用辣椒种间F2和F2∶3两个群体，检测出株高、始花节位及果实相关性状共19个QTLs。上述研究结果为在分子水平上解析辣椒数量性状遗传机理提供了重要参考。但连锁作图分析方法受双亲遗传背景的限制，一个基因座只有2个等位基因，解析效率有限。而关联分析以自然群体为材料，无需耗时构建作图群体，能在众多种质材料中同时考察同一基因座的所有等位基因，找出关联位点[12-13]。

江西省农业科学院蔬菜花卉研究所茄果类蔬菜研究室前期基于简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记技术，对194份辣椒核心种质材料进行了群体结构分析与辣椒疫病抗性关联分析[14]，本试验在前期研究基础上，进一步深入对上述194份种质材料的株高、始花节位、单果质量、果纵径、果横径、果形指数和果肉厚度等重要农艺性状进行关联分析，以期找出显著关联SSR位点，挖掘优异等位变异及其载体材料，为辣椒相关农艺性状优异基因的发掘、分子标记辅助选择与聚合育种提供理论指导和材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为本研究前期构建的辣椒核心种质[15-16]中的194份一年生辣椒(Capsicumannuum)材料(表1)，包含樱桃椒(C.annuumvar.cerasiforme)、圆锥椒(C.annuumvar.conoides)、簇生椒(C.annuumvar.fascicutatum)、灯笼椒(C.annuumvar.grossum)和长椒(C.annuumvar.longum)5个变种。

表1 辣椒种质材料7个农艺性状表型值Table 1 The data of seven agronomic traits of the tested pepper

表1(续)

表1(续)

表1(续)

表1(续)

1.2 田间试验及性状调查

供试材料播种于江西省农业科学院蔬菜基地，采用大棚育苗定植，每份材料定植8株，随机取3株进行定株、定时观测记载，取平均值。定植行株距为65 cm × 40 cm，四周设保护行，田间管理与常规相同。

定植后50 d测定株高和始花节位，在座果盛期随机选取植株中部已充分发育的青熟果实3个(来自3株不同植株)测定单果质量、果纵径、果横径、果形指数(果纵径/果横径)和果肉厚度，取平均值。果纵径为果实纵剖面最长处即果顶到果基部的长度，果横径为果实最宽处横截面的直径，果肉厚度为果实最宽处横截面果肉的厚度。

1.3 SSR标记基因型鉴定

利用58对SSR引物[17-20]检测供试材料基因型。PCR反应体系：10×Buffer 1 μL，Mg2+0.8 μL，正向和反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq酶0.1 μL，灭菌超纯水5.1 μL，模板DNA 2 μL。PCR程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，以引物对中Tm值较低的引物Tm值减5℃作为退火温度，退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min。使用6%聚丙烯酰胺凝胶，银染法检测，统计多态性条带。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 22软件统计分析辣椒农艺性状，对各农艺性状进行正态性检测，对不符合正态分布的数据进行正态转换。基于前期对供试194份辣椒核心种质群体结构分析数据[14]，利用TASSEL 3.0软件中的广义线性模型(general linear model，GLM，Q)和混合线性模型(mixed linear model，MLM，Q+K)方法检测关联位点。根据无效等位变异方法[21]计算位点等位变异的表型效应，若效应值为正，则为增效等位变异，反之为减效等位变异。

2 结果与分析

2.1 供试材料7个农艺性状的表型变异与相关分析

194份辣椒核心种质农艺性状表型值详见表1。7个农艺性状表型变异系数为20.01%～121.23%，均大于20%，说明供试材料的表型变异丰富。其中，单果质量变异系数最大，为121.23%，变幅为1.1～ 246.7 g；株高变异系数最小，为20.01%，变幅为27.0～ 89.0 cm(表2)。

由表3可知，7个农艺性状间存在不同程度的相关性。株高与始花节位、果形指数，单果质量与果横径、果肉厚度，果纵径与果形指数、果肉厚度，果横径与果肉厚度之间均存在显著或极显著正相关性；株高与单果质量、果横径、果肉厚度，始花节位与单果质量、果纵径、果横径、果肉厚度，单果质量与果形指数，果横径与果形指数，果形指数与果肉厚度之间则呈显著或极显著负相关。

2.2 不同亚群种质农艺性状变异分析

群体结构分析将194份辣椒核心种质分为亚群1和亚群2两个亚群，分别包含126份和68份材料[14]。对两个亚群的7个农艺性状进行比较分析，结果显示(图1)，除果纵径外，亚群1与亚群2在株高、始花节位、单果质量、果横径、果形指数和果肉厚度方面均存在显著或极显著差异，亚群1的株高、始花节位和果形指数大于亚群2，但单果质量、果横径和果肉厚度则小于亚群2，7个农艺性状的盒形图较为直观地反映了两个亚群间的差异。

表2 辣椒7个农艺性状变异分析Table 2 Variation analysis for seven agronomic traits of pepper

表3 农艺性状相关分析Table 3 Correlation analysis among agronomic traits

注：箱图两端表示性状的极值范围；中间直线表示性状中位数；“*”表示两亚群间存在显著性差异(0.01

2.3 辣椒农艺性状与SSR标记的关联分析

GLM方法共检测到20个SSR标记与7个性状显著关联(P< 0.05)，其中，14个SSR标记与7个性状极显著关联(P< 0.01)。显著关联位点中，各位点对表型变异的贡献率为2.09%～21.91%，其中位于2号染色体的CAMS-327标记对单果质量的贡献率最高，为21.91%(表4)。

MLM方法共检测到17个SSR标记与7个性状显著关联(P< 0.05)，其中，4个SSR标记与4个性状极显著关联(P< 0.01)。显著关联的位点中，各位点对表型变异的贡献率为2.07%～7.24%，其中位于11号染色体的HpmsE132标记对单果质量的贡献率最高，为7.24%(表4)。

两种方法共检测到5个位点与株高相关联，分别位于2、4、6、7和8号染色体，贡献率为2.09%～3.94%(GLM方法)和3.15%～3.22%(MLM方法)，其中，8号染色体TC7268S位点贡献率最高，在GLM和MLM方法中均能检测到。

有7个位点与始花节位相关联，分别位于1、2、5、8和11号染色体，贡献率为2.13%～7.69%(GLM方法)和2.31%～3.39%(MLM方法)，其中，8号染色体的TC7268S位点贡献率最高，TC7268S和CAMS-327位点用两种方法均能检测到。

有13个位点与单果质量相关联，分别位于1、2、4、5、7、8、9和11号染色体，贡献率为3.69%～21.91%(GLM方法)和2.29%～7.24%(MLM方法)，其中，2号染色体CAMS-327位点和11号染色体HpmsE132位点贡献率最高，分别为21.91%和12.35%。CAMS-327、HpmsE132、CAMS-454、AF039662、Hpms1-69和Hpms1-155位点，在GLM和MLM方法中均能检测到。

有12个位点与果纵径相关联，分别位于1、2、3、4、5、7、8 和11号染色体，贡献率为2.40%～8.86%(GLM方法)和2.07%～5.29%(MLM方法)，其中，2号染色体ge35-141pmH0135C位点贡献率最高。ge35-141pmH0135C、 HpmsE132和AF039662 位点在GLM和MLM方法中都能检测到。

两种方法共检测到9个位点与果横径相关联，分别位于2、4、5、6、8、9和11号染色体，贡献率为3.65%～15.28%(GLM方法)和2.22%～5.13%(MLM方法)，其中，2号染色体CAMS-327位点和5号染色体CAMS-454位点贡献率最高，分别为15.28%和11.71%。CAMS-327、CAMS-454、HpmsE132和Hpms2-24位点用两种方法均能检测到。

有6个位点与果形指数相关联，分别位于4、5、6、7、9和11号染色体，贡献率为2.33%～3.72%(GLM方法)和2.13%～3.44%(MLM方法)，其中，11号染色体CAMS-844位点和5号染色体CAMS-454位点贡献率最高。CAMS-844、CAMS-454、Hpms2-24、CAMS-173和CAMS-378位点用两种方法均能检测到。

有8个位点与果肉厚度相关联，分别位于2、7、8、9和11号染色体，贡献率为3.78%～20.48%(GLM方法)和2.18%～6.63%(MLM方法)，其中，2号染色体CAMS-327位点贡献率最高，达20.48%。CAMS-327、HpmsE132和Hpms2-24位点用两种方法均能检测到。

由表5可知，两种方法共检测到24个SSR关联位点，除10、12号染色体外，其他10条染色体上均有分布，每个标记关联性状数量1～6个不等。

2.4 优异等位变异及其载体材料

利用检测到的主效QTL信息，可计算其等位基因的效应值。表型效应值为正值的，为增效等位变异，反之为减效等位变异，携带这些等位变异的种质即为相应载体材料。在7个农艺性状中，GLM方法检测到的既有增效等位变异，也有减效等位变异；MLM方法未检测到株高、始花节位的增效等位变异以及果肉厚度的减效等位变异(图2)。

GLM和MLM两种方法共同检测到的增/减效等位变异及其载体材料列于表6，可根据育种要求选择合适位点及相应优异等位变异。增/减效等位变异共12个，即AF039662b、CAMS-173b、CAMS-327a、CAMS-378b、CAMS-454c、CAMS-844b、ge35-141pmH0135Ca、Hpms1-155a、Hpms1-69a、Hpms2-24a、HpmsE132a和TC7268Sa，相应典型载体材料有B003、B010、B015、B020、B022、B042、B048、B052、B097、B111、B134、B138、B166、B178、B351、B352、C005、C014、V06C007、V06C0285、V06C1082、V06C1187、V06C1321、V06C1600、V06C1707、V06C1717、V06C1838和V06C1898等28个，这些都是辣椒7个农艺性状的优良载体材料。

表4 与辣椒农艺性状显著相关的标记位点及对表型变异的贡献率Table 4 Marker loci associated with pepper agronomic traits and their contribution rate

表4(续)

表5 SSR标记与关联性状数量Table 5 SSR Markers and the No. of associated agronomic traits

表6 GLM和MLM方法共同关联到的12个显著性位点的增/减效等位变异及其表型效应和相应载体材料Table 6 Twelve positive/negative alleles at loci significantly associated with pepper agronomic traits by both GLM and MLM methods and their allelic effect and corresponding carrier materials

图2 与辣椒7个农艺性状显著关联位点的等位变异表型效应Fig.2 Phenotypic effects of major alleles significantly associated with 7 agronomic traits of pepper

3 讨论

本研究利用GLM和MLM两种方法，共检测到24个SSR关联位点，分布于辣椒1、2、3、4、5、6、7、8、9、11号染色体上。两种方法各有优缺点，MLM因同时考虑群体结构Q和亲缘关系K的影响，校正更严格，能更有效减少假阳性结果，但也可能因此而遗漏一些QTL位点。如本研究GLM检出的株高关联位点CAMS-327、始花节位关联位点Hpms1-106、单果质量关联位点ge35-141pmH0135C和果纵径关联位点CAMS-327等在前人基于家系的连锁分析中也均被检出[2,10-11,22]，但本研究MLM方法未能检测到；GLM具有较高的统计效率，但由于较宽松的校正条件，可能会产生假阳性结果[23]。因此，本研究同时运用GLM和MLM两种方法，可以互相验证与补充，获得的研究结果更准确全面。

本研究发现，不少位点与多个性状关联，且相关性显著的性状往往存在共同的关联位点。如2号染色体的CAMS-327和8号染色体的TC7268S分别与6个性状关联；11号染色体的HpmsE132与5个性状关联；2号染色体的Hpms1-106、ge35-141pmH0135C，7号染色体的CO911525S，9号染色体的Hpms2-24，以及11号染色体的CAMS-844分别与4个性状关联；4号染色体的Hpms1-69和5号染色体的CAMS-454分别与3个性状相关联。这说明上述位点可能与多个功能基因存在连锁关系，或其附近存在“一因多效”的基因[24-26]。这些与多个性状关联或连锁的SSR位点，经进一步验证后，可望应用于多个目标性状的分子标记辅助选择与聚合育种[27]。

研究表明，关联分析检测到的位点，有相当一部分与连锁作图定位的QTLs在同一基因组区域[28-30]。经比较，本研究发现的部分关联位点与已报道的一些QTL位点位置相同或相近。例如，本研究与株高显著关联的8号染色体TC7268S位点、6号染色体CMAS-361位点和2号染色体CAMS-327位点分别与株高QTLs位点PH-8.2[10]、PH13.1[11]、PH-2[10]和PH14.1[11]位置相近或相同；2号染色体的始花节位关联位点Hpms1-106与Tan等[22]检测到的QTL位点Nle2.1位置相同，2号染色体的另一个始花节位关联位点CAMS-327在不同的研究中均有报道[11, 22, 31-33]，说明这是一个调控辣椒始花节位的重要位点；单果质量CAMS-327位点与前人报道的fw21.1位点相同[32]，与FW-2.2位点位置相近[10]；果纵径关联位点CAMS-327、PM22、CAMS-075和pmc0491C分别与果纵径QTLspaufl2.2[2]、FL-3.1[10]、Qfl.iivr.3.2[9]和FL-3.5[10]的位置相近，TC7268S位点与Dwivedi等[9]检测到的Qfl.iivr.3.2位置一致；果横径HpmsE132位点与FD-11位置相近[10]；果形指数关联位点CAMS-844和CAMS-065分别与果形2017和果形2016位点相近[31]；果肉厚度关联位点CAMS-327与QTLPT14.1[11]位置一致。本研究还检测到一些鲜见报道的关联位点，可见基于自然群体的关联分析与基于家系群体的连锁作图分析结果，可以相互验证和补充[34]，有助于关联位点或QTLs的高效精准鉴定。

本研究解析了辣椒7个农艺性状关联位点，发掘出与株高、始花节位、单果质量、果纵径、果横径、果形指数和果肉厚度关联的优异等位变异，如TC7268Sa、CAMS-327a、HpmsE132a、ge35-141pmH0135Ca、CAMS-454c和Hpms2-24a等，筛选出B003、B020、B042、B048、B052和V06C1707等优良载体材料。本研究发掘的优良载体材料，既可作为7个农艺性状遗传分析的亲本材料，也可直接用于辣椒品种改良，如育种目标为果大肉厚的丰产型杂交品种时，可选择携带CAMS-327a、HpmsE132a和Hpms1-155a三个果重增效优异等位变异的B048、B052和V06C1898作亲本；育种目标为早熟辣椒杂交品种时，同时携带TC7268Sa和CAMS-327a两个始花节位减效优异等位变异的B003、V06C0007和V06C1321是理想亲本材料。本研究所指优异等位变异要根据特定育种目标而定，如选育早熟辣椒杂交品种时，始花节位减效等位变异为优异等位变异，选育晚熟辣椒杂交品种时，始花节位增效等位变异为优异等位变异。在本研究中，一些贡献率较低的位点可能是微效QTLs，也可能受分子标记数量所限，分子标记与目标基因较远，导致低估目标基因的贡献率，后期可通过在目标区域增加标记密度进行深入挖掘。

4 结论

本研究基于194份辣椒核心种质表型数据和58个SSR标记基因型数据，通过关联分析鉴定7个农艺性状关联位点。GLM和MLM方法分别检测到20个和17个SSR关联位点，这些位点与连锁作图定位的QTLs可互相验证和补充。其中，有12个位点被两种方法同时检测到，基于其表型效应发掘出一系列优异等位变异和优良农艺性状载体材料，后期可在目标区域增加标记密度以提高定位精度。本研究结果对辣椒相关农艺性状的优异基因发掘、分子标记辅助选择与聚合育种具有重要的指导意义。