黄秋葵中黄酮类化合物提取方法优化及总黄酮抑菌效果研究

陈晓琪 李瑶晨 李璐瑶 杨 静 饶帅琦 祝 彪 臧运祥 周 根

(浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300)

黄秋葵(AbelmoschusesculentusL.)又名羊角豆、秋葵等，属锦葵科秋葵属植物，因适应性广、抗性强、产量高、栽培简单、营养价值高而广受欢迎[1]。据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)统计，2020年全世界黄秋葵年产量近1 055万吨，年生产面积达253万公顷，约占世界蔬菜年生产面积的3.5%；主产地为非洲和亚洲，年生产面积分别达193万和59万公顷[2]。目前，有关黄秋葵的研究主要集中在黄酮类物质、凝集素、多糖和果胶等重要植物化学成分的提取和功效方面[3]。黄秋葵具有抗疲劳[4-5]、降血糖、降血脂[6]、抗乙醇诱导的胃黏膜损伤[7]等多种保健功能。有研究发现，黄秋葵种子的水和甲醇提取物具有较好的抗氧化、抗应激和益智作用[8]；黄秋葵花的水提物对大肠杆菌(Escherichiacoli)、单核球增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)均有明显的抑制作用[9]，花中所含多糖可促进大肠杆菌发酵液中乙酸和己酸的产生，具有维持机体内肠道微生物水平稳定、减轻炎症等作用[10]；黄秋葵叶乙醇提取物对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的抑菌活性较强[11]。

黄酮类化合物是黄秋葵中含量丰富的主要生物活性物质，其含量在不同部位存在差异，由高到低依次为嫩果>嫩叶>种子>果荚[12]。目前，黄秋葵中已鉴定出槲皮素-3-龙胆二糖苷、杨梅素-3-O-葡糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素戊糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷等多种黄酮类成分[13]。研究发现黄秋葵所含异槲皮苷、槲皮素-3-O-槐糖苷等黄酮类化合物均表现出良好的α-淀粉酶抑制活性[14]；槲皮素和芦丁对处于地塞米松治疗中的小鼠有明显的神经保护作用[15]；同时，异槲皮苷可作为肥胖及相关代谢性疾病的潜在治疗药物[16]。

目前，黄秋葵中黄酮类物质的常见提取方法众多[17-21]，如王琰等[22]用乙醇超声波辅助提取法从黄秋葵荚中分离鉴定了异槲皮苷和槲皮素-3-龙胆二糖苷；Senthamilselvi等[23]用乙醇与石油醚从黄秋葵花中提取得到黄酮醇-7-O-甲基棉花素-8-O-β-D-葡萄糖苷。同时，响应面分析法被广泛应用于探究物质最佳提取工艺参数[24-25]，如郭溆等[26]、林香信等[27]采用响应面法对黄秋葵花总黄酮的提取工艺进行了优化。但已有的研究主要围绕黄秋葵总黄酮的提取工艺进行，各具体黄酮类成分的提取工艺优化仍鲜有报道。

本试验采用超声辅助提取法和高效液相色谱法，通过单因素和响应面法对料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间4个因素进行优化，以期建立可以同时提取4种黄秋葵主要黄酮类化合物和总黄酮的工艺和方法，此外探究黄秋葵总黄酮对常见致病菌的抑菌活性，为黄秋葵资源的开发利用和黄秋葵中主要黄酮类物质的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄秋葵购自浙江杭州临安城北农贸市场，槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷标准品(纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷标准品(纯度≥85%)购自美国Sigma公司；乙腈(色谱纯)购自美国Tedia公司；胰化蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxiod公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)购自中国医药集团有限公司。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白假丝酵母(Canidiaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusnigerniger)及黑根霉(Rhizopusnigricans)菌种均由浙江农林大学农业与食品科学学院园艺实验室提供。

1.2 主要仪器与设备

Gamma 1-16 LSC真空冷冻干燥机，德国Martin Christ有限公司；R-210旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；Aglient1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；DRP-9082型电热恒温培养箱，上海森信试验仪器有限公司；722S型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 将黄秋葵嫩果切块，液氮预冷后用冻干机冷冻干燥72 h至恒重，粉碎过60目筛(颗粒直径250 μm)，置-20℃冰箱备用。

1.3.2 黄秋葵中黄酮类化合物的提取 称取0.5 g黄秋葵粉末于50 mL离心管中，加入一定量相应浓度乙醇溶液，涡旋混匀后，设定相应温度和超声波辅助提取时间，提取结束后，8 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。重复上述提取步骤2次，过滤定容，将提取液旋转蒸干后，加入2 mL相应浓度的乙醇溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后得待测液。每个样品重复3次。按照公式计算黄秋葵中黄酮类化合物的提取率(Y)

Y=CV/m

式中，m为黄秋葵粉末总质量，g；C为提取液中黄酮类化合物质量浓度，μg·mL-1；V为提取液体积，mL。

1.3.3 黄酮类化合物的含量测定 采用高效液相色谱法对黄秋葵中的黄酮类化合物进行分析测定，用外标法进行定量。分别准确称量4种标准品，将其配置成800 μg·mL-1[槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷]和500 μg·mL-1[槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷]的混合标准溶液，逐级稀释成6个浓度梯度后分别进样，得到各自的标准曲线。前期预试验发现黄秋葵嫩果中黄酮类化合物主要是上述4种物质，故以此4种黄酮类化合物含量之和作为黄秋葵中总黄酮含量进行计算。

色谱柱：岛津ODS-SP 5020-02746(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：30℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：256 nm；流动相A：1%冰醋酸水溶液，流动相B：乙腈。梯度洗脱程序如下：0～1 min，10% B；1.01～40 min，10～30% B；40.01～50 min，30% B。

1.3.4 单因素及响应面试验设计 选择提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度作为影响因素进行单因素试验。考察单次提取时间(5、10、15、20、25、30 min)对提取的影响，选择提取温度25℃、乙醇浓度70%、料液比1∶40 g·mL-1；考察提取温度(25、30、35、40、45、50℃)对提取的影响，选择单次提取时间10 min、乙醇浓度70%、料液比1∶40 g·mL-1；考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、 1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1)对提取的影响，选择提取时间10 min、提取温度40℃、乙醇浓度70%；考察乙醇浓度(50%、60%、70%、80%、90%)对提取的影响，选择提取时间10 min、提取温度40℃、料液比1∶40 g·mL-1。在单因素试验基础上，根据Box-Behnken响应面法试验设计原理及Design-Expert 8.0.6.1分析软件建立二次多项式数学模型，以提取温度(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、料液比(D)为响应变量，以黄秋葵中的4种主要黄酮类化合物和总黄酮含量为响应值，采用四因素三水平响应面中心组合法对黄秋葵中黄酮类物质提取工艺的主要参数进行分析优化，各因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.5 黄秋葵总黄酮抑菌活性及最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定 采用牛津杯法，依据文献[28]与预试验结果，确定考察5个浓度(2.0、2.5、3.8、5.0、7.5 mg·mL-1)黄秋葵总黄酮对6种常见致病菌的抑菌活性。黄秋葵总黄酮浓度定量方法参照1.3.3部分。用移液枪移取菌悬液0.1 mL依次加入培养皿，用无菌涂布棒均匀涂抹，在每个培养皿中等距离放置无菌牛津杯，向牛津杯中加入0.1 mL不同浓度黄秋葵黄酮类化合物提取液和空白对照(无菌生理盐水)，每个浓度重复3次。细菌在37℃恒温培养箱中连续培养18 h并测量抑菌圈直径；真菌在28℃恒温培养箱中连续培养48 h，并测量抑菌圈直径。采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈的直径D，取平均值。最小抑菌圈所含最低黄秋葵黄酮类化合物浓度即为MIC。

1.3.6 数据分析 每个处理3次重复，试验结果用Mean±SD表示。显著性采用IBM SPSS Statistics 22分析。响应面试验数据采用Design-Expert 8.0.6.1分析。采用Excel 2010软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

以4种黄酮类化合物标准品的质量浓度(μg·mL-1) 为横坐标，256 nm波长处响应值为纵坐标，绘制标准曲线进行定量计算。所得曲线的线性范围分别为20～800 μg·mL-1[槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷]和15～500 μg·mL-1[槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷]；R2均在0.999 以上。图1为黄秋葵样品黄酮类化合物的HPLC图谱，各相邻色谱峰之间的分离度均大于2.21，达到分离要求。

注：1:槲皮素-3-龙胆二糖苷；2:槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷；3:异槲皮苷；4:槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷。Note: 1: Quercetin-3-gentiobioside. 2: Quercetin-3-O-[β-D-xylosyl-(1→2)-β-D-glucoside]. 3: Isoquercetin. 4: Quercetin-3-O-(6-O-malonyl)-β-D-glucoside.图1 黄秋葵样品黄酮类化合物HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of okra flavonoids

由图2可知，4种黄酮类化合物的含量在不同单因素条件下的变化趋势和总黄酮含量变化趋势不完全相同。方差分析结果表明，提取温度、料液比、乙醇浓度均对黄秋葵中黄酮类化合物含量有显著影响(P<0.05)，而提取时间仅对槲皮素-3-龙胆二糖苷含量影响显著(P<0.05)。

黄秋葵中黄酮类化合物的含量随着提取温度的升高总体呈先上升后下降趋势，在45℃时达到最高(图2-A)。槲皮素-3-龙胆二糖苷含量在单次提取时间为10 min时最高，显著高于25、30 min时所测含量(P<0.05)；其余黄酮类化合物及总黄酮含量在不同提取时间下差异不显著(图2-B)。黄秋葵黄酮类化合物含量在料液比为1∶20 g·mL-1时显著高于其余比例(图2-C)。在乙醇浓度为60%时，槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷和黄秋葵总黄酮含量略高于乙醇浓度70%时各自含量(差异不显著)，但显著高于其余处理；在乙醇浓度大于60%时，槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷及总黄酮含量呈明显下降趋势(图2-D)。综上所述，响应面优化试验所选4个单因素的候选最佳条件分别为提取温度45℃、单次提取时间10 min(总计20 min)、料液比1∶20 g·mL-1、乙醇浓度60%。

注：图中不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Note: Different letters denote significant different at 0.05 level among treatment.图2 各因素对黄秋葵中黄酮类化合物含量的影响Fig.2 Effects of various factors on flavonoids content in okra

2.2 响应面法优化提取工艺试验结果

表2 Box-Behnken试验方案及结果Table 2 Arrangement and results of four-factors Box-Behnken design

表2(续)

表3 提取工艺回归模型拟合结果Table 3 Fitting results of extraction process regression model

对回归模型进行方差分析，结果表明各提取因素及其交互作用对5个响应值存在不同影响(表4)。结合F值的大小，得出所选因素对槲皮素-3-龙胆二糖苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷及总黄酮含量影响强弱顺序为：提取时间<提取温度<乙醇浓度<料液比；对槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷含量影响强弱顺序为：提取温度<提取时间<乙醇浓度<料液比。分别对各因素进行显著性分析，可知各回归模型一次项中乙醇浓度C、料液比D回归系数极显著(P<0.000 1)，说明这2个单因素对黄秋葵黄酮类化合物含量影响较大；交互项中提取时间和乙醇浓度(BC)、提取时间和料液比(BD)对应的P值小于0.05，说明存在显著的交互作用；二次项的偏回归系数均达到极显著水平(P<0.01)，说明该回归方程拟合程度较好，模型具有很高的可靠性和准确性。

图3为以4种主要黄酮类化合物和总黄酮含量为响应值，提取时间分别与乙醇浓度、料液比交互作用的三维响应面分析图。图3-A～F中各响应曲面的坡度较陡，说明提取时间分别与乙醇浓度、料液比的交互作用对槲皮素-3-龙胆二糖苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量的影响较大。在一定范围内，适当提高提取时间和乙醇浓度，在交互作用下含量的变化趋势均为先上升后下降(图3-A、C、E、G)。当料液比较高时，黄酮类化合物含量随着提取时间增加有明显上升，后趋于平缓；料液比较低时，含量随着提取时间增加缓慢下降(图3-B、D、F、H)。因此，要提高黄秋葵中总黄酮的含量，可以适当增加料液比。黄酮类化合物含量受其他因素交互作用的影响相对较小，无显著差异，故未列出。

响应面分析模型和软件分析可知各组分及总黄酮响应值在极大值点所对应的各因素编码值，经过换算后得出总黄酮及主要黄酮类化合物提取最佳条件实际值。其中，槲皮素-3-龙胆二糖苷最佳提取条件为提取温度37.5℃、提取时间20.3 min、乙醇浓度69.3%、料液比1∶24.6 g·mL-1，此条件下槲皮素-3-龙胆二糖苷含量理论上可达2 493.20 μg·g-1；槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取条件为提取温度50℃、提取时间10 min、乙醇浓度70%、料液比1∶28.4 g·mL-1，此条件下槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷含量理论上可达563.43 μg·g-1；异槲皮苷最佳提取条件为提取温度36.4℃、提取时间19.7 min、乙醇浓度70%、料液比1∶25.7 g·mL-1，此条件下异槲皮苷含量理论上可达1 180.40 μg·g-1； 槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷最佳提取条件为提取温度37.2℃、提取时间19.9 min、乙醇浓度67.5%、料液比1∶24.7 g·mL-1，此条件下槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量理论上可达496.72 μg·g-1；总黄酮最佳提取条件为提取温度37.1℃、提取时间20.1 min、乙醇浓度69.9%、料液比1∶25.1 g·mL-1，此条件下黄秋葵中总黄酮含量理论上可达4 666.8 μg·g-1。优化后所得的总黄酮实际含量为4 576.1 μg·g-1，其中槲皮素-3-龙胆二糖苷为2 403.7 μg·g-1、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷为516.5 μg·g-1、异槲皮苷为1 170.7 μg·g-1、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷为485.2 μg·g-1，接近预测值，表明该提取工艺具有可行性。

2.3 黄秋葵总黄酮抑菌活性研究

图4为7.5 mg·mL-1总黄酮对6种致病菌的抑菌效果图。由表5可知，5.0和7.5 mg·mL-1黄秋葵总黄酮对3种细菌均具有抑菌活性，抑菌活性均随着总黄酮浓度上升而增强；7.5 mg·mL-1黄秋葵总黄酮对金黄色葡萄球菌培养皿中所形成的抑菌圈最大，其次为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；当总黄酮浓度为 3.8 mg·mL-1时，仅金黄色葡萄球菌培养皿中出现明显抑菌圈。黄秋葵总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC分别为5.0、3.8和5.0 mg·mL-1，可见对金黄色葡萄球菌的抑菌活性均强于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

对3种真菌的抑菌试验结果表明，浓度不小于3.8 mg·mL-1的黄秋葵总黄酮对白假丝酵母抑菌活性随浓度上升而增强；仅7.5 mg·mL-1的黄秋葵总黄酮对黑曲霉和黑根霉具有抑菌活性。黄秋葵总黄酮对白假丝酵母、黑曲霉和黑根霉的MIC分别为3.8、7.5和7.5 mg·mL-1，可见提取物对白假丝酵母的抑菌活性强于黑曲霉和黑根霉。

3 讨论

目前，有关黄秋葵中黄酮类化合物提取的研究主要集中在总黄酮，鲜有针对单个成分的提取工艺优化的研究。邓浩等[29]采用微波辅助提取法提取黄秋葵总黄酮，确定最佳条件为乙醇浓度70%时所测相应含量，提取温度70℃、料液比1∶40 g·mL-1、提取时间40 min。李加兴等[30]通过响应面法优化黄秋葵中总黄酮的超声辅助最佳提取工艺为料液比1∶25 g·mL-1、提取时间21 min、提取温度75℃、乙醇浓度50%。其料液比、乙醇浓度和提取温度最佳工艺条件与本研究结果存在部分差异，这可能与本研究综合考虑了黄秋葵中各黄酮类化合物的提取率以及使用的HPLC检测方法

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

不同有关。本研究中当料液比为1∶10 g·mL-1时，总黄酮含量与其他处理相比偏低的原因可能是样品在有机溶剂中溶解不够充分；随着料液比的提高，有机溶剂含量增加，黄酮类化合物含量显著上升，当料液比为1∶20 g·mL-1时达到最大值；当料液比高于1∶20 g·mL-1时，黄秋葵中某些醇溶性物质与溶剂间可能存在相似相溶竞争，影响黄酮类化合物的浸出，导致其含量下降[31]。在单因素试验中，乙醇浓度为60%时所得槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷和黄秋葵总黄酮含量略高于乙醇浓度70%时所测相应含量，而槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量相近，这可能是由于乙醇浓度升高，黄秋葵中其他醇溶性物质含量有所上升，使得部分黄酮类化合物含量下降[32]。在提取过程中，适当升高提取温度可提高黄酮类化合物的溶解度和扩散系数[33]，但为了避免可能存在的降解和聚合，提取温度定在40℃左右较合适，有助于保持黄酮类化合物的稳定性[34]，这与本研究中槲皮素-3-龙胆二糖苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷与总黄酮的最佳提取工艺条件提取温度37℃相符。Beatriz等[35]对落地生根叶中黄酮类化合物槲皮素阿拉伯糖基鼠李糖苷、槲皮苷的提取工艺进行响应面优化，发现槲皮素阿拉伯糖基鼠李糖苷提取的最佳温度范围在40～50℃，提取时间18 min，这与本研究槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取温度50℃、提取时间20 min(总时间)结果基本一致。槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷与其余3种黄酮化合物的最佳提取温度不同可能与不同黄酮类化合物的结构特性有关。

注：A:枯草芽孢菌；B:金黄色葡萄球菌；C:大肠杆菌；D:白假丝酵母 E:黑曲霉；F:黑根霉；1、2、3:总黄酮；4:生理盐水。Note: A: Bacillus subtilis. B: Staphylococcus aureus. C: Escherichia coli. D: Canidia albicans. E: Aspergillusniger niger. F: Rhizopus nigricans.1、2、3: Total flavonoids. 4: Normal saline.图4 7.5 mg·mL-1总黄酮抑菌效果图Fig.4 Antimicrobial effect of 7.5 mg·mL-1 total flavonoids

本研究结果表明，黄秋葵黄酮类化合物对6种供试菌种均有抑菌活性，且对细菌的抑菌活性强于除白假丝酵母外其他真菌的抑菌活性，这与前人在多年生藤本豆[36]、玉米苞叶[37]等植物中提取的黄酮类化合物抑菌活性试验结果基本一致。MIC是衡量物质抑制病原菌生长活性的重要参数，值越小表示抑菌活性越大。通过与不同植物黄酮类化合物的抑菌活性MIC的比较发现，黄秋葵总黄酮对细菌的抑菌活性弱于桑葚(2倍)[38]、荔枝皮(1.5～2倍)[39]，强于鱼腥草(5%)[40]；对真菌的抑菌活性弱于桑葚(2.5倍)[38]，强于荔枝皮(67%)[39]。说明抑菌活性大小还可能与黄酮类物质的具体成分有关。将黄秋葵总黄酮与5种常见的中药材乙醇提取物的抑菌活性进行比较，可知黄秋葵总黄酮对细菌的抑菌活性弱于黄芩，但强于薄荷、知母、甘草、金银花等，而黄秋葵总黄酮对黑根霉的MIC为薄荷的10%，亦表明该物质有较强的抑菌活性[40]。综上所述，黄秋葵黄酮类化合物在开发天然抗菌剂方面具有良好的应用前景，其抑菌具体作用机制与抗菌活性成分有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，黄秋葵中主要黄酮类化合物槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取条件为提取温度50℃、提取时间10 min、乙醇浓度70%、料液比1∶28.4 g·mL-1；槲皮素-3-龙胆二糖苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷在不同提取条件下的含量变化趋势和总黄酮相同，确定最佳提取条件为提取温度37℃、提取时间20 min、乙醇浓度70%、料液比1∶25 g·mL-1。在后者条件下，黄秋葵中总黄酮含量为4 576.1 μg·g-1；槲皮素-3-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、异槲皮苷和槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量分别为2 403.7、516.5、1 170.7 和485.2 μg·g-1。体外抑菌试验表明，一定浓度的黄秋葵总黄酮对6种供试菌种均具有一定的抑菌活性，抑菌效果由大到小依次为：白假丝酵母>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>黑根霉>黑曲霉。