不同品种和花期栀子花挥发性物质的主成分和聚类分析

卢路路 樊怡灵 邓 珂 许光治 王 艳 张有做 倪勤学

(浙江农林大学，浙江 杭州 311300)

栀子花(Gardeniajasminoides)为茜草科栀子属的花朵，原产于我国中部，是我国著名的八大香花植物之一[1-2]。我国具有丰富的栀子属资源，包括栀子、狭叶栀子、大黄栀子、海南栀子、匙叶栀子以及卷萼栀子6种栀子属植物[3]，现广泛分布于四川、江苏、浙江等地[4]。栀子鲜花目前主要用于栀子花浸膏或制作精油，是名贵的花香香料之一，多用于高级香水、香皂和化妆品香精之中，GB 2760-2014[5]也允许将栀子花浸膏用于食品，新鲜的花朵还可以作为饮食的原料[6-8]，此外栀子花粉中还含有丰富的蛋白质、维生素C以及矿物质等营养物质[9]，被称为“天然食品”“完全的营养品”[10]。近年来，随着对芳香疗法以及植物挥发性有机物研究的深入与重视，植物挥发性有机物对人体的积极作用逐渐得到大家重视，已经引起了较大的关注。研究表明，薰衣草[11]、栀子花[12]、茉莉花[13]、柠檬草[14]等芳香植物挥发物具有抗衰老、镇静、抗忧郁和抗氧化等生理功能与药用价值，研究鲜花活体香气成分有助于进一步了解鲜花发挥功能功效的原理。然而目前国内研究主要集中于栀子果，针对栀子花的研究甚少，而有关不同品种栀子花挥发性物质相关方面的研究更欠缺。谭谊谈等[15]表明重庆北碚区的栀子花随着花期的延续酯类物质和烃类物质含量上升，而萜烯类物质的含量呈先下降后上升的趋势。为便于栀子花资源的开发利用，很有必要对不同品种和不同花期栀子花的挥发性物质进行研究。

固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)是一种不使用有机溶剂的新型采样技术，根据“相似相溶”原理对目标物质进行萃取和预富集，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有待测物质用量少、成本低、耗时短以及操作简便等优点，并且能更真实地反映出样品中挥发性成分及组成，因而被广泛应用于香气物质的分析[16-18]。

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(head space solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技术，结合主成分分析法对山栀子、水栀子、狭叶栀子和重瓣栀子4个栀子花品种的花蕾期Ⅰ、盛开期Ⅱ和衰败期Ⅲ 3个花期的12个栀子花样品进行分析，对栀子花的香气成分进行初步探索，并对其特征风味成分进行研究，以期为混合采摘不同品种不同花期的栀子花提供基础判定，且为栀子花资源后续的综合开发与利用提供有力的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栀子花采自浙江农林大学东湖校区及平山种植基地，如图1所示根据花瓣盛开的情况将其分为3类：花蕾期Ⅰ(花瓣并未完全露出，未见内层花瓣，且外层花瓣向花心倾斜)、盛开期Ⅱ(花瓣完全露出，外层花瓣上翘，且花瓣新鲜)、衰败期Ⅲ(花瓣完全露出，外层花瓣向花心相反方向开放，且花瓣萎焉)。将12个栀子花样品进行编号，如表1。

图1 12个栀子花样品

表1 栀子花样品编号

1.2 主要仪器与设备

GCMS-QP2010 Plus气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；57330-U手动固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)进样器、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB)萃取纤维头，美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 SPME条件 取1 g栀子花鲜花，转移至15 mL顶空螺纹瓶中，使用65 μm PDMS/DVB萃取头插入顶空螺纹瓶，于室温条件下顶空萃取10 min。将萃取头插入色谱仪进样口进行解吸，解吸温度250℃，解吸时间5 min。

1.3.2 气相色谱-质谱联用(gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS)条件 (1)GC条件：色谱柱：HP125 m×0.2 mm×0.33 μm弹性石英毛细管柱；载气：氦气(纯度>99.999 5%)；流速：1 mL·min-1；进样温度：250℃；不分流进样模式。色谱柱设置起始温度为40℃，保持3 min后以5℃·min-1升至80℃，保持3 min， 接着以5℃·min-1升温至300℃，保持3 min。

(2)MS条件：采用全扫描模式，70 eV EI电离，全扫描方法的质量范围设为35～600 m·min-1。接口温度250℃，传输线和离子源温度均设为250℃。

1.3.3 成分定性及定量分析 经GC-MS得到挥发性成分的总离子流色谱图，各组分质谱数据输入计算机库进行检索匹配，同时结合相对保留时间，参考文献[19-24]确认香气物质的化学成分；经GC-MS检出的各组分采用峰面积归一化法[25]确定各化合物的相对含量。

1.3.4 数据分析 利用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行数据统计、主成分分析(principal component analysis,PCA) 和聚类分析(clustering analysis,CA)。

2 结果与分析

2.1 不同品种和花期栀子花挥发性物质的比较

由表2可知，供试的12个栀子花样品通过HS-SPME-GC-MS分析共检出52种挥发性物质，包含7种类型的挥发性物质：烯烃(10种)、烷烃(2种)、醛类(1种)、醇类(8种)、酚类(1种)、酯类(29种)和1种吲哚挥发性物质，其相对含量见表3。

表2 栀子花不同品种不同花期挥发性成分相对含量

表2(续)

表3 不同栀子花样品挥发性物质种类及相对含量

由表3可知，烯烃类、醇类和酯类是12个栀子花样品挥发性物质所占含量最多的3类，占总含量的90%以上。由表2可知，叶醇、芳樟醇、罗勒烯、金合欢烯以及戊酸叶醇酯在12个栀子花样品中的相对含量均较高。栀子花样品中部分挥发性物质相对含量高、香气阈值低且具有独特的香型，对栀子花的香气有明显的贡献，如罗勒烯具有温暖的草香、甜香并伴有橙花油的香气[26]，芳樟醇具有铃兰香味[27]，金合欢烯是倍半萜类香料成分，具有花香和木香气息[28]，正己醇具有水果清芬的香气，叶醇具有强烈的嫩叶清香气味。

花蕾期Ⅰ中，水栀子中叶醇的相对含量明显高于狭叶栀子中的相对含量，而在山栀子和重瓣栀子中并未检测到叶醇；盛开期Ⅱ中，山栀子和重瓣栀子中检出了叶醇，水栀子和狭叶栀子中叶醇的相对含量与花蕾期Ⅰ相比都有所减少；衰败期Ⅲ中，狭叶栀子叶醇相对含量陡然上升至15.42%，山栀子叶醇含量与盛开期Ⅱ相比无较大变化，而水栀子和重瓣栀子中并未检出叶醇。在12个栀子花样品中均检出罗勒烯、芳樟醇和金合欢烯等。各品种栀子花芳樟醇的相对含量变化趋势一致，均为衰败期Ⅲ>盛开期Ⅱ>花蕾期Ⅰ，即随着花期的延长，栀子花芳樟醇的相对含量逐步上升。山栀子和水栀子罗勒烯以及重瓣栀子金合欢烯的相对含量均随着花期延长先下降后上升。山栀子和狭叶栀子金合欢烯以及重瓣栀子罗勒烯的相对含量均随着花期的延续下降。狭叶栀子罗勒烯和水栀子金合欢烯的相对含量随着花期的延续均上升。综上，不同品种不同花期栀子花间挥发性成分种类与总量变化无明显规律性。

2.2 栀子花挥发性物质主成分分析

将12个栀子花样品中检测到的52种挥发性物质相对含量组建成12×52的矩阵，利用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行PCA分析，相关矩阵的特征值、方差贡献率及累计贡献率如表4所示。可以看出，总方差61.771%的贡献率来自前3个主成分，其方差贡献率分别为27.046%、20.666%、14.059%，说明这3个主成分基本包含了栀子花样品的绝大部分信息。因此，本试验选择前3个主成分因子进行分析。

表4 主成分的方差贡献率

以PC1、PC2和PC3为三维坐标轴，绘制其因子负荷散点图，得到52种栀子花挥发性物质的三维因子载荷散点图(图2)。第1主成分方差贡献率为27.046%，其中载荷较高的正影响挥发性物质主要有乙酸叶醇酯、苯甲酸甲酯、丙酸己酯、丁酸叶醇酯、乙酸苄酯、苯甲酸乙酯(具有膏香、蜜甜的香气)、水杨酸甲酯、己酸叶醇酯、β-石竹烯、茉莉内酯、γ-杜松烯、反式-橙花叔醇、苯甲酸叶醇酯和苯甲酸己酯，其中反式-橙花叔醇的载荷量最高，为0.918；载荷较高的负影响挥发性物质有(E)-β-罗勒烯、罗勒烯、别罗勒烯，其中(E)-β-罗勒烯和罗勒烯的载荷量分别为0.731和0.726。第2主成分方差贡献率为20.666%，其中载荷量较高的正影响挥发性物质主要有乙酸己酯、丁酸异戊酯、丁酸己酯、戊酸叶醇酯、异戊酸己酯、吲哚、苯甲酸丁酯、苯甲酸异戊酯，其中丁酸己酯的载荷量最高，为0.893；载荷较高的负影响挥发性物质主要有2-甲基丁酸甲酯、芳樟醇、4,6-二甲基十二烷、金合欢烯，其中芳樟醇和金合欢烯载荷量较高，分别为0.633和0.696。第3主成分方差贡献率为14.059%，其中载荷量较高的正影响挥发性物质主要有反式异丁香酚、惕各酸苯乙酯，其中反式异丁香酚的载荷量最高，为0.723；载荷量较高的负影响挥发性物质主要是2-甲基丁醇、惕各酸乙酯、十六醛，其中2-甲基丁醇载荷量最高，为0.726。

图2 12个栀子花样品的52种挥发性物质的3D载荷得分图

由图3可知，12个栀子花样品可区分为2类。其中花蕾期Ⅰ的山栀子、3个花期的水栀子、以及花蕾期Ⅰ的重瓣栀子归为一个集群；其他7个样品归为一个集群。同一个集群的栀子花样品香型相似，相似香型的栀子花可以考虑混合采集应用到后续的生产与加工中。

图3 12个栀子花样品的主成分3D得分图

2.3 栀子花挥发性物质聚类分析

本试验采用Q型聚类方式，度量标准为欧氏距离的平方，通过组间连接的方式，以52个栀子花的挥发性物质作为变量，对4个不同品种3个花期栀子花的挥发性物质进行聚类分析(图4)。结果表明，当横坐标距离为15时，可以将12个栀子花样品分为2个集群，花蕾期Ⅰ的山栀子、3个花期的水栀子、花蕾期Ⅰ的重瓣栀子归为1个集群,剩下的7个样品归为1个集群；距离为10时，12个样品分为5个集群，花蕾期Ⅰ山栀子和重瓣栀子以及衰败期Ⅲ水栀子为1个集群，花蕾期Ⅰ和盛开期Ⅱ的水栀子为1个集群，花蕾期Ⅰ和盛开期Ⅱ的狭叶栀子为1个集群，盛开期Ⅱ的山栀子和重瓣栀子、衰败期Ⅲ的山栀子和狭叶栀子为1个集群，衰败期Ⅲ重瓣栀子单独为1个集群。距离为5时，12个样品被分为6个集群，其他分组不变，盛花期Ⅱ重瓣栀子被单独划为一个集群。PCA的结果与CA刻度为15时的结果相一致，说明通过两者的分析，均可以对12个栀子花样品进行分类。CA根据刻度不同可以有多种分类结果，且CA模型结论直观简明；而PCA根据得分仅获得一种侧重于信息贡献影响力综合评价的分类结果。通过PCA和CA对不同品种和不同花期栀子花的香型进行判定分类，可以为后期栀子花的采集提供理论依据，即选择同一集群中的栀子花，生产加工得到的产品香型相似，从而为后续的生产进行指导。

图4 12个栀子花样品的CA树状图

3 讨论

任何一种花都存在几十种挥发性成分，挥发性成分的种类和含量对花的香气品质起着重要作用。陈彤等[29]在栀子花中共鉴定出70种化合物，主要为醇类、酯类、烃类和酮类化合物。黄昕蕾等[30]研究发现鼓槌石斛不同花期挥发性物质的种类呈先上升后下降的趋势，在盛花期达到最高。薛丹等[31]研究发现大花栀子中罗勒烯、芳樟醇和金合欢烯的相对含量较高。本研究结果表明，随着花期的延续，挥发性物质的种类和总量呈先升高后降低的趋势。从种类上讲，花蕾期最少，盛花期最多，符合鲜花盛开过程中香味逐渐浓郁的现象，这与前人的结果基本一致；从总量上讲，虽然衰败期挥发性物质的种类与盛花期相接近，但各类香气成分相对含量普遍低于盛花期，与谭谊谈等[15]的研究一致，也与鲜花普遍在盛开期香气最浓郁的观念相符。造成各类挥发性成分含量存在较大差异可能与采摘时间、采摘地点以及在运输过程中挥发性化合物自身的氧化还原反应等有关。本试验只选用了临安地区的栀子花样品进行分析，后续可研究不同产地对栀子花挥发性物质的影响。

4 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS法对4个品种3个花期栀子花的挥发性物质进行定性定量分析，供试的12个栀子花样品共鉴定出52种挥发性物质，其中主要包括烯烃类、烷烃类、醛类、醇类、酚类和酯类六大类。对12个栀子花样品的52种挥发性物质进行主成分分析，对前3个主成分得分进行分析，结果表明12个栀子花样品可分为2个集群，花蕾期Ⅰ山栀子、花蕾期Ⅰ重瓣栀子以及3个花期的水栀子归为1个集群，另外7个样品归于1个集群。聚类分析在刻度15时的结果与主成分分析一致，即2种方法均能较好地反映栀子花样品间的差异性。本研究为栀子花在挥发性物质的分类选择、原料的混合采摘以及后期产品的生产加工提供了依据。