高油酸花生萌发期耐冷性综合评价及种质筛选

孙东雷 卞能飞 王 幸 邢兴华 沈 一 徐泽俊 齐玉军 王晓军，*

(1 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221131； 2 江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaL.)起源于热带美洲地区，对温度尤为敏感。我国花生主产区为黄淮海地区，在花生春播期间，极易出现“倒春寒”天气，对花生的萌发及出苗产生极大影响，带来的经济损失不可估量。相比推迟播种期或覆盖地膜等降低低温危害的措施，研究不同花生品种的低温耐性，筛选耐冷花生种质是较为有效的途径。

近年来，高油酸花生在我国的种植面积逐步扩大，北方花生主产区正在进行以高油酸品种为主体的第六次品种更新[1]。高油酸花生种子油酸含量大于等于75%[2]，相比普通花生，高油酸花生更有益于人体健康。高油酸花生制品能够更好地保持风味，延长货架期。油酸含量是评价植物油品质的重要指标[2]。Norden等[3]在1987年首次报道了花生品种F435的油酸含量高达79.9%，从此开启了美国高油酸花生育种进程。国内最早种植的高油酸花生品种为锦引花1号，为锦州农业科学院引进备案的高油酸花生品种，国内首个自主创制的高油酸花生品种为花育32号[4]，从2002年至2018年底，我国共育成了54个高油酸花生品种[1]。低温冷害是我国北方花生主产区春播的主要影响因子，开展对高油酸花生种质资源耐冷性的综合评价，筛选鉴定及应用耐冷性强的高油酸花生种质资源是应对低温冷害的主要途径。

种子萌发期为植物生长中最脆弱，最关键的阶段，包括吸胀、萌动及萌发3个阶段[5]。依据主要限制因素选择原则，冷浸发芽试验可以作为花生种子低温出苗能力强弱的检验方法[6]，而吸胀阶段又是外部冷害对种子萌发影响最大的阶段[7-8]。国内学者普遍将2℃作为花生吸胀萌发期耐冷的鉴定温度，并筛选出一批耐冷的花生种质资源[5,7,9-12]。近年关于高油酸花生吸胀萌发期耐冷的报道集中在少数品种的研究上，常博文等[11]以2℃为处理温度，以出苗率为标准筛选出了4个耐低温的品种，其中2个是高油酸花生品种。陈昊等[5]筛选到的2个高油酸花生品种的相对发芽率接近耐冷品种的标准。张高华等[12]研究表明耐寒高油酸花生S53/S51种子2℃低温浸泡后萌发率高于不耐寒高油酸花生品种HY661和L126。总体上，国内关于高油酸花生种质资源耐冷的研究相对缺乏。本研究拟以56份高油酸花生品种(系)为试验材料，通过加权隶属函数法、主成分分析及聚类分析，构建高油酸花生耐冷性综合评价体系，筛选耐冷性强的高油酸花生种质资源，以期为高油酸花生种质资源的评价、利用及研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究于2019年在江苏徐淮地区徐州农业科学研究所农业农村部甘薯生物学与遗传育种重点实验室进行。选用本单位最新培育和引进的共计56份高油酸花生种质资源作为试验材料，种质名称、油酸含量、来源地及审(鉴)定、登记信息如表1所示。

表1 供试材料信息汇总

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 2018年对56份试验材料进行单位扩繁种植，收获并测定油酸食量，保证试验材料油酸的纯度和稳定性，2019年继续种植收获用于低温试验。参照刘海坤等[13]的方法将高油酸花生种子种皮于通风橱进行消毒，选取粒型一致、无霉变、成熟度好的种子，置于连接氯气生成装置的密闭容器中。氯气消毒可降低花生种皮的污染破损率，提高试验数据的准确度。

56份高油酸花生种质资源分为56个组别，每个组别分为处理组和对照组，每个组设置3次重复，每次重复选取饱满无破损的灭菌种子30粒，依据刘海龙等[10]低温冷浸发芽试验方法。处理组将灭菌种子浸于2℃灭菌的双蒸水中，浸种48 h后，置于灭菌培养皿内，转移至25℃人工气候箱内进行发芽试验。对照组于25℃条件下浸种6 h，置于灭菌培养皿内，转移至25℃人工气候箱内进行发芽试验。

1.2.2 测定方法 调查取样：发芽试验开始后24、48、72、96和120 h分别统计处理组和对照组的发芽数(胚根长度≥3 cm)、露白数(胚根突破种皮)[9]，120 h时统计测量培养皿中试验材料的胚根长，子叶鲜重、胚(胚芽、胚根、胚轴)鲜重。

露白率(percentage of the number of seeds with radicals breaking through testa, PSWRBT)=(72 h露白的种子总粒数/供试的种子总粒数)×100%[9]

(1)

发芽率(germination rate, GR)=(120 h发芽的种子总粒数/供试的种子总粒数)×100%[14]

(2)

发芽势(germination energy, GE)=(48 h发芽的种子总粒数/供试的种子总粒数)×100%[14]

(3)

发芽指数(germination index, GI)=∑(Gt1/Dt1)

(4)

式中，Gt1表示不同时间下的发芽数，Dt1表示相对应的发芽时间[15]。

露白指数(seeds with radicals breaking through testa index, SWRBTI)=∑(Gt2/Dt2)

(5)

式中，Gt2表示不同时间下的露白数，Dt2表示相对应的露白时间[9]。

活力指数(vigor index, Ⅵ)=∑(Gt1/Dt1)×S

(6)

式中，S为发芽到120 h时胚根长度[16]。

平均发芽时间(mean germination time, MGT)=∑(dn)/∑n

(7)

式中，h为从培养之日起算的天数，n为各日种子的发芽数[17]。

萌发耐冷指数(germination cold tolerant index, GCTI)=(1.00)nd1+(0.80)nd2+(0.60)nd3+(0.40)nd4+(0.20)nd5

(8)

式中，nd1、nd2、nd3、nd4和nd5分别为24、48、96、120和144 h的种子发芽率，1.00、0.80、0.60、0.40、0.20分别为相应发芽时间所赋予的耐冷系数[18-19]；

露白耐冷指数(seeds with radicals breaking through testa cold tolerant index, SWRBTCTI)=(1.00)nt1+(0.80)nt2+(0.60)nt3+(0.40)nt4+(0.20)nt5

(9)

式中，nt1、nt2、nt3、nt4和nt5分别为24、48、96、120和144 h的种子露白率，1.00、0.80、0.60、0.40、0.20分别为相应露白时间所赋予的耐冷系数[18-19]。

1.2.3 耐冷性状评价指标计算 以相对值评价高油酸花生种质资源萌发期的耐冷性，可避免种质资源本身的差异对研究结果的影响。

性状相对值(relative value of traits)=2℃冷胁迫性状平均值/25℃对照性状平均值[20]。

1.3 数据统计分析

本研究通过公式

Xij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(10)

把56份高油酸花生种质资源的11个耐冷性状函数值定义在[0,1]区间内，Xjmin、Xjmax分别为耐冷性状指标最小值和最大值，Xij表示种质i在耐冷指标j的测定值。耐冷指标均方差系数(Vj)通过公式(11)计算所得

(11)

耐冷指标的权重系数Wj的计算公式

(12)

高油酸花生种质耐冷综合评价D值的计算公式：

(13)。

试验采用Excel 2019对高油酸花生耐冷指标数据进行分析，采用SPSS 20.0分析高油酸花生耐冷指标，主要包括描述统计、KMO检验、Bartlett’s检验、主成分分析、相关性分析及聚类分析。

2 结果与分析

2.1 高油酸花生种质萌发期耐冷系数的差异

露白率、发芽率分别反映了高油酸花生种子露白、发芽的多少，发芽势、发芽指数分别反映了高油酸花生种子发芽的整齐性、综合活力，平均发芽时间、萌发耐冷指数分别反映了高油酸花生种子发芽所需时间的长短、整个萌发期耐冷性的综合表现。由表2可知，56份高油酸花生种质资源调查性状相对值差异明显。11个耐冷指标的平均变异系数为34.54%，相对发芽势变异系数最大，变化幅度从0～58.00%，其次是相对活力指数和相对胚鲜重；相对平均发芽时间的变异系数最小，变化幅度从120.00%～208.54%。

表2 高油酸花生萌发期耐冷指标的描述性统计

2.2 高油酸花生萌发期耐冷指标的因子分析

2.2.1 KMO检验和Bartlett’s检验 在主成分因子分析前，利用SPSS对原始数据进行KMO检验和Bartlett’s球状检验，检验结果如表3所示。KMO检验值0.775大于0.5，适合进行因子分析[22]；Bartlett’s球状检验结果为P<0.05，说明试验数据符合正态分布[22]。因此，本研究试验数据适合做因子分析。

表3 KMO和Bartlett’s适合性检验

2.2.2 高油酸花生萌发期耐冷指标的因子分析 由表4可知，前3个主成分的累计贡献率达到了79.934%，能够反映11个耐冷指标的大部分信息，因此选取前3个主成分作为高油酸花生萌发期耐冷性评价指标[23]。其中第1主成分的贡献率最大，为58.207%，第2主成分的贡献率为12.858%，第3主成分的贡献率为8.869%。

对第1主成分进行分析得出，相对发芽指数、相对萌发耐冷指数、相对露白耐冷指数、相对露白指数、相对发芽率、相对露白率的相关系数分别为0.960、0.954、0.930、0.906、0.895及0.893，表明第1主成分主要反映了高油酸花生露白及萌发指标，定义为露白萌发性状因子；第2主成分中，相对平均发芽时间的相关系数为0.903，定义为发芽时间性状因子，第3主成分中，相对子叶鲜重的相关系数为0.952，定义为子叶鲜重性状因子。因此，本研究利用主成分分析把多个高油酸花生萌发期耐冷指标归为了具有代表性的因子，进一步量化变量数目，获取了高油酸花生萌发期耐冷性主要影响指标。

表4 高油酸花生萌发期耐冷指标的主成分分析

2.3 高油酸花生种质萌发期耐冷指标的相关性分析

相关性分析表明(表5)，露白萌发性状指标间存在显著正相关性，相对露白指数和相对露白耐冷指数、相对发芽指数和相对萌发耐冷指数之间的相关性最高，相关系数分别为0.977和0.965，相对露白率和相对露白耐冷指数、相对发芽率和相对发芽指数之间的相关系数分别为0.943和0.888，相对露白率和相对露白指数、相对发芽率之间的相关系数分别为0.876和0.862，相对发芽率和相对露白耐冷指数、相对萌发耐冷指数之间的相关系数分别为0.843和0.826。相对平均发芽时间与相对发芽势呈极显著负相关。相对胚鲜重与相对发芽指数之间的相关性也达到了极显著水平，相对胚鲜重与相对露白率、相对发芽率、相对活力指数、相对露白耐冷指数、相对萌发耐冷指数之间的相关性也都达到了显著水平。

表5 高油酸花生种质萌发期耐冷指标的相关性分析

2.4 高油酸花生萌发期耐冷性综合评价

本研究利用隶属函数法对56份高油酸花生萌发期耐冷指标数据进行了标准化处理，通过公式(11)与(12)计算得出11个耐冷指标的权重系数，权重系数分别为相对露白率DRPSWRBT(0.076)、相对发芽率RGR(0.078)、相对发芽势RGE (0.124)、相对露白指数RSWRBTI (0.064)、相对发芽指数RGI (0.079)、相对活力指数RVI (0.121)、相对平均发芽时间RMGT (0.109)、相对露白耐冷指数RSWRBTCTI (0.066)、相对萌发耐冷指数RGCTI (0.082)、相对子叶鲜重RCFW (0.074)以及相对胚鲜重REFW(0.126)，根据公式(13)计算得出56份高油酸花生萌发期耐冷指标的综合得分(D值)，对其进行综合评价。结果如表6所示，高油酸花生萌发期耐冷性状综合值(D值)均值为0.497，不同高油酸花生品种在萌发期耐冷性存在较大差异，品种15L17的D值最高(0.754)，品种15S11的D值最低(0.080)，表明15L17耐冷性最好、15S11耐冷性最差。

56份高油酸花生萌发期耐冷性综合评价D值变化范围为0.080～0.754，综合评价D值与11个耐冷指标的相关性分析(表7)，D值与9个性状的相关性达到了极显著水平，从高至低分别为相对发芽率RGR(0.921)、相对发芽指数RGI(0.911)、相对萌发耐冷指数RGCTI(0.894)、相对露白耐冷指数RSWRBTCTI(0.891)、相对露白率RPSWRBT(0.881)、相对露白指数RSWRBTI(0.851)、相对活力指数RVI(0.741)、相对发芽势RGE(0.629)、相对胚鲜重REFW(0.441)，由此表明D值可以作为高油酸花生萌发期耐冷性综合评价指标，D值越大表明高油酸花生萌发期耐冷性越强。

表6 高油酸花生萌发期耐冷性综合评价

表7 综合评价D值与11个耐冷指标的相关系数

2.5 高油酸花生萌发期耐冷性聚类分析

根据56份高油酸花生萌发期耐冷性综合评价D值进行聚类分析，在欧式距离为10处可聚为5类，结果如图1所示。依据D值变化范围将56份高油酸花生耐冷等级划为5个级别，耐冷分级结果如表8所示，56份高油酸花生材料被分为5个组群，15L17为耐冷较强材料(1级)、15L16等20份种质为中等耐冷材料(2级)、花育917等29份种质为耐冷较差材料(3级)、开农176等5份种质为耐冷差材料(4级)、15S11为冷敏感材料(5级)。对56份高油酸花生萌发期耐冷性综合评价D值进行Kolmogorov-Smirnov检验，P值(0.2) > 0.05，表明参试材料D值符合正态分布，因此这种耐冷等级的划分具有统计学意义[24]。

图1 56份高油酸花生萌发期耐冷性聚类分析

表8 56份高油酸花生萌发期耐冷性的分级结果

3 讨论

萌发期是种子对低温最敏感的时期之一[25]，该时期遭遇低温，种子发芽及之后的生产进程均将受到影响，最终导致产量和品质下降。尽管在植物生长的任何时期都可以通过低温鉴定其耐冷性，但萌发期具有用时短、易操作、效率高的特点，已成为耐冷鉴定的首选方法，且在水稻[26]、大豆[27]、花生[28]等作物上研究表明，作物在萌发期耐冷性和生长后期的耐冷具性有一致性。因此，明确作物萌发期耐冷指标并筛选耐冷性品种，可为耐冷品种资源选育、大田抗冷栽培提供理论指导和技术支持。

本研究采取了常温对照与低温处理下各耐冷指标的相对值进行分析，消除了不同高油酸花生本身品种固有的特性，使得试验指标数据更具有科学性[29]。高油酸花生萌发期各性状指标之间以及多数指标与耐冷指标之间相关性极显著或显著，表明性状信息之间有较多重叠，采用单个性状指标来评价高油酸花生萌发期耐冷性有明显的局限性[30]。本试验基于耐逆胁迫萌发指标露白率、发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、平均发芽时间，将露白耐冷指数、萌发耐冷指数、子叶鲜重及胚鲜重作为高油酸花生萌发耐冷指标，可较准确、全面地反映高油酸花生在萌发期的耐冷特性。

国内外关于花生萌发期及苗期耐冷性品种鉴定筛选的研究报道较多[31-34]，但涉及高油酸花生萌发期耐冷性的报道只针对少数几个品种开展[5,11-12]，且对高油酸花生资源萌发期耐冷性鉴定及综合评价的研究鲜见报道。利用主成分分析与隶属函数法相结合对种质资源进行耐冷性评价，可以避免单一指标评价资源耐冷的片面性，此方法已在水稻[35]、棉花[36]、黄瓜[37]耐冷性综合评价中得到应用。本研究中，56份高油酸花生种质资源萌发期的11个耐冷指标按贡献率高低可归为露白萌发因子、发芽时间因子及子叶鲜重因子3类。各因子得分不同，其中露白率、发芽率、发芽指数得分较高，说明在高油酸花生耐冷性鉴定中有较大贡献，此结论与常博文等[11]、薛云云等[28]、Wang等[33]、吕建伟等[38]在普通油酸花生中的研究结果一致。关于萌发耐冷指数、露白耐冷指数在高油酸花生萌发期耐冷性评价中的贡献，国内外尚鲜有报道。本研究认为发芽指数及萌发耐冷指数可作为高油酸花生萌发期耐冷性的最优鉴定指标，此结论进一步补充和完善了高油酸花生萌发期耐冷评价指标，可为今后高油酸花生耐冷鉴定提供理论支持。

56份高油酸花生耐冷性按综合评价D值大小排序，既克服了各指标之间信息重叠导致的误差，又利用了各指标之间内在联系，D值作为一个[0,1]的纯数，保证综合评价更准确。高油酸花生萌发期耐冷性状综合评价D值范围为0.080～0.754，均值为0.497，表明不同高油酸花生品种在萌发期耐冷性存在较大差异，这与张高华等[12]、Balota等[34]研究结论一致。由56份高油酸花生综合评价D值得分显示，山东省花生研究所育成的15L17萌发期耐冷性最好、15S11萌发期耐冷性最差，上述结论可为高油酸花生耐冷性理论研究提供参考，也可为实际生产中品种选择提供指导性意见。

通过对综合评价D值进行聚类分析，将来源、耐性不同的品种划归为不同的类群是种质资源多样性鉴定评价的主要方法[39-40]。本研究将56份高油酸花生根据耐冷强弱分为5个类群，各类群的材料次数分布符合正态分布，耐冷较强材料及冷敏感材料占比极少，中等耐冷材料和耐冷较差材料占比最大，因此试验中筛选到的耐冷种质，可作为高油酸花生耐冷育种和耐冷机理研究材料，陈昊等[5]、薛晓梦等[41]的报道中也得到类似研究结果。因此，在今后的高油酸耐冷育种工作中，选择亲本时既要考虑来源也要兼顾亲本归属的类群。

4 结论

本研究综合采用隶属函数法、主成分分析及聚类分析方法对56份高油酸花生11项耐冷指标进行评价分析， 按贡献率高低11个耐冷指标归为露白萌发因子、发芽时间因子及子叶鲜重因子。发芽指数和萌发耐冷指数可作为高油酸花生萌发期耐冷性的最优鉴定指标。不同高油酸花生品种萌发期耐冷性存在较大差异，筛选到了1份萌发期耐冷性较高的油酸花生材料15L17、20份中等耐冷材料、29份耐冷较差材料、5份耐冷差材料、1份冷敏感材料15S11。本研究筛选到的耐冷种质，可作为高油酸花生耐冷育种和耐冷机理研究材料。