基于矿质元素指纹的粉葛产地溯源研究

贺媛媛 孙倩倩 郭波莉 张 磊

(中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

中药材粉葛(PuerariaethomsoniiRadix)是豆科植物甘葛藤(PuerariaethomsoniiBenth) 的干燥根。传统中药学上，粉葛主治解肌退热，具有生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络以及解酒毒等功效[1]。粉葛富含淀粉、微量元素以及葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类成分，具有降三高、抗心律失常、扩张冠状血管、脑保护、抗氧化、抗肿瘤以及提高记忆等功效[2]。我国是粉葛生产大国，每年日本、东南亚、欧美等国家从我国进口大量粉葛初级产品，经深加工后生产相关的药品和保健品。2012年，世界粮农组织等权威机构已经将葛根列入世界六大粮食作物之一[3]。市场对粉葛的需求量逐年增加，各地种植面积不断攀升。

葛根素、大豆苷等异黄酮成分含量直接影响粉葛质量。不同产地葛根中的总黄酮、葛根素、大豆苷元等含量均存在显著差异。其中，不同产地葛根中葛根黄酮含量相差约3倍，葛根素含量相差约20倍，大豆苷元含量相差约30倍[4]。目前，粉葛市场鱼龙混杂，不同产地来源的粉葛产品品质良莠不齐。在经济利益的驱动下，不法生产商以次充好，且虚假标签现象极为严重，粉葛产地的真实性急需确证[5]。但由于不同地理来源粉葛特征相似，仅采用传统的鉴别方法很难准确鉴别其产地。

前人对葛根产地溯源研究主要采用红外光谱[6-8]、荧光[9]和近红外光谱[10]等方法，通过测定其活性成分以判别葛根产地来源。但活性成分受品种、贮藏时间等因素影响较大，建立的产地判别模型的稳定性有待进一步提高。生物体矿质元素因其自身不能合成，必需从土壤、水等周围环境中获取，因而带有其产地特有的地理指纹信息，相比生物体有机成分而言，矿质元素指纹对农产品产地鉴别更为稳定。目前，矿质元素指纹分析已应用于粮谷类[11]、果蔬类[12]、茶叶[13]及多种中药材[14-15]等植物源性农产品产地溯源[16]。逐步判别分析是在判别分析的基础上，根据Wilk’s Lambda准则分析将数据逐步输入，同时采用留一法进行交叉验证，以此获得区分不同地域来源样品的最佳判别变量，属于有监督的模式识别方法。Zhang等[14]采用矿质元素指纹对中宁及中宁周边枸杞进行分析，结合逐步判别分析表明，经回代检验和交叉验证中宁枸杞的正确判别率分别为95.7%和85.7%。

本研究重点分析矿质元素指纹在粉葛产地溯源中的可行性，并结合化学计量学分析筛选有效的产地溯源指标，旨在为粉葛原产地鉴别提供方法，为维护粉葛行业诚信体系，保障公平竞争，促进粉葛产业的健康发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本研究采集了43份人工种植粉葛样品，其中陕西样品14份、湖北样品15份、广西样品14份，样品均于2018年12月至2019年1月采收。样品采集具体地理信息以及种植期间气象信息见表1。

表1 样品采样地地理位置和种植期间气象信息

选择各地粉葛样品种植区域，根据区域面积大小，按照土壤样品采集技术规范采集表层(0～20 cm)土壤样品；剔除土壤中石子、植物根须等杂物，将土壤样品混匀，采用四分法去除多余土壤样品。依照此原则，共采集土壤样品19份，其中陕西4份、湖北10份、广西5份。

试验所用试剂包括：硝酸(北京化学试剂研究所，BV-Ⅲ)、双氧水(北京化学试剂研究所，BV-Ⅲ)、氢氟酸(阿拉丁公司，分析纯)、高氯酸(北京化学试剂研究所，优级纯)、18.2 MΩ·cm-1超纯水(美国Millipore 公司)、Part#5183-4688环境标准液(美国Agilent公司)、人参标准物质(GBW 10027，国家标准物质研究中心)、土壤标准物质(GBW 07446，国家标准物质研究中心)。

1.2 主要仪器与设备

LGJ-10冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；DE-250中药粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；MARS 240/50微波消解仪，美国CEM公司；7700电感耦合等离子体质谱仪，美国Agilent公司；QM -3SP2行星式球磨机，南京大学仪器厂。

1.3 样品测定

1.3.1 样品预处理 粉葛样品：采收后的粉葛先用自来水充分清洗去除表皮泥土，后用去离子水冲洗3遍，去皮、切丁，置于冷冻干燥机对其进行冷冻干燥72 h (-60～-55℃)；冻干样品用中药粉碎机进行粉碎，过200目筛后于聚乙烯塑料瓶中密封保存，待测。

土壤样品：在自然条件下阴干后，采用球磨仪将土壤磨碎，过200目筛网，获得细粉，装入聚乙烯塑料袋中保存，待测。

1.3.2 样品消解 粉葛样品：称取粉葛样品0.25 g于Teflon消解管中，加入6 mL硝酸，使其与样品充分反应2 h后，再加入2 mL双氧水，继续反应0.5 h后，将其有序地放入微波消解仪中消解，以去除样品中的有机物。微波消解程序：在1 600 W功率下经8 min升温至120℃，保持2 min；保持功率不变，继续升温5 min至160℃，保持5 min；保持功率不变，升温5 min至180℃，保持30 min。将消解管从微波消解仪中按序取出，放在180℃赶酸板上进行赶酸约40 min后将其定容至100 mL[14]，4℃储存，备测。

土壤样品：称取土壤样品0.05 g于Teflon消解罐中，加入8 mL浓硝酸，让其与样品充分反应2 h后，加入2 mL氢氟酸，将其有序放入微波消解仪进行消解，以去除土壤样品中的有机物。微波消解程序：升温10 min使得消解温度升至120℃，在此温度下保持4 min；继续升温8 min，使得消解温度达到160℃，在此温度下保持4 min；持续升温5 min，待消解温度达到185℃，在此温度下保持25 min，整个过程功率始终保持为1 600 W。微波消解结束后，再加入1 mL高氯酸，然后有序放在185℃赶酸板上赶酸50 min，定容至100 mL塑料方瓶[14]，于4℃储存备测。

1.3.3 样品元素含量测定 取10 mL上述溶液注入到待测试塑料试管中，在电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)上进行B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti元素含量的测定。ICP-MS仪器参数如下：射频功率(radio frequency, RF)为1 280 W，冷却气流速为1.47 L·min-1，雾化室温度为2℃，蠕动泵为0.10 rps，氩气作为载气，其流速和辅助气流速均为1 L·min-1。Ge、In和Bi为在线内标以实时监测仪器稳定性。试验所有样品经3次重复测定，当内标元素的相对标准差>5% 时，样品需重新测定。本研究粉葛样品分析选择GBW 10027人参粉成分分析标准物质作为参考材料，土壤样品选择GBW 07446土壤成分分析标准物质作为参考材料对试验操作全过程进行控制。标准品回收率均在 85%～110% 之间。

1.4 统计分析

利用SPSS 22.0软件对数据进行Shaprio-Wilk正态分析、描述性分析、方差分析(ANOVA)、Duncan’s多重比较。采用比率分析对各元素中的中位/平均居中变异系数(coefficient of variation，COV)进行计算，将设置的新变量K=1作为分母，其余连续变量作为分子进行计算[17]。采用多元统计分析中主成分分析(principal component analysis，PCA)、逐步判别分析(stepwise discriminant analysis，SLDA)和分层聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)对不同地域来源样品进行分类，其中采用SIMCA 14.0软件分析HCA，采用SPSS 22.0软件分析PCA和SLDA。

2 结果与分析

2.1 粉葛中矿质元素含量特征

对粉葛中B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti 22种矿质元素进行Shapiro-Wilk正态分析(表2)。结果表明，各地域粉葛中Mg、P、K、Ca、Cu、Zn、Sr元素含量服从正态分布，其余元素含量在各地域间不完全符合或部分符合正态分布。对呈正态分布的元素取平均值，非正态分布的元素取其中位数和四分位数。粉葛中常量元素含量由大到小依次为K>Ca>P>Mg>Na，其必需微量元素含量呈现Zn>Cu>Mn>Mo>Co>B趋势；轻稀土元素含量呈现Ce>La>Nd>Pr>Sm趋势，稀土元素可作为产地鉴别的有效指标，因为这些元素很容易从土壤转移到植物中[18]。Na、Mn、Co、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti元素的变异系数均超过了100%，说明不同产地来源粉葛中矿质元素含量有较大的差异。

表2 粉葛中矿质元素含量

表2(续)

2.2 不同地域粉葛中矿质元素含量差异比较

由表3可知，除B、Cu外，其余矿质元素含量在不同产地间均存在不同程度的显著性差异。Duncan’s多重比较分析结果表明，不同地域粉葛矿质元素含量有其特有的指纹信息。陕西粉葛中Co、Sr、Cd、Ba、La、Ce、Pr、Nd和Sm元素含量最高；湖北粉葛中Ca和Mo含量最高；广西粉葛中Na、P、K、Zn、Rb和Ti元素含量最高。

表3 不同产地粉葛矿质元素含量差异分析

2.3 矿质元素指纹对粉葛产地鉴别分析

2.3.1 PCA分析 主成分分析属于无监督的模式，通过对变量进行降维，筛选出数据集中的主要变异指标。结果表明，前5个主成分累积方差贡献率为80.08%。为便于直观分析，选取前三个主成分得分绘制散点图，其中第一主成分(PC1)可以解释总方差变异的29.71%，第二主成分(PC2)涵盖了16.34%的样品信息，第三主成分(PC3)涵盖了13.39%的样品信息(图1)。从载荷占比情况可知，第一主成分中Mn、Co、Sr、Cd、Cs、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti载荷较大，与显著性分析中陕西粉葛样品信息相符；在第二主成分中Mg、Ca和Rb载荷较大，主要包含了湖北粉葛元素含量信息；第三主成分中P、K载荷较大，主要包含了广西粉葛元素含量信息(表4)。因此，这3个地域粉葛矿质元素分布呈现一定的规律特征。

表4 粉葛矿质元素指纹前5个主成分中各变量的特征向量及累积方差贡献率

图1 不同地域粉葛矿质元素含量前3个主成分得分散点图

2.3.2 SLDA分析 为进一步了解矿质元素指纹对粉葛产地的判别效果，对粉葛中存在显著性差异的20种矿质元素进行逐步判别分析，该判别函数采用回代检验和交叉验证两种方法进行验证。结果表明，Mg、P、Co、Rb、Sr 5种元素被引入判别模型中，回代检验和交叉验证整体判别率分别为97.7%和93.0%(表5)。利用两个判别函数得分作图，不同地域样品具有其特有的空间分布，仅有3个样品被错判(图2)。

表5 不同地域粉葛逐步判别分析分类结果

图2 不同地域粉葛样品判别函数得分图

2.3.3 HCA分析 为进一步可视化各样品经判别后所属分类，对其进行了分层聚类分析。分层聚类分析使用平方欧式距离来识别和聚类样本，属于有监督学习。由图3可知，仅有广西的1号样品被错判给湖北，13号样品被错判给陕西；湖北的7号样品被错判给广西；陕西的13样品被错判给广西。可见，矿质元素指纹结合聚类分析可有效实现对粉葛产地的区分。

图3 不同地域粉葛矿质元素含量的分层聚类分析

2.4 土壤对粉葛矿质元素指纹的影响

由表6可知，陕西和广西土壤中B、Na、Mg、P、Mn、Co、Zn、Sr、Mo、Ba存在显著性差异，陕西和湖北土壤中Cu、Zn、Sr、Co含量存在显著性差异，湖北和广西土壤中Na、P、Mo含量存在显著性差异(P<0.05)。为进一步探索土壤中矿质元素含量对粉葛中元素含量的影响，对粉葛和土壤中元素含量进行Pearson相关分析。结果表明，粉葛与其相应土壤中Rb、Sr、Ti元素含量呈极显著正相关(P<0.01)，即粉葛样品中Rb、Sr和Ti含量随土壤元素含量的升高而增加。

表6 不同地域土壤矿质元素含量差异性分析

表6(续)

3 讨论

不同地域粉葛中矿质元素含量存在差异主要是受其采样点所处地质带的影响[14]。而地质带的不同导致土壤的多样化，因此不同地域土壤性质和土壤类型是造成粉葛元素含量差异的主要因素[11,14]。陕西省采样点以棕壤和黄棕壤为主，湖北则以黄褐土和黄棕壤为主，广西采样点土壤类型属于酸紫粘土。王洁[19]和卢胜[20]研究表明，不同土壤类型的湿度、pH值、质地、腐殖质等属性不同，造成不同地域同一元素含量存在差异。本研究发现，不同地域粉葛中Mg、P、Co、Rb和Sr含量与其所在地域土壤中含量差异呈一致性。陕西粉葛中Co和Sr含量最高，广西粉葛中P和Rb含量高于其余两地。陕西和湖北粉葛中Mg含量无显著差异，但均显著高于广西粉葛，其原因在于陕西和湖北采样点地理位置相近。陕西粉葛中Co含量最高，可能与当地土壤中Co含量较高有关，Kabata-Pendias等[21]研究表明，土壤中Co的富集会导致植物中该元素含量增加。大量研究表明，Rb和Sr可作为多数植源性农产品产地溯源的有效指标。Zhao等[13]研究表明，茶叶中Rb、Sr含量与土壤中相应元素含量显著相关，本研究也表明土壤中Rb和植物中Rb含量存在相关性。Nyholma等[22]研究表明酸性土壤会抑制钾离子的吸收，促进植物中Rb的吸收。Rb作为表征土壤年代信息的主要元素[23]，常被应用于农产品的产地溯源。张龙等[23]研究表明Pb、Sr、Ba、Ga和V可作为杭白菊产地鉴别的特征指标，典则判别分析中，采用交叉验证方法进行验证，判别效果能达到97.1%。众多实例表明，Sr元素可作为多数食品产地溯源的特征指标，如Tsialtas等[24]发现Sr含量受土壤特性的影响，在具有较高交换性钙和阳离子交换能力的有机土壤中Sr含量显著低于无机土壤。本研究筛选出的Rb和Sr元素与粉葛所在地域土壤密切相关，可作为粉葛产地溯源稳定有效的指标。

此外，根据Ariyama等[25]和Qian等[26]研究表明，不同地域施肥类型、农药等栽培措施也可能对粉葛中矿质元素含量差异产生影响。广西粉葛种植地主要以施加挪威复合肥为主，而陕西、湖北两地以普通复合肥和农家肥为主。不同地域粉葛中Mg、P元素的吸收还可能与施加肥料种类和含量有关，Hejcman等[27]研究表明，肥料中的P元素含量与农产品中的P元素含量呈正相关。Qian等[26]研究表明，水稻中Co、Al和Ni元素含量受农药影响最大，故推测不同地域粉葛中Co含量差异还可能受农药的影响。

另一方面，不同地域温湿度、光照、降水量等气候条件的不同，也会导致植物中矿质元素含量不同。广西气候湿润多雨，年降水量明显高于陕西和湖北采样点，致使不同地域土壤含水量存在差异，进而影响植物对矿质元素的吸收。

根据前人研究表明，基因型、年际、产地以及三因素之间的交互作用可能对不同地域粉葛矿质元素含量也有一定的影响。Zhao等[28]和Liu等[29]采用模型试验通过多因素方差分析表明，基因型、年际、产地及其交互作用对小麦矿质元素含量有影响。本研究筛选的鉴别粉葛产地的矿质元素指标与贺媛媛等[30]研究野葛产地鉴别的B、Mg、P、Se和Sr 5种元素指标相比，Mg、P和Sr均被作为鉴别葛根产地的有效指标，但其余两种元素存在一定差异，可能是因为生产方式的不同，本研究的葛根主要为人工栽培，而野葛生长在野生环境下，受外界环境影响较大。

4 结论

本研究选用有监督的判别分析和无监督的聚类分析与矿质元素指纹相结合，在一定程度上实现了不同产地粉葛样品的分类。利用逐步判别分析筛选出Mg、P、Co、Rb和Sr 5种特征元素作为鉴别陕西、湖北和广西粉葛样品的有效指标。其中，陕西粉葛中Co和Sr含量最高，广西粉葛中P和Rb含量高于其余两地，陕西和湖北粉葛中Mg含量无显著差异，但显著高于广西粉葛。经交叉验证整体正确判别率为93.0%，表明矿质元素指纹分析对粉葛产地溯源具有可行性。后续研究可对不同年际、不同基因型粉葛样品进行分析，并进一步扩大样本数量，建立稳定有效的产地判别模型。