独行菜LaBBX基因低温表达响应与密码子偏性分析

周 茜 陈 芸 王玉州 王继莲 凯迪日耶·玉苏普 赵惠新

(1 喀什大学生命与地理科学学院/叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，新疆 喀什 844006；2 新疆师范大学生命科学学院/新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室/干旱区植物逆境生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)类转录因子广泛存在于植物中，有含锌离子构成的锌指结构域，在调控植物生长发育及逆境响应等方面发挥重要的作用[1]。其中，BBX是一类含B-box结构域的锌指转录因子蛋白，通过调控基因转录，参与植物生长代谢、信号转导和逆境响应；如苹果(Malusdomestica)BBX类转录因子MdBBX10基因，在拟南芥中过表达该基因使转基因拟南芥具有抗干旱和耐盐等特性[2-3]。水稻(Oryzasativa)BBX类转录因子OsCOIN，使过表达的水稻株系具有抗寒、耐盐和抗干旱等特性[4]。菊花(Dendranthemamorifolium)CmBBX24和CmBBX22基因，能够响应低温、干旱等胁迫过程[5-6]。另外，高盐和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)处理能够诱导马铃薯(SolanumtubersumL.)中SsBBX24基因的表达和蛋白积累，且日照时间长短还能调控SsBBX24对盐胁迫的响应[7]。虽然目前BBX类的转录因子在植物生长发育、抗逆境胁迫等方面有了一定研究，但该类转录因子的调控机理复杂，不同植物的不同BBX类转录因子功能不同，还需要更加深入研究。

密码子是遗传信息从DNA到蛋白质准确传递的枢纽[8-9]。密码子偏性是物种进化过程中，受环境等因素影响，使原本随机选用的密码子，形成了选择偏性，特定地选用某一密码子。密码子偏性的存在，导致基因的碱基组成和基因表达水平受影响[10]。优先被使用的密码子数量越多，越有利于基因表达[11]。评价密码子使用偏好性的参数主要有有效密码子数(effective number of codons，ENc)、同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)、密码子适应指数(codon adaptation index，CAI)和不同位置GC含量等[10]。密码子偏好性分析能为特定基因的功能预测[12]、进化水平[13]和表达调控机制[14]等提供重要参考。近年密码子使用偏性在许多植物中均有报道，但鲜见独行菜(Lepidiumapetalum)BBX类转录因子密码子偏性的相关研究。

早春短命植物独行菜分布广泛，能够在早春低温环境中萌发生长，有较强的低温耐受性[15]。独行菜的种子又名北葶苈子，是具有止咳、强心、消肿等药效的重要中药材。目前独行菜的研究多集中于药用开发等方面[16]，在其种子低温萌发特性[17]、幼苗生长耐受低温机制[18]等有一些相关研究，但其调控机制仍不清楚。本研究前期已经完成了独行菜种子低温萌发的转录组测序工作，获得了大量关于BBX类转录因子的转录组序列信息[19]。本研究对独行菜低温萌发前后的转录组信息进行比对，选择克隆与植物低温耐受性相关的LaBBX基因，探讨独行菜幼苗中该基因表达对低温胁迫的响应，并通过其密码子偏性分析，以期为研究BBX类转录因子在独行菜种子低温萌发生长的分子调控机制和LaBBX基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

独行菜种子采自乌鲁木齐鲤鱼山，由新疆师范大学生命科学学院赵惠新教授鉴定为独行菜(Lepidiumapetalum)。以其种子萌发的幼苗作为材料，干种子置于4℃干燥保存。

1.2 独行菜LaBBX基因cDNA的全长克隆

独行菜种子4℃低温处理10 d，于25℃放置1 h后，液氮研磨使用Trizol试剂提取总RNA。根据转录组测序结果，选取BBX类转录因子中上调表达较高的转录本序列c16697_g1。根据BBX基因同源性较高的cDNA全长序列设计引物(BBX-P1:5′-A T G A A G A T W C A A T G T G A T G T G TG-3′和B-box-P2:5′-T A G T T T A G C C T A G G T C Y G G G AC-3′)。以2 μL cDNA为模板，25 μL Taq PCR Master Mix(北京天根公司)，正反引物各2 μL，ddH2O补足总体积为50 μL进行扩增，扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性45 s，54.5℃退火50 s，72℃延伸50 s，28个循环；72℃延伸10 min；置于4℃保存。

1.3 LaBBX基因的生物信息学分析

将测出的cDNA序列拼接后，经BLAST比对分析；利用ProtParam在线预测蛋白质基本信息；使用SOPMA和SWISS-MODEL进行二级结构预测和三维建模；利用WoLFPSORT和TMHMM进行亚细胞定位预测和推测是否跨膜[20]。

1.4 LaBBX基因的表达分析

取独行菜种子在25℃下培养10 d，于4℃低温下分别处理0、6、12和24 h后，提取幼苗的总RNA，进行反转录。以独行菜Actin作为内参基因设计实时荧光定量(real-time quantitative，qRT-PCR)引物(qActin-F：5′-C C A A A G G C C A A C A G A G A G A A G AT-3′和qActin-R：5′-T G A G A C A C A C C A T C A C C A G A AT-3′)。根据克隆获得的LaBBX基因cDNA序列，设计qRT-PCR引物(BBX-GSP-F：5′-A T G T T G T G C C G A T G A A G C TG-3′和BBX-GSP-R：5′-A T G T C G C A G G G A G G G A A T TT-3′)。采用qRT-PCR技术，测定不同处理条件下LaBBX基因表达量。

1.5 LaBBX基因的密码子偏性分析

从GenBank中获取拟南芥等25种BBX基因的序列信息(表1)。

大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Sacharomycescerevisiae)、拟南芥和烟草等模式生物的基因组密码子使用偏性数据，下载自Codon Usage Database网站。使用相关软件对26种植物BBX基因的密码子使用频率等相关数据进行计算[21-22]。将所得的数据采用Excel及SPSS软件处理，对BBX基因的密码子成分相关性、ENc、PR2(PR2-bias plot analysis)和中性进行运算分析。采用SPSS 19.0软件分析26种BBX基因相应密码子的RSCU值，采用Ward算法按照使用偏性对物种进行聚类，用欧氏平方距离表示基因间的进化距离[23]。将26个基因构建编码序列(coding sequence, CDS)，采用邻接法利用MEGA 5.0构建不同物种BBX基因的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 独行菜LaBBX基因cDNA全长克隆

提取独行菜总RNA后，经琼脂糖检测，RNA条带清晰质量较好(图1-A)。反转录后，通过PCR扩增获得长度约为750 bp的条带(图1-B)。对目的条带片段进行回收，连接到载体pMD19-T上进行测序，得到734 bp序列片段，序列开放阅读框(open reading frame, ORF)长度729 bp，编码242个氨基酸(图2)。测序结果与转录组数据一致，将其CDS序列与25个物种的BBX基因构建系统进化树，如图3，在进化树上该基因与拟南芥BBX基因的亲缘关系最近，功能上可能也类似。因此，命名为LaBBX，获得GenBank登录号为：MT886449。

2.2 LaBBX基因的生物信息学分析

独行菜LaBBX基因的序列信息如图2，LaBBX蛋白质分子量为61.66 kDa，理论等电点pI为5.09；总原子数3 724个，蛋白质分子式为C1173H1832N330O374S15；不稳定系数为43.71，属于不稳定蛋白；含酸性氨基酸38个，碱性氨基酸25个；半衰期为30 h；脂溶指数73.84，总平均亲水性的数值为-0.479，属于酸性亲水的不稳定蛋白。

表1 BBX基因编码区序列

注：A：独行菜总RNA电泳图，M为Maker Trans 2K Plus，1～4为独行菜种子总RNA；B：LaBBX基因PCR扩增电泳图，M为DNA Marker 2 000，1～2为LaBBX PCR产物。

图2 LaBBX基因的cDNA序列和推定的氨基酸序列

图3 BBX基因CDS序列系统聚类分析

LaBBX蛋白预测无信号肽，对独行菜LaBBX结构域进行分析(图4)，其含2个B-box锌指蛋白结构域，分别存在于4～47和52～99氨基酸残基之间。对LaBBX蛋白的二级结构进行分析(图5)，其二级结构由23.55%的α-螺旋、16.12%的延伸链、1.65%的β-转角和58.68%的无规卷曲组成。LaBBX蛋白的三级结构预测如图6，并对其构建了三维蛋白模型。独行菜LaBBX蛋白质不具有跨膜区，不是膜结合蛋白，亚细胞定位预测中LaBBX蛋白可能主要存在于细胞核中。推测LaBBX蛋白作为转录因子蛋白可能主要在细胞核发挥功能，这为后续蛋白质的功能分析提供了参考依据，但要明确该蛋白质的亚细胞定位仍需后续试验验证。

图4 LaBBX结构域分析

注：蓝色: α-螺旋; 紫色: 无规则卷曲; 绿色: β-折叠; 红色: 伸展链；图中数字代表蛋白质氨基酸序列的不同位点。

图6 LaBBX蛋白三级结构预测

2.3 独行菜幼苗LaBBX基因表达对低温胁迫的响应

利用qRT-PCR分析LaBBX基因在独行菜幼苗期低温处理下的表达量。结果表明，4℃低温胁迫处理后独行菜幼苗中LaBBX基因的表达量迅速升高。低温处理6 h后，上调表达量约为未处理的21倍，且在24 h内一直维持在较高的水平(图7)。这表明LaBBX基因上调表达可以迅速响应低温胁迫。其可能作为上游转录调控元件，对低温迅速响应，使得下游的相关基因及时表达，使植物体能够迅速启动耐低温机制，防止低温胁迫对植物幼苗造成的伤害。

注：不同小写字母表示不同处理间表达差异显著(P<0.05)。

2.4 独行菜LaBBX基因密码子偏好性分析

2.4.1 独行菜LaBBX基因密码子相关分析 ENc是有效密码子数，取值在20～61之间，越接近20，表明氨基酸选取密码子越偏向少数特定密码子，则偏好程度越高；其值越大，表明编码氨基酸时越多的密码子被选用，甚至某些不常用的密码子也会被选用，偏好程度较低[24]。由表2可知，独行菜LaBBX基因的ENc值为55.453，表明其翻译中密码子选用偏好性弱。密码子的GC1、GC2、GC3、GC含量分别为58.02%、40.33%、41.98%和46.78%，表明大多密码子偏好使用AT并选用AT结尾。密码子适用指数CAI值的范围在0～1之间，越小表明偏好性越弱。LaBBX基因的CAI值为0.244，也体现出密码子的选用偏好性弱。

表2 LaBBX基因密码子使用偏性相关参数

RSCU值为某一密码子选用频率与同义密码子无选用偏性的比值，能够体现某一密码子偏性的强弱。当RSCU值为1，编码特定氨基酸选用的密码子是随机的；RSCU值>1时，编码氨基酸偏向于选用特定的密码子；RSCU值<1时，不偏向于特定密码子[25]。采用CodonW对独行菜LaBBX基因的RSCU值进行计算(图8)，RSCU值>1.5的有8个，RSCU值>1的有25个。编码亮氨酸的密码子中，CTA、CTC、CTG、TTG和TTA的RSCU值分别为1.30、0.78、0.00、0.52和0.26，而CTT的RSCU值为3.13，其偏好性最强。密码子GCT、ACT和GTT的RSCU值均大于2，体现出较高的使用偏性。CGG和CTG的RSCU值为0，表明其在基因编码时不被选用。其余RSCU值小于1的密码子，被选择使用的频率低。由于CTT、GCT、ACT和GTT在同义密码子中选用频率较高，导致ENc值小于61。

注：图中数字表示同义密码子相对使用度(RSCU)；下划线表示独行菜LaBBX基因对该密码子使用频率较高。

2.4.2 不同物种BBX基因的聚类分析 RSCU聚类分析发现(图9)26个物种聚为两大类。第一大类由8种十字花科植物，3种茄科植物，2种豆科植物等组成；其中，7种十字花科植物，3种茄科植物，2种豆科植物，各归为一小类。第二大类由5种单子叶禾本科植物聚类而成；其中，十字花科的甘蓝与苹果和大豆聚为一小支，而苹果未与同属蔷薇科的珠美海棠聚为小支，同属豆科的紫花苜蓿也未与大豆聚为小支。禾本科的单子叶植物玉米与麻雀花聚为一小支；同属蔷薇科的草莓和苹果并没有聚在一支。可见RSCU系统聚类中，密码子使用频率相近的物种其亲缘可能较近，也可能较远。因此物种亲缘关系与密码子使用偏性有时不存在相关性，体现出BBX基因密码子选用偏好的丰富性。

图9 BBX基因密码子使用偏性聚类分析

与26个物种BBX基因的CDS序列聚类结果相比(图3)，RSCU聚类结果有所不同。十字花科的独行菜和亲缘关系最近的拟南芥先聚成一小支，又与其他十字花科植物聚为一小类。综合分析聚类结果，CDS序列聚类分析结果更接近传统的物种亲缘关系分类，而RSCU聚类分析仅能在密码子使用偏性上体现物种的特殊进化规律。

2.4.3 不同BBX基因的中性分析 对26个BBX基因的各GC含量和ENc进行Pearson相关分析，发现GC、GC1、CG2和CG3互为极显著正相关性(P<0.01)，表明不同物种BBX基因碱基组成相似(表3)。如图10的中性分析，GC3值在0.323 7～0.938 2之间，GC12的范围为0.465 8～0.587 6，多数BBX基因于回归线左右分布，波动范围较小。GC3和GC12的极显著相关系数为0.957(P<0.01)，线性回归系数为0.916 25，表明不同BBX基因的密码子存在选择偏好性，受突变压力的影响[26-29]。独行菜LaBBX基因位于回归线上，与双子叶植物分布的位点相近，与聚类分析结果相一致。

表3 BBX基因密码子成分相关性分析

图10 BBX相关基因密码子使用偏好中性绘图

2.4.4 不同物种BBX基因ENc和PR2分析 ENc值与GC3s值绘制的期望曲线，基因位点分布越近，基因选择偏性受碱基突变影响大，反之，受自然选择等其他因素影响较大[30-31]。不同物种BBX基因分析结果显示(图11)，小麦、花毛竹、甘蓝、萝卜和马蹄笋的基因位点在曲线上，表明基因突变是其密码子具有选用偏好性的主要因素[32]。独行菜、拟南芥、苹果和马铃薯等11个物种分布在曲线上面，其余10个物种分布在曲线下面，表明这些BBX基因密码子偏性选择，除受碱基突变影响以外，主要受自然选择表达量和基因长度等因素的影响。

图11 BBX相关基因的ENc-plot分布

如果PR2分析中基因位点均匀分布在坐标轴中心，说明4种碱基使用的频率一致，其密码子偏好性主要受碱基突变影响，若偏离中心位置说明受其他因素影响[33]。由图12可知，G3/(G3+C3)或A3/(A3+T3)值不位于0.5左右。横坐标的值显示，大多数位点小于0.5，表明BBX基因密码子在选用G与C时，偏向于碱基C结尾。纵坐标上的值均小于0.5，说明BBX基因在碱基A和T选择上，偏向于T结尾。当PR2分析的值都偏于0.5时，表明密码子在碱基选择时，会受自然选择等其他压力因素的影响[33]。

注：A3、T3、G3、C3分别表示密码子第三位上碱基的含量。

2.4.5 独行菜LaBBX基因受体系统的选择 独行菜遗传转化体系尚未完善，还需借助遗传转化体系完善的物种作为基因的表达受体系统。将独行菜LaBBX基因与大肠杆菌、酵母菌和拟南芥等6个物种的基因组密码子选用频率比值进行计算(表4)。物种间同一密码子使用频率比的范围如在0.5～2.0之间，表明物种间在使用该密码子时偏好程度差异小[34]；如≤0.5或≥2.0时，表明物种间密码子选用该密码子时偏好程度差异大[26]。独行菜LaBBX基因与大肠杆菌密码子频率比值差异明显的有25个，酵母菌有24个，表明酵母菌更适合独行菜LaBBX基因的异源表达。独行菜LaBBX基因与拟南芥、烟草、番茄和玉米密码子使用频率差异较大的个数，分别为20、20、24和22，表明烟草和拟南芥均能作为独行菜LaBBX基因功能验证的异源受体，且拟南芥与独行菜物种亲缘较近，也可能是其瞬时表达最佳的受体。

表4 独行菜LaBBX基因与部分模式生物基因组密码子使用偏性比较

3 讨论

锌指蛋白除了能够与DNA和RNA结合外，还能够与自身或者其他锌指蛋白结合，并能够识别DNA-RNA双链分子，不仅在转录水平上起重要的调控作用，在翻译水平上也起着调控基因表达的作用。BBX类转录因子在克隆和组织表达特异性等有较多报道，但在抗逆境胁迫方面研究甚少[35]。独行菜作为典型的早春短命植物，具有较强的耐受低温能力，究其原因，是因为受低温胁迫后显著上调表达的转录因子可能在其低温萌发生长过程中起重要的调控作用[36-37]。

本研究克隆获得在独行菜受低温胁迫后显著上调的BBX类转录因子基因LaBBX，编码序列全长729 bp，含242个氨基酸。生物信息学分析表明，其含2个转录和翻译调控相关的重要功能结构域：B-box锌指蛋白结构域，且LaBBX蛋白可能主要在细胞核发挥功能，这与LaBBX蛋白为转录因子结果相符。前期研究表明，独行菜幼苗在经过低温胁迫后，与抗低温胁迫相关的转录因子会启动表达，调控与抗低温相关的基因表达[19]。独行菜LaBBX基因在4℃低温胁迫处理后表达量迅速升高，且表达量都保持在较高水平。表明LaBBX基因表达量能够响应低温迅速升高，及时调控与抗低温胁迫相关的基因表达，防止低温胁迫对幼苗造成伤害。因此推测，LaBBX基因表达量保持在较高水平可能有助于调控下游相关耐低温基因的表达，以提高独行菜的低温生长耐受性，抵御早春的低温生长环境。

探究独行菜LaBBX基因密码子偏好性，可以揭示其基因的密码子组成特性，探索其在进化过程中的规律及选择其适宜的外源遗传转化受体，为深入研究独行菜LaBBX基因的功能提供依据。研究分析发现高频密码子的使用，使得独行菜LaBBX基因存在密码子偏性，且LaBBX基因密码子选用偏好性弱，密码子偏好使用AT并选用AT结尾，这符合大部分双子叶植物的密码子组成规律[38]。在RSCU和CDS序列聚类分析中，亲缘关系与密码子使用偏性有时不存在相关性，然而CDS序列聚类分析结果更接近传统的物种亲缘关系分类，表明RSCU聚类分析仅能在密码子使用偏性上体现物种的特殊进化规律。密码子使用偏好性主要受突变压力和自然选择的影响，综合BBX基因的PR2偏好性分析、中性绘图和ENc绘图分析，表明不同BBX基因在密码子选用偏好性，除受碱基突变影响以外，还主要受自然选择表达量和基因长度等因素的影响。

物种间密码子使用频率的比值差异小，表明物种间密码子使用偏性差异不大，差异越小越有利于基因的异源表达[39]。酵母菌与独行菜LaBBX基因密码子选用频率比值差异最小，因此较适合异源表达，同样烟草和拟南芥也能作为其功能验证的异源受体。但实际应用中需要对部分密码子进行优化，并综合LaBBX基因的mRNA二级结构、转录后水平调控和转化效率等因素，来决定其能否较高表达，所以使独行菜LaBBX基因在异源植株高效遗传表达仍需深入研究。

4 结论

本研究对独行菜LaBBX基因进行克隆，初步探究了其在幼苗低温生长的响应特征和基因密码子偏好性。qRT-PCR分析LaBBX基因显示其在独行菜幼苗受低温胁迫时可能起调控作用。基因偏好性分析发现其密码子使用偏性弱，偏好使用AT，其偏好性的形成与突变和自然选择等诸多因素相关。此外，酵母菌和拟南芥是独行菜LaBBX基因遗传转化的理想受体。本研究为进一步探讨独行菜低温萌发生长的相关调控机理和独行菜LaBBX基因的异源表达及基因功能提供了一定参考。