非标记定量蛋白质组学分析冻结方式对中华管鞭虾肌肉差异蛋白质的影响

石 娟 李勇勇 周丽萍 李超群 王 晴 唐道军 娄永江,*

(1 宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315211；2 宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

中华管鞭虾(Solenoceramelantho)，又名红虾，是我国重要的海捕虾之一[1]。虾类富含蛋白质和水分，极易腐败变质，冷冻保藏是主要的贮藏方式[2]。水产品冻藏过程中的品质与冻结方式有很大关系[3]，不同冻结方式对水产品的理化性质及品质影响也不同[4-7]。

近年来，蛋白质组学技术在水产品品质上的研究越来越多，如李娜[8]利用蛋白质组学技术研究罗非鱼冰藏过程中肌肉蛋白质的变化，鉴定出3个鲜度指示蛋白。赵巧灵[9]利用蛋白质组学技术研究金枪鱼冷藏过程中肌肉蛋白质的变化，确定了10个鲜度指示蛋白，且这10个蛋白主要通过组织蛋白酶途径和糖酵解代谢途径影响鱼肉的品质变化。Terova等[10]研究不同温度储存期间鲈鱼肌肉蛋白质的变化，发现了2种可能成为监测鱼类新鲜度的指示蛋白。非标记(label-free)定量蛋白质组学技术是常用的蛋白组学分析方法，检测蛋白质灵敏度高，可获得低丰度蛋白的信号，分离能力较强，适用范围较广[11]，但鲜见利用该技术分析不同冻结方式对中华管鞭虾肌肉蛋白质品质变化影响的研究报道。

本研究运用label-free定量蛋白质组学技术鉴定4种冻结方式下中华管鞭虾虾肉差异蛋白的表达情况，通过基因本体(gene ontology, GO)分析差异蛋白的细胞组成、分子功能及其参与的生物过程，通过直采同源蛋白质族(cluster of orthologous groups of proteins，KOG，原核生物使用COG数据库，真核生物使用KOG数据库)注释分析差异蛋白可能的功能并对这些功能分类，通过京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析差异蛋白参与的主要信号通路，通过Pearson相关性分析探究差异蛋白与虾品质之间的相关性，旨在进一步了解虾在冻结过程中的品质变化机制，寻找与虾肉品质变化相关的蛋白质，旨在为评价中华管鞭虾的新鲜度提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华管鞭虾购于浙江宁波当地水产市场，大小均一，体表无损伤。

十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、三(羟甲基)氨基烷(Tris hydroxymethyl) methyl amznomethane， THAM)，美国Amresco公司；碳酸氢铵(NH4HCO3)、尿素(urea)、甲酸(formic acid，FA)、氨水(HPLC分级)、乙腈(acetonitrile，CAN)，美国Sigma公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，美国Genview公司；胰酶，美国Promega公司；蛋白Marker，美国Invitrogen公司；动物组织总蛋白提取试剂盒购于北京邦菲生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

H4MFPTAD酶标仪，美国Bio Tek公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂；Orbitrap Fusion质谱仪，Easy nLcUltimate 3000液相，C18质谱柱(1.9 μm×150 μm×120 mm)，Orbitrap Fusion质谱仪、Pico 17 Centrifuge高速离心机、SC210A热干浓缩仪，美国Thermo Scientific公司；TA.XT质构仪，英国Stable Micro Systems公司；CR-400色差仪，日本柯尼卡美能达公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冻结方法 将新鲜虾冲洗干净擦拭后，随机分成4组，分别置于-20℃环境开始冻结并用温度计测得虾体中心温度变化。4种冻结方式处理分别为：液体浸渍冻结(immersion chilling and freezing，ICF-0)、真空包装结合浸渍冻结(ICF-1)、静止空气冻结(static air freezing，SAF-0)、真空包装结合空气冻结(SAF-1)；其中液体为预冷至-20℃的饱和氯化钠溶液，当中心温度达到-18℃时视为冻结完成。自然解冻后进行品质指标的测定，同时将用于蛋白质组学研究的样品立即放入液氮中进行冷冻备用。

1.3.2 色差、质构、pH值的测定 利用色差仪测定带壳中华管鞭虾第二、第三腹节表面的明亮度(L*)、红绿度(a*)、黄蓝度(b*)，重复测定20次。取虾第二、第三腹节肌肉置于质构仪上测定其硬度、弹性；探头为直径3 mm的圆柱形，测试速度为1 mm·s-1，测试形变量为50%，重复测定6次。pH值参照GB 5009.237-2016[12]进行测定。

1.3.3 蛋白制备方法 采用试剂盒提取各冻结方式处理的中华管鞭虾组织蛋白，并依据Bradford[13]的方法进行蛋白定量。

1.3.4 蛋白检测方法 各取30 μg蛋白质样品，5∶1(体积比)加入5×上样缓冲液，沸水浴5 min，离心10 min取上清，进行10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。电泳条件：恒流14 mA，电泳时间90 min。凝胶分离后，通过考马斯亮兰法染色。

1.3.5 蛋白酶解及质谱分析 蛋白质定量后取60 μg蛋白溶液置于离心管中，加入5 μL 1 mol·L-1DTT溶液混匀，37℃保温1 h。加入20 μL 1 mol·L-1IAA溶液，混匀后，室温避光反应1 h。吸取所有样品加入超滤管中，离心后弃收集液。加入100 μL尿酸(8 mol·L-1urea，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.0)至超滤管中，离心后弃收集液，重复2次。加入100 μL 50 mmol·L-1NH4HCO3溶液，离心后弃收集液，重复3次。更新收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50∶1 (m∶m)的比例加入，37℃酶解12～16 h。

每份样品采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)系统进行分离。色谱柱以95%的流动相A(含0.1%的甲酸水溶液)平衡。流动相B为80%的CAN(含0.08%FA)。样品由自动进样器上样到质谱预柱，再经分析柱分离，流速及相关液相梯度如表1。每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析。

表1 液相色谱洗脱梯度参数Table 1 Liquid chromatography elution gradient parameters

1.3.6 生物信息学数据分析 使用数据库：uniprot-decapoda20180820进行检索及定量分析。搜库软件：Proteome Discover。在1.5差异倍数(fold change，FC)且P<0.05条件下进行差异蛋白筛选(即FC≥1.5为上调，FC≤0.67为下调，0.67

2 结果与分析

2.1 不同冻结方式的中华管鞭虾中心温度变化趋势

不同冻结方式的虾体中心温度变化如图1所示，即ICF-0、ICF-1、SAF-0、SAF-1组处理完成冻结时间分别为12、73、158、210 min。液体浸渍冻结组的降温速率快于空气冻结组，这可能是因为液体降温介质比空气速度快；其中ICF-0组的降温速率最快，ICF-1次之，可能是因为真空包装有一定的阻隔作用，从而影响了中华管鞭虾的降温速率。

图1 中华管鞭虾中心温度变化曲线Fig.1 Temperature variation curve of Solenocera melantho

图3 蛋白质肽段数量Fig.3 Distribution of protein peptide number

2.2 SDS-PAGE电泳结果

凝胶电泳结果如图2所示，5例样本(CK为新鲜中华管鞭虾)整体蛋白Pattern具有相似的带型，蛋白条带清晰、完整、均一，符合检测要求。

图2 不同处理组中华管鞭虾的凝胶电泳结果Fig.2 Results of gel electrophoresis of Solenocera melantho in different treatment groups

2.3 蛋白质的鉴定统计

将蛋白质酶解得到的肽段进行质谱分析，得到肽段数为3 552个，鉴定到的总蛋白组数为750个。结果显示，label-free定量蛋白质组学技术鉴定到的蛋白质比较全面且可靠。在所有鉴定到的蛋白质中，有68.00%的蛋白质至少含有2个肽段，有92.80%的蛋白质含有肽段数在20个以内(图3-A)。鉴定到的蛋白质有着较高的序列覆盖度，其中52.80%的蛋白质具有超出10%的序列覆盖度(图3-B)。

2.4 差异蛋白统计及分析

不同处理组中华管鞭虾的差异蛋白结果见表2。不同冻结方式分别与CK比较，即ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK，4个比较组中都含有上调蛋白和下调蛋白，且下调蛋白多于上调蛋白，表明在冻结过程中虾肉蛋白质发生了变化，其中ICF-1总差异蛋白最少，且远小于其他3组，表明真空包装结合浸渍冻结技术使得蛋白质发生的变化远小于其他3组，保鲜效果优于其他3组；其次是ICF-0组，SAF-0、SAF-1组差异蛋白数最多且相近，表明这2种冻结技术对虾肉蛋白质产生的变化影响不明显。42个差异蛋白为4组共有的差异蛋白(表3)，可能成为与冻结中华管鞭虾品质变化相关的指示蛋白标志物。

2.5 差异表达蛋白生物信息功能分析

2.5.1 GO分析 对4种冻结方式下差异表达蛋白进行GO功能分析，如图4所示，ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK比较组的差异蛋白在生物过程分类中均主要参与细胞过程(各占38.29%、40.12%、42.47%、41.52%)、代谢过程(各占24.54%、27.16%、30.43%、32.10%)和生物学调控(各占9.67%、6.79%、10.03%、8.30%)；在细胞组成分类中均主要分布在细胞(各占40.15%、40.74%、44.82%、44.29%)、细胞部分(各占38.66%、40.12%、42.81%、42.91%)和细胞器(各占24.54%、30.25%、28.43%、29.07%)；在分子功能分类中均主要分布在结合(各占56.88%、58.02%、55.52%、56.40%)和催化活性(各占43.87%、44.44%、48.49%、46.02%)。

表2 不同处理组中华管鞭虾的差异蛋白结果(FC=1.5)Table 2 Differential protein results of Solenocera melantho in different treatment groups (FC=1.5)

图4 中华管鞭虾各比较组中差异蛋白的GO功能注释Fig.4 GO function annotation of differential proteins in different comparison groups of Solenocera melantho

2.5.2 KOG分析 4种冻结方式处理后的虾肉差异蛋白具有不同的功能，共25种，其中J、A、K、L、B归为信息存储和处理一类，D、Y、V、T、M、N、Z、W、U、O归为细胞过程和信号一类，C、G、E、F、H、I、P、Q归为代谢一类，R、S归为很少特征一类。由图5可知，Z、O、J功能蛋白质数量最多，说明冻结主要影响中华管鞭虾蛋白质关于Z、O、J方面的功能。

2.5.3 KEGG通路分析 KEGG通路分析表明，ICF-0/CK、ICF-1/CK、SAF-0/CK、SAF-1/CK比较组的差异蛋白均主要参与代谢通路(各占13.38%、12.96%、20.07%、18.34%)、吞噬(各占10.41%、12.96%、8.03%、10.03%)、核糖体(各占7.06%、9.88%、7.36%、7.27%)等通路(图6)。经不同冻结方式处理过的中华管鞭虾的差异蛋白主要和代谢通路有关，表明冻结处理后虾肉的差异蛋白主要与物质代谢有关。

2.6 差异蛋白与品质指标的相关性分析

中华管鞭虾在冻结过程中的品质变化是多种因素共同作用的结果，仅从单一的指标来评价新鲜度不够全面，需要从多个指标进行判定。水产品在停止呼吸后体内生成乳酸，从而导致pH值下降，因此pH值是评价肌肉新鲜度的重要指标[14]。在冻结过程中，虾因本身含有的虾青素等有色物质的变化及发生的酶促褐变反应都会使虾肉的色泽发生改变，因此可以通过色泽的改变来评价虾肉的品质[15]。水产品的质构特性是评价水产品新鲜度的重要指标，可以减少因主观人为因素造成的评价误差[16]。因此，本研究选取6个在冻结过程中较敏感的品质指标，即L*值、a*值、b*值、硬度、弹性，但并不是每个指标之间都存在相关性，因此需要对各个指标之间进行相关性分析，更有利于筛选出评价虾新鲜度的主要指标[17]。由表4可知，液体浸渍冻结的pH值、L*值、a*值、b*值、硬度、弹性指标优于空气冻结。由表5可知，冻结中华管鞭虾的L*值、a*值、b*值及硬度4个指标之间存在显著或极显著相关，而pH值、弹性之间无相关性，进一步说明可以将L*值、a*值、b*值及硬度作为评价虾新鲜度的主要指标。

通过相关性分析能更加深入了解差异蛋白与品质之间的相关性[18]。相关性分析表明，有5个差异蛋白与4个指标中的至少一个指标的变化呈显著相关(表6)，除去未表征蛋白和片段蛋白，共筛选出3个差异蛋白，分别是甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD+)[glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD+)，G3PDH(NAD+)](登录号AOAOP4WGNO)、β-胸腺素(登录号AOAOE3EKX5)和β-肌动蛋白(登录号Q8WPD5)。G3PDH(NAD+)和β-胸腺素与4个指标之间都存在显著或极显著相关性，而β-肌动蛋白只与虾L*值存在显著相关，进一步说明G3PDH(NAD+)和β-胸腺素这2个差异蛋白有望成为中华管鞭虾冻结过程中品质变化的指示蛋白。

3 讨论

冻结速率较快对水产品品质造成的影响较小。本研究通过测得中华管鞭虾虾体中心温度的变化得出液体浸渍冻结是最佳的冻结方式。Makri[19]证实了冻结时间越短，扇贝肉的品质损失就越小。董佳等[20]研究发现液体浸渍冷冻相比于传统空气冷冻能更好地保持鲟鱼品质。考虑到测得的总差异蛋白数、品质指标及实际应用中水产品表面的液体问题，认为真空包装结合浸渍冻结为最佳冻结方式。

分析鲜度指示蛋白能为后续评价中华管鞭虾品质提供理论参考。甘油-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehype-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH)为氧化还原酶，在甘油代谢和磷脂合成中起重要作用[21-22]。G3PDH(NAD+)在4组比较组中的生物过程中均参与碳水化合物代谢过程、甘油-3-磷酸代谢过程；在细胞组成分类中均是甘油-3-磷酸脱氢酶复合物；在分子功能分

注：J：翻译，核糖体结构和生物起源；A： RNA加工和修饰；K：转录；L：复制、重组和修复；B：染色质结构和动力学；D：细胞周期控制，细胞分裂，染色体分割；Y：核结构；V：防御机制；T：信号转导机制；M：细胞壁/膜/包膜生物起源；N：细胞运动；Z：细胞骨架；W：细胞外结构；U：细胞内运输，分泌和囊泡运输；O：翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣蛋白；C：能源生产和转换；G：碳水化合物的运输和代谢；E：氨基酸运输和代谢；F：核苷酸运输和代谢；H：辅酶运输和代谢；I：脂质运输和代谢；P：无机离子运输和代谢；Q：次生代谢产物的生物合成，运输和分解 代谢；R：一般功能；S：未知功能。Note: J: Translation, ribosome structure and biological origin. A: RNA processing and modification. K: Transcription. L: Copy, reorganize and repair. B: Chromatin structure and dynamics. D: Cell cycle control, cell division, chromosome division. Y: Nuclear structure. V: Defense mechanism. T: Signal transduction mechanism. M: Cell wall/membrane/envelope biological origin. N: Cell movement. Z: Cytoskeleton. W: Extracellular structure. U: Intracellular transport, secretion and vesicle transport. O: Translation modification, protein conversion and chaperone. C: Energy production and conversion. G: Carbohydrate transport and metabolism. E: Transport and metabolism of amino acids. F: Nucleotide transport and metabolism. H: Coenzyme transport and metabolism. I: Transport and metabolism of lipid. P: Transport and metabolism of inorganic ions. Q: Biosynthesis, transportation and catabolism of secondary metabolites. R: General function. S: Unknown function.图5 中华管鞭虾各比较组中差异蛋白KOG注释Fig.5 Differential protein KOG annotation in each comparison group of Solenocera melantho

表4 不同冻结方式下中华管鞭虾的品质特性Table 4 Quality characteristics of Solenocera melantho under different freezing methods

图6 各比较组中差异蛋白KEGG通路分析(前20条)Fig.6 Analysis of differential protein KEGG pathway in each comparison group (top 20)

表5 中华管鞭虾各指标相关性Table 5 Correlation of various indicators of Solenocera melantho

类中均是G3PDH(NAD+)活性、NAD结合及蛋白质同源二聚活性，且都参与甘油磷脂代谢通路。相关性分析显示G3PDH(NAD+)与虾L*值呈显著正相关，与a*值、硬度呈极显著负相关且与b*值呈显著负相关。说明G3PDH(NAD+)的变化会影响虾肉的色泽与硬度。因为冻结会导致虾肉蛋白质变性，从而使一部分虾青素游离出来，使a*值增加[23-24]。在多酚氧化酶的作用下，虾肉氧化产生醌类物质，醌类物质与虾体内的蛋白质或氨基酸结合发生褐变，从而使b*值增加[25]。此外，冻结过程中形成的冰晶会使肌肉损伤以及蛋白质变性，从而导致硬度增加。G3PDH(NAD+)在4个比较组中均表达下调，其中ICF-1/CK比较组较其他3组下调最为缓慢(表3)，可能是因为冻结过程中受到冷应激的影响[26]，而ICF-1处理使G3PDH(NAD+)参与的代谢过程时间缩短，从而延缓了虾肉品质的劣变。胸腺素又称肌动蛋白结合蛋白，根据等电点的不同将其分为α、β、γ三类，β-胸腺素的等电点在5.0～7.0之间[27]。β-胸腺素能够与球状肌动蛋白相互作用，在维持细胞骨架、细胞运动等方面有重要作用[28-29]。β-胸腺素在4个比较组中的生物过程中均参与肌动蛋白丝组织，在分子功能分类均是肌动蛋白单体结合。相关性分析显示，β-胸腺素与虾L*值呈显著正相关，与a*值呈极显著负相关，与b*值呈显著负相关，与硬度呈极显著负相关。说明β-胸腺素的变化也会影响虾肉的色泽和硬度。β-胸腺素在4个比较组中均表达下调，且在ICF-1/CK比较组中下调最为缓慢(表3)，进一步说明真空包装结合浸渍冻结能更好地维持细胞骨架，延缓蛋白降解，从而保证虾肉的品质。

表6 差异蛋白与中华管鞭虾在不同冻结方式下品质指标的相关性分析Table 6 Correlation analysis of differential proteins and quality index of Solenocera melantho under different freezing methods

本研究从蛋白质组学角度探究了可能成为蛋白标志物的2个差异蛋白，对冻结过程中华管鞭虾的品质监测提供了理论依据。但2个差异蛋白之间的相互作用关系还需作进一步的探究。

4 结论

本研究筛选出4组中的差异蛋白均主要分布在细胞、细胞部分和细胞器中；分子功能分类中主要分布在结合活性和催化活性；筛选出甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD+)和β-胸腺素与中华管鞭虾的L*、a*、b*值及硬度呈显著相关；液体浸渍冻结的pH值、L*值、a*值、b*值、硬度、弹性指标优于空气冻结，且真空包装结合浸渍冻结总差异蛋白数较其他3组最少。本研究结果从蛋白质组学层面解释了中华管鞭虾在冻结过程中的品质变化机制，同时也为冻结工艺技术提供了参考。