干燥方式和粉碎程度对苹果皮全粉理化特性及酚类生物利用度的影响

马千程 易建勇 毕金峰,* 赵圆圆 吴昕烨 陈芹芹

(1 大连工业大学食品学院， 辽宁 大连 116034；2 中国农业科学院农产品加工研究所/农业农村部农产品加工重点实验室， 北京 100193)

苹果是日常膳食中酚类物质的主要来源之一。苹果中的酚类物质大部分来源于果皮，其含量是果肉的2～7倍，且抗氧化能力更强[1]，具有很高的利用价值。苹果皮是苹果深加工过程中产生的副产物，除部分应用于发酵饲料和农业堆肥外，其余均未得到有效利用，造成了资源浪费和环境污染。Alibas等[2]将微波干燥后的苹果皮添加到凉茶饮料中以丰富凉茶的香气和营养；Rupasinghe等[3]通过添加经对流热风干燥粒径为1 mm的苹果皮粉，提高了松饼中膳食纤维和总酚的含量以及抗氧化活性。因此，若将废弃的苹果皮加工成苹果皮全粉，既可以充分回收苹果皮中大量的酚类物质，提高苹果全果的综合利用率，又可以减少因处理不当而导致的环境污染。同时，苹果皮制粉后具有良好的耐储性和便携性，可作为膳食辅料满足特殊消费需求。

干燥方式和粉体粒径会显著影响果蔬粉的加工特性和营养物质溶出特性。目前苹果皮干燥应用较多的是传统热干燥方式，如热风干燥、滚筒干燥等[4-6]。但另有研究[1]表明真空冷冻干燥与热风干燥相比可以更大程度地保持物料本身的形态、色泽和营养成分；热泵干燥因可以控制空气湿度，回收热量，比热风干燥更温和、高效[7]。超微粉碎是改善粉体物理和营养特性的有效途径，通过机械力或流体动力将原料粉碎至微米级[8]，增大粉体颗粒比表面积和孔隙率等，从而改善粉体的均一性、流动性和溶解性等[9]。此外，超微粉碎还会增大细胞破碎率，使活性成分更易通过细胞膜/壁，提高其在人体小肠部位的吸收，如褚洪标等[10]研究发现，适度的微粉化(中位径为27.02 μm)可以促进厚朴粉中多酚在胃肠中的溶出。但目前尚鲜见不同粉碎程度对苹果皮粉品质影响的研究。尽管人们日常摄入的食物中含有大量酚类物质，但实际上只有少部分(0.5%～1%)能够通过人体胃肠消化过程进入小肠上皮细胞而被吸收代谢[11-12]，因此研究不同制粉方式对苹果皮全粉中酚类物质在人体消化过程中的生物利用度十分必要。

本研究通过真空冷冻干燥(vacuum freeze-drying，FD)和65℃热泵干燥(heat pump drying，HP)以及不同时间的超微粉碎制备苹果皮全粉，全面探究不同制粉方式对苹果皮全粉粒径、色泽、微观结构和粉体行为特性(压缩性、容积密度和流动性)的影响，并利用体外模拟胃肠消化模型，探讨加工后苹果皮全粉中酚类物质的生物利用度，旨在为苹果皮制粉加工和新产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用山东富士苹果，购买于北京清河小营市场，贮藏于4℃冷库。

胃蛋白酶(≥250 U·mg-1)、胰蛋白酶(8×USP)、福林酚试剂，美国Sigma公司；氯化钠、碳酸氢钠、无水乙醇、浓盐酸、猪胆盐，国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，美国Thermo Fisher试剂公司；没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸、金丝桃苷、芦丁、根皮苷等标准品、10 kDa透析袋，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Alpha1-4Lplus真空冷冻干燥设备，德国Christ公司；ZWH-KFY-BT4I/HG闭环除湿热泵干燥机，东莞正旭新能源科技有限公司；DE-100万能高速粉碎机，衢州普润日用品有限公司；KCW-10超微粉碎振动磨，北京锟捷玉诚机械设备有限公司；S3500激光粒度分析仪，美国Microtrac公司；CM-700D1手持分光色差仪，日本Konica Minolta公司；S-570扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；FT4多功能粉末分析仪，英国Freeman Technology公司；UV1800紫外分光光度计，日本岛津公司，Waters-1525高效液相色谱，美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 苹果皮全粉制备 取新鲜无伤病的苹果，清水轻洗，手工削皮，获得厚度约3 mm有果肉附着的苹果皮，随后立即进行干燥，直至果皮干基水分含量低于0.06 g·g-1。

FD：将果皮置于干燥托盘，于-80℃预冻12 h后，放入冻干机中。设置真空度0.01 kPa，冷阱温度-55℃， 托盘温度25℃，干燥时间约48 h。

HP：干燥温度65℃，湿度12%，风速2.0 m·s-1, 干燥时间2 h。

利用高速粉碎机将干燥的苹果皮粗粉碎，打粉15 s，间歇15 s，重复3次后，过20目筛，得到苹果皮粗粉样品FD-c和HP-c；利用振动磨将苹果皮粗粉超微粉碎5和25 min，分别过100目和200目筛，得到样品FD-5、HP-5、FD-25和HP-25，密封保存在干燥器中，尽快测定其物理指标，随后保存于-20℃，用于测定酚类物质。

1.3.2 粒径分布的测定 通过激光粒度分析仪测定苹果皮全粉的粒径分布情况并计算粒径分布的离散度[13]。

(1)

式中，D10、D50和D90分别表示10%、50%和90%的粉体可以通过的粒径大小。

1.3.3 微观结构的测定 将待测样品分散固定于粘有导电胶的载物台上，通过离子溅射仪对样品表面喷金，将其置于扫描电子显微镜下，在600倍和3 000倍下观测粉体的微观形态[14]。

1.3.4 色泽测定 利用手持色差计，经黑白板校正后，对样品池中的粉体进行色泽测定，记录明度指数L*、色品指数a*和b*，L*值越大，亮度越大；a*值越大，颜色越红；b*值越大，颜色越黄。

1.3.5 容积密度、压缩性和流动性测定 采用多功能粉末分析仪测定苹果皮全粉的行为特征参数[15]。将样品填满25 mL规模的玻璃杯，测试前设备自动对样品进行一次预处理以消除粉体颗粒间的残余应力和空气。选用Compressibility模式测定粉体容积密度和压缩性，其中螺旋搅拌角度5°，搅拌速度40 mm·s-1，压力参数6 kPa，压力时间1 min。选用Flowability模式测定粉体流动性，测定搅拌速度为10、40、70、100 mm·s-1，得到的BFE(basic flowability energy)值为粉体基本流动能，表示粉体流动时所需外界提供的能量。

1.3.6 酚类物质提取 准确称取0.3 g样品粉于50 mL离心管中，加入10 mL 80%甲醇，室温下避光超声1 h，然后于11 000 r·min-1离心10 min，取上清液，沉淀物中再加入10 mL 80%甲醇，重复操作2次，合并3次的上清液，用80%甲醇定容至30 mL，得到消化前的酚类物质提取液(undigested samples, US)，于4℃冰箱保存待测。

1.3.7 体外模拟胃肠消化 参考Bouayed等[16]的方法。

胃消化：取0.3 g苹果皮全粉于50 mL锥形瓶中，加入7.5 mL 9 mg·mL-1氯化钠溶液，1.2 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液和0.6 mL活性胃蛋白酶溶液，调节pH值至2.0，于37℃、100 r·min-1水浴振荡1 h。一份离心取上清液，定容至20 mL，即为胃消化提取液(gastric digestion samples，GS)，在-20℃保存待用；另一份继续进行小肠消化。

小肠消化：用9 mg·mL-1氯化钠溶液冲洗透析袋内外，一端用棉线系紧，按1∶1的体积比在透析袋中加入9 mg·mL-1氯化钠溶液和0.5 mol·L-1碳酸氢钠溶液，系紧另一端，浸没在上述胃消化提取液中，于37℃、100 r·min-1水浴振荡45 min，此时锥形瓶中溶液的pH值应为6.5～7.0。继续加入2.7 mL活性胰酶-胆汁混合液(2 mg·mL-1胰液和12 mg·mL-1胆汁提取物溶解于0.1 mol·L-1碳酸氢钠)于锥形瓶中，调节pH值为7.0～7.5，于37℃、55 r·min-1水浴振荡2 h。消化完成，取出透析袋，将透析袋内液体定容至5 mL，即为可透析酚溶液(dialysis samples, DS)；剩余液体离心取上清液，定容至20 mL，即为小肠消化提取液(intestinal digestion samples, IS)，保存于-20℃。另设空白组(不加食物基质)，消化过程与样品条件一样。

根据公式计算酚类物质的生物利用度[17]：

(2)

式中，BA为酚类物质的生物利用度，%；BCdialysed为所透析酚溶液中的酚类物质的含量，μg·g-1；BCnon-digested为消化前酚类物质提取液中酚类物质的含量，μg·g-1。

1.3.8 酚类物质测定 采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法，将各单酚标准品、US、GS、IS和DS经0.45 μm微孔滤膜过滤后分别上机进行梯度洗脱。色谱条件：Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为2%乙酸，B相为甲醇；柱温：35℃；全波长检测；流速：1.0 mL·min-1；进样量: 10 μL。根据各单酚标准品的出峰时间和出峰面积对照样品中的酚类物质进行定性定量。

1.4 数据统计与分析

每组样品至少进行3次测定，采用Excel 2007软件进行数据处理，Origin 8.5软件进行绘图，SPSS Statistics 20软件进行方差分析，试验结果均以干基表示。

2 结果与分析

2.1 粒径分布

通常将粒径小于25 μm的粉末定义为超微粉[18]。由表1可知，不同干燥方式对同一粉碎时间的粉体粒径分布无显著影响。粉碎时间越长，粉体粒径越小，其中，FD-25和HP-25粉体的D50分别为24.95和25.04 μm，其粒径均显著小于粗粉，说明这两种样品中至少有50%粉体达到了超微粉级别。离散度可以反映超微粉碎的效果，其数值越小，粉体越均一，分散性和溶解性越好[19]。与粗粉相比，超微粉碎苹果全皮粉的离散度显著下降，但不同超微粉碎时间对粉体的离散度无显著影响。

表1 不同制粉方式苹果全皮粉粉体粒径分布

2.2 微观结构

由图1可知，在同等放大倍数下，苹果皮粗粉颗粒较大，其中FD粗粉颗粒的形状比HP完整，而HP粗粉颗粒的形状多为不规则的厚片状。经超微粉碎后，粉体颗粒的大小明显减小，随着振动磨的冲击和研磨，部分颗粒趋于球状，表面趋于光滑。此外，3种不同粒径的粉体中均出现了团聚现象，但图像中未发现粉体粒径大小与团聚程度之间的关系。

2.3 色泽变化

色泽作为判断果粉质量最直观的指标，影响着果粉作为功能性食品辅料的使用范围。如表2所示，不同粉碎时间对苹果皮全粉的色泽影响显著，与两种粗粉相比，超微粉碎后的苹果皮全粉L*和a*值变大，b*值变小，说明其粉体亮度增加，红色变深，黄色变浅，苹果皮全粉整体由肉色趋于浅粉色，与图2所示相符。这可能是由于苹果皮中纤维含量较多，与果肉相比不容易被轻易磨碎，因此随着碾磨、剪切和冲击等机械力的持续作用，红色的果皮被进一步粉碎混匀，致使果粉呈现趋于浅粉色的状态。

图2 不同粒径苹果皮全粉外观图

表2 不同粒径苹果皮全粉的色泽变化

2.4 粉体特性

FT4多功能粉末分析仪测定粉体行为特性有别于休止角、卡尔指数等静态表征的方法，其可模拟不同加工过程和实际应用中的不同环境，具有动态表征技术[20]。

2.4.1 流动性 粉体的流动性对加工过程各操作单元及成品品质均有影响。BFE值越低，代表粉体流动性能越好[21]。由图3可知，FD-c和HP-c的粉体流动性相对稳定，随着超微粉碎时间的延长，FD与HP苹果皮全粉的BFE值呈现不同变化趋势，但未发现粉体粒径与流动性之间的关联性，这与左力旭等[15]和张明等[22]的粉体粒径越小，其流动性越差的结论不同，可能是因为超微粉碎使粉体颗粒性质变得不稳定，加剧了团聚现象的发生，从而影响了流动性。在相同超微粉碎时间下，不同干燥方式的苹果皮全粉表现出不同的流动性，其中FD-5粉体BFE值最小，在所有粉体样品中流动性最好，FD-25粉体的流动性最差，而HP-5和HP-25粉体的流动性趋势与对应的FD粉体相反。

注：10、40、70、100表示不同的测试速度。

2.4.2 容积密度和压缩性 容积密度是指单位体积内粉体颗粒的质量，它与粉体的压缩性成反比。由图4可知，与粗粉相比，同一干燥方式下超微粉碎后的苹果皮全粉容积密度显著增加，压缩性显著降低，其中FD-25和HP-25粉体的容积密度分别是其粗粉的1.16和1.14倍，其压缩性分别是其粗粉的77.43%和72.76%。而超微粉碎5与25 min的粉体之间在压缩性方面差异不显著。此外，FD苹果皮全粉的容积密度小于HP粉，压缩性大于HP粉。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 体外模拟消化对苹果皮全粉单酚组成的影响

根据标品的出峰时间和出峰面积，确定不同制粉方式的苹果皮全粉在消化前后，其可溶性多酚的组分和含量的变化如表3所示。在消化前的US中检测到的芦丁和绿原酸是苹果皮全粉中含量最丰富的2种酚类物质，芦丁在HP-c中的含量最高(1 888.35 μg·g-1)， 绿原酸在FD-c中含量最高(1 053.57 μg·g-1)。在相同粉碎时间下，HP样品中绿原酸和表儿茶素的含量低于FD；除超微粉碎25 min的粉体外，HP样品中金丝桃苷和芦丁的含量显著高于FD，在相同干燥方式下，绿原酸和表儿茶素的含量随着粉碎时间的延长而降低。

表3 苹果皮全粉体外模拟消化前后酚类物质组成变化

经胃消化后，样品中的芦丁含量升高，达到了消化前的1.05～1.47倍，同时4种酚类物质含量下降，其降解程度按降次排序分别为表儿茶素(30.50%～34.08%)、根皮苷(22.36%～32.94%)、金丝桃苷(12.48%～21.58%)和绿原酸(10.53%～15.94%)。此外，在GS中还检测出新的酚类物质——儿茶素，其含量为142.41～165.48 μg·g-1。经小肠消化后，儿茶素含量增加了2.00～2.34倍，而其他酚类物质在肠消化中的降解程度明显高于胃部消化，其中表儿茶素降解完全，除FD-c与FD-5粉体外，其余样品中的绿原酸也降解完全，金丝桃苷、芦丁和根皮苷与消化前相比分别降解了约41.45%、76.37%和44.95%。这与酚类物质的结构特征有关。

与IS中酚类物质的含量相比，透析过程导致儿茶素、金丝桃苷、芦丁和根皮苷分别损失了43.07%～57.34%，37.36%～58.55%，14.67%～43.39%，17.99%～33.94%。在DS中得到的可透过小肠上皮细胞的酚类物质含量与消化前(US)酚类物质含量的比值乘以100%即为该物质的生物利用度，它取决于酚类物质的结构特性、与其他成分(如蛋白质和多糖)的相互作用以及其从食物基质中的释放量[11,23]。由表4可知，酚类物质生物利用度按降次排序分别是儿茶素(202.94%～282.90%)、根皮苷(39.18%～42.96%)、金丝桃苷(27.16%～33.07%)和芦丁(15.18%～24.68%)。

表4 苹果皮全粉中主要酚类物质生物利用度

3 讨论

本研究将加工副产物苹果皮先后经不同干燥方式和不同程度的超微粉碎制备成苹果皮全粉，结果表明干燥方式和粉碎程度对苹果皮全粉的粉体特性和酚类物质含量有不同程度的影响，但与胃肠消化后酚类物质生物利用度之间的规律性不明显。

本研究还发现，苹果皮经干燥粉碎后产生了团聚现象，这是因为粉体粒径变小，颗粒比表面积变大，使得颗粒间的表面聚合力和吸附性增大，需要通过团聚使粉体保持稳定[24]，这也是比表面积更大的厚片状的HP粗粉团聚现象更严重的原因。同时，超微粉碎会使苹果皮细胞中的糖分大量溶出，导致粉体颗粒之间的黏结[25]，加剧了团聚现象的发生。团聚会使粉体小颗粒聚成“大颗粒”[9]，可能造成粉体粒径和离散度的测量范围比实际更大。此外，团聚现象也影响了粉体流动性的测定，如FD-5和HP-25，这两种粉体中可能产生了因团聚形成的“大颗粒”，或者超微粉碎后增加的细粉充当了大颗粒之间的润滑剂，导致出现“滚珠效应”[26]，使其流动性的测定变得不稳定。

超微粉碎还会使粉体颗粒形状趋于规则，表面趋于光滑，而这些小颗粒更易填充粉体中的孔隙，导致孔隙减少，粉体压缩性减小。此外，FD苹果皮全粉的容积密度略小于HP，这与周葵等[27]和李珂昕等[28]的结论一致，可能是由于不同干燥方式影响了粉体颗粒的质地，FD的苹果皮细胞结构较为完整，孔壁更薄，使粉体整体质地较为疏松，而HP苹果皮的细胞结构发生塌陷，形成褶皱，导致其粉体颗粒更紧实致密。

干燥方式和粉碎程度对苹果皮全粉中酚类物质的含量有一定的影响，这是因为不同单酚的热敏感性不同，绿原酸和表儿茶素遇热更易氧化分解[29-30]，而芦丁、金丝桃苷和根皮苷在65℃条件下相对稳定[31]。同样，超微粉碎会使研磨腔中的温度急速升高，导致绿原酸和表儿茶素流失[17]。在模拟胃消化过程中，胃的蠕动作用以及低pH值环境促进了芦丁从苹果基质中的释放[16,32]，而其他酚类物质含量的降低可能由于其未完全释放或已发生降解，或可能与环境中的胃蛋白酶相结合[33]。此外，胃消化过程中产生的儿茶素可能来源于苹果皮中的原花青素B2，它在酸性的胃环境中会分解成儿茶素和表儿茶素[34]。在小肠消化过程中，大部分酚类物质都发生了更大程度的降解[33]，其中酚酸类物质在弱碱性的肠液中比黄酮类更加不稳定[11,35]，同时，表儿茶素向儿茶素差向异构化[36]，而儿茶素在肠环境中较为稳定，从而导致了绿原酸、表儿茶素的完全降解和儿茶素的增加，这与Kahle等[34]和Gayoso等[37]的研究结果一致。在透析过程中，仍存在未被酶解的黄酮苷，以及由可溶性游离单酚与消化酶结合成的大分子复合物，由于其无法透过半透膜[15]而造成损失。在DS中检测出的儿茶素、金丝桃苷、芦丁和根皮苷均属于黄酮及其糖苷类，这与Gião等[38]的研究结果相似。这4种单酚在透析膜两侧形成被动扩散，最终到达结肠被微生物所利用。

4 结论

本研究采用真空冷冻干燥和65℃热泵干燥，再经不同时间的超微粉碎制备苹果皮全粉，探究不同制粉方式对苹果皮全粉的粒径分布、色泽、微观结构、流动性、容积密度和压缩性以及体外模拟胃肠消化过程中酚类物质生物利用度的影响。结果表明，超微粉碎可显著减小苹果皮全粉的粉体粒径，使粉体颗粒形状趋于规则、表面趋于光滑，同时改善粉体色泽。与粗粉碎相比，超微粉碎可使粉体容积密度增大、压缩性显著降低，便于贮存、运输。但超微粉碎5和25 min对粉体压缩性的影响并不显著，且超微粉碎导致粉体性质变得不稳定，影响了粉体的流动性。此外，真空冷冻干燥加剧了苹果皮全粉中金丝桃苷、芦丁和根皮苷的降解，热泵干燥和超微粉碎加剧了绿原酸和表儿茶素的降解。苹果皮中酚类物质在胃消化阶段相对稳定，主要降解发生在小肠消化阶段，经透析后，只有儿茶素、金丝桃苷、芦丁和根皮苷这4种单酚可进一步被吸收利用，最终发现HP-5粉体的酚类物质生物利用度总体较高。考虑到苹果皮全粉物理性质的稳定性和酚类物质的生物利用度，65℃热泵干燥联合5 min超微粉碎是制备高品质苹果皮全粉的工艺手段，可有效提高副产物苹果皮的利用价值，在膳食补充剂等方面具有良好的应用前景。