月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

包 颖 李泽卿 魏琳燕 陈 超

(1唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000；2中南林业科技大学风景园林学院，湖南 长沙 410000)

月季(Rosa hybrida)蔷薇科蔷薇属多年生半常绿低矮灌木，被誉为“花中皇后”，是我国十大传统名花之一。 月季具有姿态优美、色彩绚丽、品种繁多、芳香馥郁、适应性强等优点，在园林绿化和鲜花市场上有着十分重要的地位，具有非常重要的经济价值[1]。 现代月季栽培品种多是通过蔷薇属野生原种间、品种间反复杂交、回交等手段选育而成[2]，狭窄的遗传背景使大多数月季品种的抗性较差。 切花月季生产中设施内土壤盐渍化是影响月季切花品质和产量的限制因素。同时，盐碱地区的土壤环境严重制约了月季在当地园林绿化中的应用。 高盐胁迫导致大多数月季品种生长不良、病虫害加重，影响了月季的生长发育和观赏效果。 目前月季抗盐性分子机理的研究较少[3-4]，远滞后于花色、花型、花香等其他农艺性状的研究。 因此，发掘月季抗盐相关基因及解析月季盐胁迫分子机理已成为当下首要解决的问题。

通过转录因子调控功能基因的表达是植物应答逆境胁迫的关键环节[5-6]。 作为植物体内最大的转录因子家族之一，MYB 转录因子具有多种生物学功能，能够广泛参与植物的根、茎、叶、花的生长发育，同时参与盐渍、冷害、干旱等非生物胁迫的响应[7]。 MYB 类转录因子含有保守MYB 类型的DNA 结合域，且该结构域由51 ～52 个氨基酸的肽链组成[8]。 根据所含MYB 结构域的特点和数目，植物中的MYB 转录因子可分为4 个类型:4R-MYB、3R-MYB、R2R3-MYB 和4R-MYB，其中R2R3-MYB 类型的MYB 类转录因子数量较多，并且参与了植物的初生和次生代谢、植物细胞形态和模式建成以及植物生长发育等多个生命过 程 的 调 节[9-14]。 如拟南芥中的AtMYB21 和AtMYB24 基因的表达可促进其花青素的积累[15]；在拟南芥中AtMYB37、AtMYB38 和AtMYB84 调控着拟南芥侧分生组织的形成[16]；拟南芥中的AtMYB125基因在其生殖器官发育阶段参与了雄性生殖细胞的分裂分化[17]。

随着研究的不断深入，越来越多的报道证实MYB转录因子与植物响应高盐胁迫密切相关。 在盐胁迫处理下，甘薯中5 个R2R3-MYB 类型的MYB基因被诱导表达[18]；花生中有13 个MYB基因上调表达，5 个MYB基因下调表达[19]；柽柳中的7 个MYB基因均参与盐碱胁迫的应答[20]。 大量研究表明，MYB 转录因子还参与对植物激素的应答反应。 如，白桦中BpMYB21 基因的表达受到茉莉酸甲酯(methyl jasmonate， MeJA)和水杨酸(salicylic acid， SA)的诱导[21]；巴西橡胶树中HbMYB62 基因在脱落酸(abscisic acid， ABA)和SA 处理下显著上调[22]。

本研究依据前期已经完成的高盐胁迫下月季月月粉根系转录组测序数据结果，筛选获得表达水平显著上调的MYB类基因RcWER-like。 进一步对月季RcWER-like的序列进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR 分析月季RcWER-like基因在高盐胁迫、SA 和MeJA 处理、盐胁迫下外施SA 和MeJA 的表达模式，从而验证该基因的生物学功能，以期为深入剖析月季的抗盐机制和培育新的抗盐碱品种提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及前处理

中国二倍体古老月季品种月月粉(Rosa chinensisOld Blush)，购自昆明杨月季园艺有限责任公司，将其栽植于唐山师范学院温室内，并进行扦插繁殖。 选用生长状况良好、长势一致、植株健壮、无病虫害的当年生月季幼苗进行试验。

首先在每个栽培槽中用10 L 的1/2 Hoagland 营养液缓苗一周，然后用全Hoagland 营养液进行盐胁迫处理(200 mmol·L-1NaHCO3)、激素处理(1 μmol·L-1MeJA、200 μmol·L-1SA)以及盐与激素综合处理(200 mmol·L-1NaHCO3＋1 μmol·L-1MeJA、200 mmol·L-1NaHCO3＋200 μmol·L-1SA)，分别于处理0、2、6、12、2、48 h 时采集月季根系和叶片，于-80℃冰箱中保存备用。

1.2 总RNA 提取与cDNA 合成

月季总RNA 的提取采用EASY spin 植物RNA 快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；按照Roche 公司反转录试剂盒操作步骤反转录获得cDNA。

1.3 RcWER-like 基因的克隆

以月季月月粉cDNA 序列为模板设计CDS 全长扩增引物(表1)，并进行PCR 扩增。 PCR 反应体系:10×KOD Buffer 5 μL、2 mmol·L-1MgSO43 μL、25 mmol·L-1dNTPs 5 μL、cDNA 1 μL、(10 μmol·L-1)上下游引物各1.5 μL、KOD Plus 高保真酶1 μL，无菌ddH2O 补齐至20 μL。 混匀离心后放于ProFlexTMPCR仪(美国ABI 公司)中进行扩增。 反应程序:94℃预变性2 min；94℃变性15 s，56.1℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35 个循环；68℃延伸5 min，4℃反应终止。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit 试剂盒(大连TaKaRa 公司)回收目的条带，并与pMD18-T 载体连接。 连接产物转化大肠杆菌，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落鉴定，根据菌落PCR 结果，将鉴定出的阳性克隆交由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

1.4 月季转录因子RcWER-like 的生物信息学分析

根据前期盐胁迫转录组测序数据(SRA accession:PRJNA587482；ID: SUB6482523)和月季全基因组[23]数据，获取RcWER-like基因CDS 序列和基因全长序列。 根据所获得的RcWER-like基因cDNA 和基因全长序列，使用DNAMAN 软件分析RcWER-like 氨基酸序列同源性；使用clutaLX 进行氨基酸序列比对分析，使用MEGA 6.0 软件进行系统进化树分析。

1.5 实时荧光定量PCR 分析

采用软件Primer 5.0 设计RcWER-like的实时荧光定量引物，内参基因为RcActin，引物序列见表1。RcWER-like基因的表达量在7500 荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司)上进行检测。 PCR 反应体系:cDNA模板3 μL、10 μmol·L-1上游引物1 μL、10 μmol·L-1下游引物1 μL、SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、ddH2O 5 μL。 反应程序:94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火、延伸2 min，40 个循环。 每处理进行3 次生物学重复和3 次平行样重复。 相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，用SPSS 19.0 软件进行统计分析。

表1 试验中所用的引物Table 1 The information of primers used in this study

2 结果与分析

2.1 月季转录因子RcWER-like 的生物信息学分析

从月季月月粉中获得了RcWER-like基因的cDNA和基因序列全长(图1)。 测序结果表明，RcWER-like基因全长882 bp，开放阅读框(open reading frame，ORF)为669 bp，可编码223 个氨基酸。

图1 月季RcWER-like 基因的cDNA 扩增Fig.1 cDNA amplification of R. chinensis RcWER-like

利用DNAMAN 软件对RcWER-like 蛋白序列进行同源性比对发现，RcWER-like 蛋白序列与桃PpWERlike、梅花PmWER-like 和苹果MdWER-like 蛋白序列的相似度分别为63.36%、62.45%和59.62%；利用clutaLX 软件对转录因子RcWER-like 进行序列比对发现，RcWER-like 蛋白序列含有2 个MYB 家族特征结构域(R2 和R3 结构域)，分别由48 和46 个氨基酸构成，且在结构域中存在多个保守色氨酸残基(图2)。

为了进一步验证月季RcWER-like的基因功能，本研究利用MEGA 6.0 构建了月季RcWER-like 蛋白与其他植物的氨基酸序列进化树。 结果显示，RcWERlike 与蔷薇科的梅花PmWER-like、苹果MdWER-like和桃PpWER-like 的亲缘关系较近(图3)。

2.2 月季RcWER-like 在不同处理下的表达模式分析

2.2.1 盐胁迫对RcWER-like基因表达的影响 对月季月月粉进行高盐胁迫处理时，与对照相比，盐胁迫处理24 h 和48 h 的月季幼苗基部叶片明显褐化(图4)。对月季进行高盐胁迫处理后，RcWER-like基因表达明显受到诱导(图5)。RcWER-like基因在月季的叶和根均有表达，但在不同组织中的表达量存在显著差异，且根中的相对表达量明显高于叶中。 根中RcWER-like基因的相对表达量呈现上升趋势，在处理24 h 时达到最高(18.93)；叶中RcWER-like基因的相对表达量呈现先升高后下降的趋势，在处理12 h 时达到最高(2.35)。

2.2.2 外源激素对RcWER-like基因表达的影响 由图6 可知，在外源激素SA 和MeJA 作用下，RcWER-like基因在叶和根中的表达模式无明显差异。 在SA 处理12～48 h 时，根中RcWER-like相对表达量呈现持续上升的趋势，在处理48 h 达到最高(8.13)；叶中RcWERlike相对表达量呈现先升高后降低的趋势，在处理24 h 时达到最高(4.78)。 在MeJA 处理下，根和叶中RcWER-like的表达均明显受到诱导，且均在处理24 h时达到最高，分别为4.18 和3.58。 上述结果表明，外源激素SA 和MeJA 均可诱导月季RcWER-like基因的表达，且在根中的表达量相对较高，激素处理对RcWER-like的表达都具有明显诱导作用。

2.2.3 高盐胁迫和外源激素共处理对RcWER-like基因表达的影响 进一步利用Real-time PCR 对RcWERlike在高盐与激素同时处理下的表达量进行分析。 由图7 可知，在盐胁迫下施用SA 时，RcWER-like在根和叶中的相对表达量呈现先升高后降低的趋势，且都在处理24 h 时达到最高，分别为55.26 和3.43；在盐胁迫下施用MeJA 时，RcWER-like在根中的相对表达量呈现上升的趋势，在处理48 h 时达到最高，为74.45；RcWER-like在叶中的相对表达量呈现先升高后降低的趋势，在处理6 h 时达到最高，为20.82。 上述结果表明，在高盐胁迫与外源激素共同处理时，RcWER-like基因在叶和根中的表达模式存在显著差异，且在根中的相对表达量明显高于叶片。 此外，月季根系和叶片中RcWER-like基因的表达水平显著高于单独盐胁迫和激素处理。

3 讨论

图4 不同处理下月季的生长形态Fig.4 The growth shape of R. chinensis under different treatments

图5 盐胁迫下月季RcWER-like 的表达特性Fig.5 Expression characteristics of RcWER-like in R. chinensis under salt stress

MYB 类转录因子是植物最大的转录因子家族之一[24]，参与植物多种生物和非生物胁迫过程，从而使植物适应不同的逆境[25-26]。 本研究以月季月月粉为试验材料，初步分析了MYB 类转录因子基因RcWERlike的生物学功能。 结果表明，月季RcWER-like 氨基酸序列具有R2 和R3 保守结构域，属于R2R3-MYB 转录因子。 大量研究表明，大部分响应盐胁迫的MYB基因均为R2R3 类型。 如拟南芥中的AtMYB73 基因调控着其对盐胁迫的响应[27]；将苹果MdMYB73 基因遗传转化苹果愈伤组织，抗盐表型分析表明，MdMYB73 过量表达明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性[28]；棉花GhMYB73 基因受高盐胁迫诱导，抑制GhMYB73 在棉花中的表达增加了棉花对盐胁迫的敏感性，且过表达棉花GhMYB73 基因的拟南芥幼苗对盐胁迫的抗性增强[29]。 番茄MYB49 基因受盐胁迫的诱导，过表达番茄MYB49 基因的转基因植株对盐胁迫有较强的耐受性[30]。 此外，盐胁迫可以诱导切花月季中RhMYB96 基因的表达，过表达该基因的拟南芥转基因植株耐盐性增强[31]。 本研究中，高盐胁迫可诱导月季月月粉RcWER-like基因的表达，说明RcWER-like参与了高盐逆境胁迫的响应过程。

WER 属于R2R3 亚类成员，具有多种功能，在控制细胞分化、应答激素调节和外界环境刺激等方面发挥着一定作用[32]。 本研究中，系统进化树结果显示，月季月月粉 RcWER-like 与桃 PpWER-like、 梅花PmWER-like、苹果MdWER-like 处于同一分支，属于R2R3-MYB 类转录因子。 前人已从拟南芥中分离得与控制根毛发生有关的转录因子WER[33]。 由于WER位于调控根毛发生网络的上游，调控着其他转录因子，所以一般认为WER 是控制根毛发生的关键转录因子。 此外，Wang 等[34]发现拟南芥根毛的发育受盐胁迫的高度调控，且盐胁迫可以诱导拟南芥AtWER基因的表达。 以上结果均表明，转录因子RcWER-like 可能与月季抵抗盐胁迫有着密切的关系。

图6 不同激素处理下月季RcWER-like 的表达特性Fig.6 Expression characteristics of RcWER-like in R. chinensis under different exogenous hormones treatment

图7 盐与激素综合胁迫下RcWER-like 的表达特性Fig.7 Expression characteristics of RcWER-like under salt stress and exogenous hormones treatment

大量研究表明，MYB 转录因子参与对植物激素的应答过程。 在大豆中，ABA、赤霉素(gibberellins，GA3) 和荼乙酸(naphthylacetic acid， NAA) 可诱导GmMYBJ6 的表达，而GmMYBJ7 易被ABA 和NAA 诱导[35]；在柑橘中，ABA、氨基环丙烷羧酸(amino cyclopropane carboxylic acid， ACC)、SA、MeJA 均可诱导CitMYB40 的表达[36]；在小麦中，ABA 处理可上调TaMYB3R的表达，MeJA 对TaMYB3R的表达起到下调作用[37]；外源激素SA、ABA、MeJA 和GA3也可诱导白木香AsMYB1 和AsMYB2 基因的表达[38]。 本研究结果表明，外源激素SA、MeJA 均可诱导月季RcWER-like基因的表达，且在根中的表达量相对较高，这可能是由于根对于外源激素SA、MeJA 的刺激更为敏感。

植物激素除了参与植物的生长发育，还响应非生物胁迫如冷害、高温、高盐和干旱等过程。 外源MeJA可以抑制H2O2积累从而提高烟草的耐冷性[39]；外源MeJA 可显著提高冬小麦的抗寒性，且冬小麦叶片及分蘖节中TaPDF1.2、TaCOI1 和TaMYC2 基因的表达量显著增加[40]。 茉莉酸类物质(jasmonic acid， JAs)作为信号分子，可以激活植物逆境胁迫响应中的某些信号转导途径[41]。 本试验结果表明，盐胁迫与外施激素共同处理时，月季根和叶中RcWER-like基因的表达水平显著高于单独盐胁迫和激素处理，且外施MeJA 较SA 的诱导效果更显著。 由此推断，RcWER-like基因可能通过MeJA 信号途径参与月季盐胁迫应答。

4 结论

本研究克隆了月季RcWER-like基因，对该基因的生物学功能进行验证。 在盐胁迫下，外施水杨酸和茉莉酸甲均可诱导RcWER-like的表达，且均高于单盐或激素处理。 作为典型的R2R3-MYB 类转录因子，RcWER-like 可能在月季高盐胁迫应答中具有重要的作用，但对其功能的验证及其耐盐分子机制的揭示仍需进一步的研究。

致谢:感谢北京林业大学国家花卉工程技术研究中心韩瑜老师给予的支持和帮助! 感谢中国科学院武汉植物园助理研究员廖燎给予的支持和帮助!