水稻不同源库相关基因聚合的产量效应分析

代明笠 邱先进 陈 凯 黄来健 卢宗强 闻乃强 邢丹英 徐建龙

(1长江大学/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北 荆州 434025；2中国农业科学院农业基因组研究所，广东 深圳 518210；3广东省惠州市惠阳区农业科学研究所，广东 惠阳 516100；4中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

水稻(Oryza sativaL)是世界上最主要的粮食作物之一，高产始终是最重要的育种目标[1-2]。 水稻产量的高低主要取决于源、库、流的大小及彼此之间的协调程度，其中穗粒数和籽粒大小或重量是光合产物积累的主要库性状，上三叶特别是剑叶是光合产物生产的主要源性状[3-5]。 充分挖掘已克隆的产量相关基因的优异单倍型，鉴定不同基因优异单倍型的聚合效应，通过分子聚合育种手段培育超高产的品种是未来水稻育种的重要研究方向。

迄今已有不少控制源、库相关性状的主效基因被精细定位或克隆，如籽粒大小或粒重基因GS3[6]、GW2[7]、qSW5[8]/GW5[9]，叶片大小和穗粒数基因qFSR4[10]、qFL1.1[11]、SS1 (NAL1 )[12-13]、SS2(GNP1)[13-14]，株高、抽穗期和穗粒数基因Ghd7[15-16]和Ghd8[17]等。 其中Ghd7 和Ghd8 是2 个多效性基因，同时控制抽穗期、株高和穗粒数，分别位于水稻第7 和第8 染色体。Ghd7 编码一个CCT(CO、COL、TOC1)结构蛋白，其表达和功能受光周期调控。 该基因的编码蛋白不仅参与开花的调控，而且对植株的生长、分化及生物学产量有普遍的促进效应。 在长日照条件下，Ghd7 基因的表达增强，从而推迟抽穗，植株增高，穗子变大，穗粒数增多[16]。 此外，Ghd7 还控制水稻剑叶长宽和叶面积，影响源性状[18]。Gdh8 编码一个含有CBFD＿NFYB＿HMF 结构域的多肽。 长日照条件下，Ghd8 通过调节Ehd1、RFT1 和Hd3a延迟水稻开花，但短日照条件下可促进水稻开花[17]。 此外，Ghd8能够上调水稻分蘖发生基因MOC1 的表达，从而增加水稻的分蘖数、一次枝梗数和二次枝梗数[17]。NAL1位于第4 染色体，包含5 个外显子，编码蛋白由582 氨基酸组成，通过影响水稻生长素的极性运输调控植物叶宽和株高[13]，同时也调控叶绿素含量、每穗粒数和穗型[19]。GNP1 编码一个GA20 氧化酶，它是催化赤霉素生物合成倒数第二步反应的关键酶。GNP1 基因在水稻营养生长阶段促进植株长高和叶鞘伸长，在生殖生长阶段通过增加水稻穗部分生组织中的细胞分裂素活性，提高籽粒数量和产量[15]。 上述4 个基因均直接调控水稻源、库相关性状的形成，对提高水稻产量具有重要的应用价值。 但是，它们聚合后的产量效应和对产量组成性状的影响还没有系统的报道。

前期中国农业科学院作物科学研究所水稻分子育种实验室从华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室引进Ghd7 和Ghd8 2 个基因导入珍汕97B 背景的近等基因系材料[16-17]，并构建了特青背景的NAL1 和Lemont 背景的GNP1 近等基因导入系。 本研究将这4个基因的近等基因系两两相互杂交，构建6 个双基因聚合的分离群体，利用这4 个基因的功能标记或紧密连锁的标记对分离群体进行基因型鉴定，比较不同双基因聚合系的源库性状表现，分析基因聚合效应，旨在为分子标记辅助聚合改良水稻库源性状和进一步提高产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

前期以美国优质粳稻品种Lemont(LT)、我国高产籼稻品种特青(TQ)为亲本，构建了NAL1 位点LT 等位基因导入TQ 背景的近等基因系TQ-NAL1LT，GNP1位点TQ 等位基因导入LT 背景的近等基因系LTGNP1TQ。 引进Ghd7 位点明恢63 等位基因和Ghd8 位点9311 等位基因导入珍汕97B(ZS97)背景的近等基因系ZS97-Ghd7MH63和ZS97-Ghd89311。 其中NAL1 的有利等位基因来源于LT，增加剑叶宽、每穗粒数和产量；GNP1 的有利等位基因来源于TQ，增加剑叶长、每穗粒数和产量；Ghd7 和Ghd8 的有利等位基因分别来源于明恢63 和9311，在长日照条件下延迟开花，增加株高、穗粒数和产量。 本研究以上述4 个单基因近等基因系作为亲本，两两杂交构建6 个组合的F2分离群体，即TQ-NAL1LT/LT-GNP1TQ(Pop1)、TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd7MH63(Pop2)、TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd89311(Pop3)、LT-GNP1TQ/ZS97-Ghd7MH63(Pop4)、LT-GNP1TQ/ZS97-Ghd89311(Pop5) 和 ZS97 -Ghd7MH63/ZS97 -Ghd89311(Pop6)，用于不同双基因聚合体的筛选。

1.2 DNA 提取和标记辅助选择

试验地点在深圳市中国农业科学院深圳生物育种创新研究院试验农场，2016 年6 月20 日播种，7 月15日单本移栽上述6 个F2分离群体，每行10 株，每个群体的双亲各种植3 行，每个F2群体种植30 ～40 行不等，单本种植，种植行株距为20 cm×15 cm。 在水稻移栽返青后，每群体单株按对应株行位置编号，逐株取嫩叶，参照CTAB 法[20]提取DNA。

查找公开发表的4 个基因的紧密连锁标记或功能标记，获得了26 个紧密连锁的SSR 和InDel 标记，经双亲多态性筛选最终得到7 个在双亲间有多态性的标记(表1)，用于PCR 扩增和电泳，进行分子标记辅助鉴定筛选聚合群体中的单基因纯合和双基因纯合个体，选收目标单株种子用于F3性状考查。 PCR 反应和凝胶电泳参照Murry 等[20]的方法。

表1 用于标记辅助选择的多态标记信息Table 1 Information of polymorphic markers used for marker-assisted selection

1.3 F3 株系的田间种植与性状考察

试验地点在海南省三亚市崖州区南滨农场中国农业科学院作物科学研究所试验基地，于2016 年11 月25 日播种，12 月20 日单本移栽所有组合入选的F3家系及亲本株系。 每个组合的F3家系和对应的双亲挨在一起，F3家系和双亲完全随机排列，每份材料单本种植2 行，每行10 株，3 次重复，种植行株距为20 cm×15 cm，田间管理同常规大田管理。 齐穗后每株选其最高的穗测量其剑叶长、宽，测量株高和考查单株有效穗数，根据剑叶长×剑叶宽×0.75 计算剑叶面积[21]。 成熟后每株收取上述1 个主穗，考察穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等性状，最后按株系混收测产，加上穗部取样的谷重合并计算单株平均产量。

1.4 双基因聚合系的选育及在多个环境下的产量评价

对产量聚合效应明显的3 对聚合系NAL1LT＋Ghd7MH63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311，2017年春季，从每种双基因聚合及对应的单基因F3株系中分别选择株高、抽穗期较一致且产量表现最好的1 个株系，从中选收5 个代表单株，采用每个基因紧密连锁的分子标记鉴定目标单基因和双基因的纯合性。 2017年夏季，在广东省惠州市惠阳区农业科学研究所基地种植F4株系，同样从每种双基因聚合系及对应的单基因系中选综合性状整齐一致且产量最好的1 个株系，选收5 个代表单株并进行目标基因型的标记辅助鉴定。 入选的单株于2017 年冬季在海南加代种植F5株系，从每种双基因聚合系及对应的单基因系中选综合性状表现稳定一致且产量最好的1 个株系混收。 2017年夏季在浙江杭州、江西萍乡和广东惠州进行小区品比试验，3 个试验点的播种期分别为5 月25 日、5 月26 日和7 月10 日，播种25 d 秧龄单本移栽，以黄华占为对照，每小区种植1.3 × 10-3hm2，行株距20 cm ×15 cm，3 次重复，大田管理遵循当地生产习惯。 成熟后小区实测产量，分析不同基因聚合系在不同环境下的产量表现。

1.5 数据分析

取株系内各单株测量值的平均值，代表株系的性状值用于统计分析；小区测产时以小区的平均产量用于统计分析。 采用SAS 9.2 软件进行多重比较和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 标记辅助鉴定不同基因聚合体

由表2 可知，利用RM3534 和SL40 从TQ-NAL1LT/LT-GNP1TQ(Pop1) 的F2分离群体中，筛选到带有NAL1LT单基因纯合且不带GNP1TQ基因的单株20 株，带有GNP1TQ单基因型纯合且不带NAL1LT基因的单株21 株，同时带有双基因(NAL1LT＋GNP1TQ)纯合的单株15 株。 利用RM3534 和RM5436 从TQ-NAL1LT/ZS97-Ghd7MH63(Pop2)的F2群体中筛选到NAL1LT单基因型纯合但不带Ghd7MH63基因的单株17 株，Ghd7MH63单基因型纯合但不带NAL1LT基因的单株15 株，同时带有双基因(NAL1LT＋Ghd7MH63)纯合的单株14 株。 同样地，利用各基因的多态性连锁或功能标记从其他(Pop3～Pop6)4 个F2群体中分别筛选到18、20、22 和15 株NAL1LT＋Ghd89311、GNP1TQ＋Ghd7MH63、GNP1TQ＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311不同双基因纯合聚合单株。 上述各群体中入选的单基因和双基因纯合体收获自交种子用于F3株系性状评价。

2.2 不同源库基因两两聚合的效应分析

在2 个单基因系杂交的F2群体中利用与每个基因的紧密连锁或功能标记辅助选择单基因个体和双基因聚合体，比较只有2 个基因位点差异的个体性状值，可以在近似遗传背景下分析双基因的聚合效应。 由表3 可知，在海南种植环境下，NAL1 单基因系的剑叶宽与双基因(NAL1 ＋GNP1)聚合系相似，但显著宽于GNP1 单基因系；双基因聚合系的千粒重显著低于双亲，聚合后的单株产量低于双亲，但未达到显著水平。

NAL1 单基因系的剑叶长、穗长和千粒重显著小于Ghd7 单基因系(表3)。 与双亲单基因系相比，双基因聚合系的一次枝梗数和每穗颖花数较NLA1 单基因系显著增加，二次枝梗数和每穗实粒数较Ghd7 单基因系显著增加，但穗长显著减小；双基因聚合系的单株产量较NAL1 和Ghd7 单基因系分别显著增加37.01%和26.45%，表明NAL1 与Ghd7 聚合后具有显著的增产效果。

NAL1 单基因系的剑叶宽显著宽于Ghd8 单基因系，但单株有效穗数显著少于Ghd8(表3)。 与双亲单基因系相比，NAL1 和Ghd8 基因聚合系在9 个性状存在差异显著。 双基因聚合系的单株有效穗数显著多于NAL1 单基因系，株高、剑叶宽、每穗颖花数和每穗实粒数则显著高于Ghd8 单基因系；此外，双基因聚合系的剑叶长、剑叶面积、二次枝梗数和单株产量均显著高于双亲单基因，其中双基因聚合系的单株产量分别较NAL1 和Ghd8 单基因系显著增加73.72%和45.47%，表明NAL1 和Ghd8 聚合的产量效应显著。

GNP1 单基因系的剑叶宽、剑叶面积和千粒重分别比Ghd7 单基因系显著小0.18 cm、6.68 cm2和2.70 g(表3)。 双基因聚合后有9 个性状与单基因亲本具有显著差异，其中双基因聚合系的株高、剑叶长、剑叶宽和剑叶面积分别较GNP1 单基因系显著增加但每穗颖花数则显著减少；一次枝梗数和千粒重比Ghd7 单基因系显著减少；双基因聚合系的穗长较GNP1 和Ghd7 2 个单基因系显著增长但每穗实粒数均显著减少。 双基因聚合系的单株产量与2 个单基因系均无显著差异，表明GNP1 和Ghd7 聚合无明显的增产效应。

表2 6 个F2 聚合群体中筛选出的纯合单基因和双基因个体数Table 2 Number of individuals with homozygous single and two genes selected from six F2 pyramiding populations

GNP1 和Ghd8 2 个单基因系之间在所有考查的性状上均无显著差异(表3)。 双基因聚合系的每穗颖花数和每穗实粒数较GNP1 单基因系分别显著减少，株高较Ghd8 单基因系显著增加，穗长比GNP1 和Ghd8 2个单基因系均显著增长；双基因聚合系的单株产量与GNP1 单基因系基本持平，但较Ghd8 单基因系显著降低(29.40%)，表明GNP1 和Ghd8 聚合对产量没有正向效应。

除Ghd7 单基因系的株高和千粒重显著高于Ghd8单基因系外，其他性状两者间均无显著差异(表3)。双基因聚合系的株高和千粒重均较Ghd8 单基因系显著增加，单株有效穗数和结实率均较Ghd7 和Ghd8 2个单基因系显著增加，最终导致双基因聚合系的单株产量比2 个单基因系分别显著增加63.15% 和48.03%，表明Ghd7 与Ghd8 聚合具有显著的增产优势。

2.3 优良聚合系的产量表现

由表4 可知，NAL1LT＋Ghd7MH63聚合系在杭州、萍乡和惠州3 个环境下的平均产量分别为570.93、560.30 和544.60 kg·667m-2，分别较对照品种黄华占显著增加6.63%、6.43%和5.06%；NAL1LT＋Ghd89311在3 个环境下的平均产量分别为582.07、573.63 和561.17 kg·667m-2，分别较对照极显著增加8.71%、8.96%和8.26%；Ghd7MH63＋Ghd89311在3 个环境下的平均产量分别为585.07、570.20 和555.87 kg·667m-2，分别较对照显著或极显著增加9.27%、8.31%和7.23%。 3 对双基因聚合系之间相比发现，NAL1LT＋Ghd89311在杭州、萍乡和惠州3 个环境下的平均产量分别比NAL1LT＋Ghd7MH63增加1.95%、2.38%和3.04%，但与Ghd7MH6＋Ghd89311在3 个环境下的产量基本持平。

表3 不同源库相关基因聚合系的源、库及产量相关性状的表现Table 3 Performances of sink-， source- and yield-related traits in pyramiding F3 lines

表4 3 种双基因聚合系在不同温光环境下的产量表现Table 4 Performances of grain yield of three types of pyramiding lines in different thermo-photoperiod conditions

3 讨论

3.1 水稻源库流大小及其协调性对产量的影响

提高单产一直是全世界范围水稻育种的最重要目标。 水稻产量的高低取决于源大小、库容量和光合产物运输能力(流大小)及三者间的协调程度[3-5]。 水稻高产基因NAL1[12]、GNP1[14]、Ghd7[16]和Ghd8[17]均表现一因多效，影响不同的源库性状，如剑叶长、剑叶宽、剑叶大小、穗粒数、抽穗期和株高等。 在海南短日照条件下，从产量要素的单株有效穗数、每穗颖花数、千粒重和结实率来看(表3)，4 个单基因系的源库流比较协调，彼此间的单株产量无显著差异。 通过对2 个单基因系杂交的F2群体中每个基因的标记进行辅助鉴定，筛选出单基因个体和双基因聚合体，由于F2个体的遗传背景是随机的，因此由一定数量组成的单基因个体与双基因聚合体之间只是目标基因区段的差异，单株之间的背景差异已基本相互抵消。 所以，通过比较双基因聚合体与2 个单基因亲本之间的性状差异，可以在近似遗传背景下解析双基因的聚合效应。 本研究发现这4 个源库相关基因两两聚合后对源、库构成因子及产量相关性状的影响不尽相同，导致单株产量存在显著差异。 如NAL1LT与GNP1TQ聚合后的单株有效穗数不足，造成植株水平的光合作用叶面积(源)小，尽管每穗粒数不少但千粒重低，库容量受到限制，导致较低的单株产量。 尽管GNP1TQ与Ghd7MH63和GNP1TQ与Ghd89311聚合后的源库相关性状协调，但可能由于光合产物从叶片向籽粒输送的流不畅，表现结实率低，造成每穗实粒数不高，同样导致单株产量不高。 相 反，NAL1LT＋Ghd7HM63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7HM63＋Ghd89311这3 种基因聚合方式表现出较明显的增产效应，聚合系的单株产量分别较高亲值显著增加26.45%、45.47%和48.03%。 分析认为，这3 种聚合系的产量提高得益于基因聚合后的源、库及产量相关性状都有不同程度的提高，而且彼此间的协调性较好。 相对而言，NAL1LT＋Ghd7HM63和NAL1LT＋Ghd89311聚合体属大穗类型，表现单株有效穗数偏少但每穗粒数较多；而Ghd7HM63＋Ghd89311属多穗类型，表现单株有效穗较多，每穗粒数相对偏少。 在实际生产上，大穗型品种和多穗型品种都有高产的事例[21-22]，前者趋向在高肥条件下易获得高产，而后者在较低肥料投入下也有较好的产量表现。 通过在浙江杭州、江西萍乡和广东惠州的不同温光环境下测试聚合系的产量发现，上述3 种源库相关基因(NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd89311)两两聚合均表现出稳定的产量水平，单位产量(hm2)均显著高于目前大面积种植的优质常规品种黄华占。 因此，将NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd89311这3 个高产有利等位基因按上述组合方式导入到高产籼稻品种背景，有望进一步提高其产量水平。

3.2 有利基因聚合是复杂性状改良的有效途径

基因聚合不论对简单的质量性状如抗病虫性[23-28]，还是对复杂的数量性状如抗旱[29]、耐盐性[30]、耐冷[31]等都有明显的改良效果。 本研究中，NAL1LT是来自美国热带粳稻Lemont 的高产基因[13]，GNP1TQ是来自我国广东的高产品种特青的高产基因[13-14]，Ghd7HM63和Ghd89311则分别是来自明恢63 和9311 的高产基因[16-17]。 不同有利基因聚合后如果在功能上能互补，那么提高性状的正向聚合效应就明显，如NAL1LT、Ghd7HM63和Ghd893113 个高产基因两两间聚合，其产量均较聚合双亲显著增加。 而另外3 种聚合方式(NAL1LT＋GNP1TQ、GNP1TQ＋Ghd7MH63和GNP1TQ＋Ghd89311)的源、库和产量相关性状与双亲相比，有增、有减或基本持平，聚合后的产量未明显提升，说明这3种基因的聚合对产量性状不具备互补性优势。 目前聚合育种大多局限于2～3 对少数主基因的聚合。 2 个基因聚合的互作分为加性×加性、加性×显性、显性×加性和显性×显性4 种互作模式，作物育种上基因聚合一般考虑的是加性×加性互作。 如果基因互作表现为正向协同作用，则基因聚合会表现出累加效应。 反之，如果基因互作表现为负向拮抗作用，则基因聚合往往与单基因效果一致，甚至还不如单基因的效果。 Wang等[32]通过抗旱QTL 聚合研究发现，只有将遗传上和生理上具有协同作用的不同有利基因聚合，才有可能获得性状明显增加的聚合效应。 因此，在实施聚合育种之前，有必要先鉴定双亲基因聚合是否具有遗传和生理上的协同效应，选择互为协同作用明显的有利基因聚合方式应用于品种改良实践，方能达到预期的效果。

4 结论

本研究利用4 个产量相关基因NAL1LT、GNP1TQ、Ghd7MH63和Ghd89311两两杂交筛选出的单基因和不同双基因聚合的纯合F3株系，在海南短日照条件下考察了单基因系及双基因聚合系的14 个源、库和产量相关性状，发现不同源、库基因聚合的增产效果不同，其中NAL1LT＋Ghd7MH63、NAL1LT＋Ghd89311和Ghd7MH63＋Ghd89311聚合系增产效果显著，聚合系在不同温光条件下表现稳定高产，聚合系可以作为高产育种的亲本利用。 另外3 种聚合方式NAL1LT＋GNP1TQ、GNP1TQ＋Ghd7MH63和GNP1TQ＋Ghd89311的聚合效果不佳。 研究指出，复杂性状基因的聚合育种，需要首先开展基因间的聚合效应研究，明确不同基因之间的聚合效应，以确保聚合育种获得预期的效果。