蒸汽爆破对红豆和绿豆多酚含量及抗氧化活性的影响

谷春梅 候春宇,3 程安玮

(1 吉林农业大学食品科学与工程学院， 吉林 长春 130118；2 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；3 山东省农业科学院农产品研究所， 山东 济南 250100)

我国豆类资源丰富，种植区域广。目前统计的豆类有上百种，现今规模种植的有20余种，其中绿豆、红豆已成为我国主要的杂粮资源。研究表明，绿豆、红豆富含生物活性成分，如黄酮类、酚酸类等物质[1-3]，有较显著的抗氧化效果，可抑制生物大分子的氧化[4]。李洪飞等[5]研究表明，绿豆中有大量的多酚物质，含量高达48.546 mg·g-1。程安玮等[6]研究发现红豆、绿豆中酚类和黄酮类物质含量丰富，有较强的抗氧化活性。李思荻[7]研究发现红豆中总酚含量达到4.341 8 mg·g-1， 且对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH)自由基及羟自由基清除能力明显高于花芸豆、白芸豆等原料。韩玲玉等[8]研究了7种杂粮的抗氧化活性，发现绿豆的抗氧化能力表现较好。Shi等[9]系统研究了我国20种绿豆中营养及活性成分，表明豆类中富含结合态和游离态酚酸以及黄酮类等功能成分，且具有一定的抗氧化活性。

植物自身组成结构为其内部有效成分的提取构筑了一道天然屏障，限制了有效成分的提取，影响溶质与溶剂的接触可及性和溶解过程以及溶剂夹带溶质通过植物结构的传质扩散过程。因此，在对有效成分提取前需对原料进行预处理，打破上述提取屏障，以达到理想的提取速度和得率。爆破加工作为一项当前新近发展起来的预处理手段，已逐渐应用到食品加工行业。该技术借用高温和高压共同作用于样品，且瞬时释压过程会促使样品的组分分离，通过与其他提取技术相结合，可达到物料在组分水平、细胞水平和组织水平的分级分离[10]。刘翀等[11]研究证明蒸汽爆破可使麦麸中游离酚酸的提取率增加50%以上，但爆破处理对红豆和绿豆中活性成分的影响还尚待研究。多酚、类黄酮作为豆类中的重要活性物质，由于原料特性、活性物质的组成及结构等不同，对高温高压等因素的敏感性不同，因此本试验选用色泽差异明显的红豆和绿豆为原料，探讨采用不同的压力和作用时间进行爆破处理，对红豆和绿豆中总酚、总黄酮的释放量及提取率的影响，通过体外DPPH、铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2-2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid, ABTS)]等试验研究爆破加工对其抗氧化活性的影响，确定量-效关系，以期探明爆破加工对食品原料中重要活性成分多酚的释放及相应抗氧化效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红豆、绿豆样品购于济南市场。福林酚试剂、没食子酸、DPPH(纯度≥98%)，上海源叶试剂公司；无水乙醇、甲醇、Na2CO3、AlCl3等为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；FRAP试剂盒、ABTS试剂盒，上海碧云天生物公司；芦丁，自提(纯度≥98%)。

1.2 仪器与设备

QBS-80爆破试验台，鹤壁正道生物能源有限公司；SB25-12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；FW177高速万能粉碎机，浙江大德仪器厂；LXJ-IIB离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司；CP413电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；Synergy HTX多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；LRH系列生化培养箱，上海恒科技有限公司；Quanta200型扫描电子显微镜，荷兰Fei公司；TENSOR27傅立叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蒸汽爆破预处理 红豆、绿豆用蒸馏水(加水量刚好没过原料)浸泡5 h后，捞出，控干水分，装于自封袋中密闭平衡水分过夜；正式蒸汽爆破之前空爆数次，保证压力的稳定性。将样品置于物料仓中，通入饱和水蒸汽，压力分别选取0.25、0.50、0.75、1.00 MPa，时间分别选取30、60、90 s，在极短的时间内释压(阀门打开时间0.008 75 s)，完成爆破处理；以未进行爆破的豆子为对照组(CK)。将处理完的豆子收集，于50℃烘干至恒重，避光保存。将不同处理的红豆和绿豆样品粉碎，过40目筛，备用。

1.3.2 微观结构观察 用导电胶将适量样品固定于样品台上，用洗耳球吹去样品表面的杂质，采用离子溅射方法镀金，立即放入电镜载物腔体内抽至真空，加高压(5 kV)[12]，然后分别用由小到大的放大倍数进行观察和拍照。

1.3.3 红外扫描图谱分析 红外扫描图谱采用溴化钾压片法。称取2 mg原料粉末与150 mg干燥的溴化钾粉末放于研钵中混合，研磨3 min后将混合物放置在硫酸纸上倒于压模中，抽真空后去压力，放于红外光谱仪内在波段400～4 000 cm-1扫描。

1.3.4 超声波辅助提法 按料液比1∶20(g·mL-1)加入50%乙醇溶液，常温下400 W超声40 min后，4 500 r·min-1离心15 min，分离上清液和沉淀。沉淀继续加入50%乙醇溶液，再次提取，合并上清液。

1.3.5 总酚含量的测定 采取福林酚法测定多酚含量[13-14]。取豆类提取液100 μL，加2 mL蒸馏水和200 μL福林酚试剂混匀，3 min后加入900 μL 20% 的Na2CO3溶液，用移液枪反复吹吸混合液，吹打均匀后避光存放2 h，测定765 nm波长处的吸光度值。以没食子酸为标品，在浓度为10～500 μg·mL-1内做标准曲线(y=0.003x+0.033 9，R2=0.997 5)，计算豆类提取液中的总多酚含量(total phenols content，TPC)。

1.3.6 总黄酮含量的测定 采用AlCl3法测定总黄酮含量[15]。取1.5 mL提取液与1.5 mL的2% AlCl3-甲醇溶液(5%乙酸)混合均匀，暗处理10 min，测定430 nm波长处的吸光值。以芦丁为标品，在浓度为10～500 μg·mL-1内做标准曲线(y=0.003 7x+0.032 8，R2=0.997 3)， 计算样品中的总黄酮含量(total flavonoids content, TFC)。

1.3.7 抗氧化活性的测定 DPPH自由基清除能力的测定[16]：取8 μL提取液，加入80 μL的DPPH(0.1 mmol·L-1)溶液，混合均匀后加入112 μL无水乙醇，室温避光放置70 min，测定517 nm波长处的吸光度值。

式中，A1为样品溶液的吸光度；A0为初始吸光度。

按照有关试剂盒说明书测定FRAP、ABTS的抗氧化活性。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 爆破加工对红豆和绿豆外观结构的影响

由图1可知，未经爆破的红豆和绿豆的表面均匀光滑，结构完整。爆破时间分别为30、60、90 s时，随着压力的不断增大，红豆和绿豆表皮颜色逐渐加深，破裂颗粒数逐渐增多，伴随着糊化现象。爆破压力为0.25 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆和绿豆的颜色逐渐加深，表皮出现褶皱。当爆破压力为0.50 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆表皮呈近黑褐色，绿豆逐渐变为浅褐色，且红豆和绿豆表皮均出现破裂。当爆破压力为0.75 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆和绿豆发生破裂，红豆表皮颜色逐渐变为黑色，绿豆变为棕褐色。当爆破压力为1.00 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆和绿豆表皮破裂颗粒数有所增加，糊化严重，甚至出现结块，产生焦糊气味。说明高压或长时间的爆破处理可能使红豆和绿豆产生不同程度的美拉德反应，导致酚类化合物、黄酮类化合物的分解损失，原料糊化现象严重，这可能与原料结构破裂的程度有关。

图1 爆破加工对红豆(A)和绿豆(B)外观的影响

2.2 爆破处理对红豆和绿豆中微观结构的影响

爆破加工过程中，原料会发生各种反应，比如原料颗粒的减少和微孔的扩张。由图2可知，未爆破的红豆和绿豆表面和整体结构完整，不利于活性成分的溶出。当爆破压力为0.25和0.50 MPa时，随着爆破时间的延长，两样品的结构受到破坏，多数变为不规则形状，在90 s时绿豆结构破裂严重。当爆破压力为0.75和1.00 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆和绿豆表面结构发生破裂，形成大量的碎片物质。这可能是由于在爆破加工过程中，红豆和绿豆结构内部会充满过热的饱和蒸汽，释压后蒸汽会使原料结构及细胞壁发生破坏，形成颗粒状物质，红豆和绿豆的表面积增大，促进原料中活性成分与溶剂的接触可及性，利于多酚类化合物的溶出。

图2 爆破加工对红豆(A)和绿豆(B)微观结构的影响(×500)

2.3 红外图谱分析

多酚类物质常见的特征键有羟基与其他基团形成的氢键、甲氧基C-H、芳烃骨架C=C和C-O键等。张叔良[17]研究发现，分子中的羟基与其他基团结合形成的氢键特征吸收峰为3 500～3 200 cm-1，由此推测红豆和绿豆羟基基团的吸收峰分别位于3 403.8 和3 426.9 cm-1(图3)。2 931.3和2 922.6 cm-1是分子中的甲氧基C-H伸缩振动的吸收峰；红豆中的1 657.5 和1 541.8 cm-1吸收峰，绿豆中的1 657.5和1 540.8 cm-1吸收峰是芳烃骨架C=C键伸缩振动吸收峰；1 394.3和1 384.7 cm-1是甲氧基C-H面内弯曲振动吸收峰；红豆中1 248.7、1 156.1 和1 059.1 cm-1，绿豆中1 238.1、1 153.2 和1 030.8 cm-1可能是C-O-C伸缩振动吸收峰。对比图中谱线后发现经过爆破加工的红豆和绿豆，无新化学结构和官能团产生。与CK相比，爆破处理组红豆在3 403.8 和2 931.3 cm-1处的吸收有所增强，爆破处理组绿豆在3 426.9 和2 922.6 cm-1处的吸收峰强度增大，这可能是由于爆破加工使原料中的分子链断裂导致羟基增多。

图3 爆破加工前后红豆(A)和绿豆(B)的红外光谱图

2.4 爆破处理对红豆和绿豆中总酚含量的影响

由图4可知，与CK相比，爆破压力和时间对原料中总酚的提取率有明显的影响，爆破后的原料中总酚含量明显增加。30 s爆破时间下，两样品中总酚的含量随着爆破压力增加呈增加趋势，至压力为1.00 MPa时其含量下降。60 s爆破时间下，绿豆中总酚含量在0.50 MPa时达到最大(4.57 mg·g-1)，随后有降低的趋势，而红豆中总酚的含量在0.75 MPa时达到最大(4.66 mg·g-1)。90 s爆破时间下，红豆中总酚含量随着爆破压力增加而升高，爆破压力增加至0.75 MPa后总酚含量有降低趋势；而绿豆在1.0 MPa压力下明显下降。总体来看，红豆中的总酚含量高于绿豆(除0.5 MPa、60 s处理组)。

图4 爆破处理对红豆、绿豆中总酚含量的影响

当爆破压力为0.25 MPa时，红豆和绿豆中总酚含量随着爆破时间的延长而增加。当爆破压力为0.50 MPa时，绿豆中总酚含量在爆破时间增至到60 s时达到最高，随后下降，红豆中总酚含量随爆破时间延长呈增加的趋势。爆破压力为0.75 MPa时，红豆中总酚含量在60 s时最高，绿豆中总酚含量随着爆破时间的延长呈下降趋势。爆破压力为1.00 MPa时，随着爆破时间的延长，红豆和绿豆中总酚含量明显下降，在90 s时两样品中多酚含量达到最低值，分别为2.48和2.22 mg·g-1，略高于CK。一般认为，谷物、豆类中的多数酚类化合物常与蛋白质、糖类、纤维素等大分子结合，导致提取不易[18]。经爆破加工后，原料的物理、化学结构发生较大变化，会产生类似酸水解、氢键断裂和结构重排等协同作用[19]，促使原料中的木质素、纤维素和半纤维素发生不同程度的降解，与大分子相结合的酚类物质得到大量释放，所以在较低的爆破压力下，总酚含量随着时间延长而不断提高。但是，酚类物质并不能随着爆破条件的提高而无限增加，红豆和绿豆中总酚含量呈现明显的先升后降的变化趋势，在1.00 MPa时，总酚含量降低明显，可能是因为高温会造成酚类物质的分解[20]，过高强度的爆破会造成酚类物质损失。

2.5 爆破处理对红豆和绿豆中总黄酮含量的影响

由图5可知，与CK相比，爆破处理组样品的总黄酮含量明显上升，0.75 MPa、60 s条件下红豆中总黄酮的含量最高(3.07 mg·g-1)，0.5 MPa、60 s条件下绿豆总黄酮含量最高(3.0 mg·g-1)，分别是CK的2.32和1.74倍。通过比较发现，各爆破处理组总黄酮含量的变化趋势与总酚含量基本一致。爆破加工可提高物料结构的多孔性，导致高渗透率和低力学强度，有利于蒸汽的有效渗入，物理作用破碎效果更明显，提高物料孔隙率和孔体积增长率，增加溶质与溶剂的接触可及性，从而增强活性成分的提取效果；由于原料自身组成结构及质地等不同，活性物质提取的最佳爆破条件也不同，但是过度的爆破处理如高压或长时间爆破可导致酚类物质的降解，也可发生美拉德反应产生褐变，甚至会引起原料基质的碳化[21-22]。

图5 爆破处理对红豆、绿豆中总黄酮含量的影响

2.6 爆破处理对红豆和绿豆提取物抗氧化能力的影响

由图6可知，爆破处理组样品的抗氧化能力均高于CK，红豆的抗氧化活性明显高于绿豆(除0.5 MPa、60 s爆破组)。在0.75 MPa、60 s条件下红豆提取物的抗氧化能力最强，而绿豆在0.50 MPa、60 s条件下最强。各爆破处理组样品的DPPH自由基清除率、FRAP还原能力、ABTS抗氧化能力的变化趋势基本与总酚、总黄酮含量一致。蒸汽爆破处理对红豆和绿豆的抗氧化成分如酚类物质的释放是有限的，达到一定的爆破强度后，样品清除DPPH自由基、清除ABTS自由基，以及样品FRAP还原能力的效果不再明显，而更高强度爆破处理可能造成抗氧化成分的损失[20]，导致样品清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力以及FRAP还原能力均有所降低。

图6 爆破处理对红豆、绿豆提取物抗氧化能力的影响

2.7 红豆和绿豆提取物与抗氧化活性之间的相关性分析

由表1可知，红豆中，总酚含量与抗氧化活性之间的r值均在0.9以上；总黄酮含量与抗氧化活性之间的r值有一定差异，其中总黄酮含量与DPPH自由基清除率之间相关性最高。绿豆中，总酚含量与抗氧化活性之间的r值有一定差异，表现为FRAP>DPPH>ABTS，但r均<0.9，明显低于红豆提取物的r值；除DPPH自由基清除率外，总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性高于红豆提取物与其的相关性，其中绿豆总黄酮的含量与ABTS自由基清除率之间的相关性最高，r为0.893。由此可知，红豆和绿豆的抗氧化能力与其总酚、总黄酮含量密切相关，抗氧化能力与总酚、总黄酮含量存在显著的相关性。

表1 原料提取物与抗氧化活性之间的相关性

3 讨论

蒸汽爆破作为一种农产品原料预处理新技术，具有类酸性水解、热降解、类机械断裂、氢键破坏以及结构重排等多种作用，可使纤维素和半纤维素的葡萄糖苷键水解，同时使半纤维素和木质素产生一些有机酸，降解为分子物质，使纤维疏松具有多孔性[23-24]。爆破加工过程中，原料会发生各种物理、化学反应，包括微孔的扩张，整体形状的变化等，结构破裂严重，形成大量的碎片物质，促进原料中活性成分与溶剂的可及接触，有利于多酚类化合物的溶出。宋洪东[25]发现爆破加工处理松针，其表面完整的结构变为多个小粒子物质，提高了黄酮类物质的提取率。本研究也验证了蒸汽爆破可通过改变绿豆和红豆的外观及微观结构，提高酚类物质的提取率。廖双泉等[26]对椰衣进行爆破加工处理，将其纤维进行红外分析，发现原料中无新结构出现，但其主要吸收峰增强，呈现纤维素的吸收，与本研究结果相一致。

影响爆破效果的主要因素有爆破压力(温度)、保留时间、原料等，由于原料性质等不同，最佳的爆破条件以及爆破效果也存在差异。Qin等[27]将爆破加工技术用于无花果叶中，0.2 MPa下爆破3 min其类黄酮提取率增加55.9%。Wang等[28]研究表明豆类在220℃下爆破120 s其总酚的提取效果最佳。籽粒苋籽实在0.6 MPa、60 s的蒸汽爆破条件下多酚的提取率最高，再增加爆破强度多酚提取率反而下降[29]。赵梦丽等[21]利用蒸汽爆破处理小麦麸皮时，在爆破压力为2.5 MPa时，可溶性总糖和游离型酚酸含量达到最大值，增加压力至3.88 MPa，二者含量呈下降趋势。这些研究结果证实，就蒸汽爆破对原料中活性物提取效果来看，不同的原料其最佳爆破参数差异性很大。本研究结果也证实了红豆、绿豆等豆类物质经过爆破处理，其酚类物质、类黄酮等成分的提取含量增加，可能是因爆破加工使原料中的分子链断裂产生的基团增多，随着爆破压力和时间的不断增大，易造成酚类物质的降解，酚类物质、类黄酮的提取率有降低趋势。红豆和绿豆分别在0.75 MPa、60 s和0.50 MPa、60 s的爆破条件下，酚类物质的提取率达到最高。

已有研究证实多酚、类黄酮等成分有较强的抗氧化能力。阚丽娇[30]发现，26种芸豆中总酚含量与FRAP还原能力存在正相关性。任顺成等[31]发现15种豆类有较明显的抗氧化效果。Amarowicz等[32]发现红豆中多酚类物质含量丰富，并分别用β-胡萝卜素亚油酸体系法、总抗氧化活性法、DPPH法证实，豆类提取物中的酚类物质表现出明显的抗氧化效果。孙丹等[18]和袁佐云等[33]的研究也得出类似的结论，表明样品中的多酚、类黄酮等成分是发挥其抗氧化活性的重要成分。爆破加工对原料中多酚、类黄酮等物质的提取率具有明显的影响，而提取物的抗氧化效果也产生了一定的变化，Gong等[34]证明爆破后青稞麸皮的ABTS清除能力从326提高到2 983 TEAC mg·100 g-1DW；刘翀等[11]研究表明，爆破处理麦麸后其多酚及抗氧化活性明显上升，两者之间具有明显的相关性。本研究结果表明，爆破加工后红豆和绿豆提取物总酚、总黄酮的含量明显上升，通过DPPH、ABTS、FRAP等体外抗氧化试验证实其抗氧化能力明显增强，它们之间呈极显著正相关性。

4 结论

本研究结果表明，适当的蒸汽爆破处理是一种有效的预处理方法，可使原料的结构发生破裂，形成大量的碎片物质，爆破处理后的红豆和绿豆中无新化学结构和官能团产生，在羟基基团处的吸收峰强度增大，爆破处理后红豆和绿豆样品中总酚、总黄酮的提取率有明显的提升，爆破压力和作用时间对其有明显的影响。由于原料的质地结构及组成不同，最佳的爆破参数不同，本研究中红豆的最佳条件为0.75 MPa、60 s，绿豆的为0.50 MPa、60 s。红豆中的总酚、总黄酮的含量均高于绿豆，除0.50 MPa、60s爆破处理组。蒸汽爆破处理可以促进豆类原料中多酚、类黄酮成分的释放，其抗氧化活性也得到明显提升，呈极显著正相关。本研究结果可为爆破加工适用于不同种类生物质及有效成分的提取提供理论指导，拓展爆破加工技术在食品加工行业的应用范围。