桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

秦 娟 余 凡 刘 璐 朱婷婷 陈 伟 曹士锋 杨震峰 施丽愉,*

(1 浙江万里学院，浙江 宁波 315100；2 上海海洋大学，上海 201306)

类胡萝卜素是大量存在于黄色、橙色和红色果实中的萜类色素物质，其含量和组成直接决定了果实外观色泽和商品性[1]。果实中类胡萝卜素具有重要的保健及经济价值，不仅可为人类提供膳食维生素A，而且在清除自由基、提高免疫力、预防心血管疾病和防癌等保护人类健康方面起重要作用[2-3]。近年来，随着人们对营养健康关注度的提高，果蔬的营养价值被进一步挖掘，尤其对类胡萝卜素的研究逐渐深入。目前，深入揭示果实中类胡萝卜素的形成与调控已成为国内外研究的热点。

NAC家族转录因子是近年来新发现的一类植物特有转录因子[4]，其命名来源于矮牵牛NAM(noapicalmeristem)基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2(cup-shapedcotyledon)基因的首字母缩写[5]。NAC家族编码蛋白的N端含有一段高度保守的NAM结构域，是NAC的功能结构域，其C端高度变异，为转录激活域[6]。研究表明，NAC转录因子具有多种生物学功能，在植物生长发育[7]、逆境胁迫应答[8]、成熟衰老[9]和激素信号转导[10]等过程中扮演着重要角色。值得注意的是，在模式植物番茄(Solanumlycopersicum)中的研究发现，NAC转录因子能参与果实类胡萝卜素积累的调控。在番茄果实中已发现了4个NAC转录因子参与调控果实类胡萝卜素的积累，即SlNAC1、SlNAC4、SlNAC19(SNAC9)和SlNAC48(SNAC4)；其中，SlNAC1在未成熟的绿果期大量表达[11]，其通过抑制番茄果实中SlPSY1表达，负调控果实类胡萝卜素的积累[12-13]。相反，SlNAC4、SlNAC19和SlNAC48都是果实类胡萝卜素合成的正调控转录因子，它们的沉默表达均降低了SlPSY1表达量，减少了总类胡萝卜素的积累[14-15]。

桃(Prunuspersica)是我国重要特色水果，根据成熟果实果肉色泽，可将桃果实分成白肉、黄肉和红肉桃3类。其中，黄肉桃果实是很好的类胡萝卜素源，而白肉桃果实几乎不含类胡萝卜素[16]。Cao等[17]研究发现，与黄肉桃品种金丽果实相比，白肉桃品种湖景果实中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因PpCCD4的高表达是该果实几乎不含类胡萝卜素的重要原因之一。Bai等[18]通过基因沉默技术将白肉桃中PpCCD4基因敲除，结果显示白肉桃被注射部分出现黄色素沉着及类胡萝卜素含量的增加。由此可见，PpCCD4基因是造成黄肉桃和白肉桃果实色泽差异的关键因子。以往对黄肉桃果实类胡萝卜素的研究大多集中在类胡萝卜素的种类、含量等变化规律，鲜见黄肉桃果实类胡萝卜素积累的转录调控机制研究。基于此，本研究在前期利用NCBI-BLAST工具从桃中获得了1个与番茄SINAC19高度同源的NAC基因，将其命名为PpNAC19。本研究对PpNAC19进行克隆和生物信息学分析，通过实时荧光定量 PCR技术分析PpNAC19基因在不同桃组织和不同成熟期桃果实中的表达差异，同时检测黄肉桃和白肉桃果实不同成熟时期总类胡萝卜素含量变化以及PpCCD4基因表达差异，并利用双荧光素酶试验分析PpNAC19转录因子对PpCCD4基因启动子的转录调控作用，旨在为揭示桃果实类胡萝卜素积累调控机制奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料黄肉桃品种金丽和白肉桃品种湖景均由浙江省奉化市水蜜桃研究所提供。分别采集花、叶、芽、软核期果实(盛花后35～45 d)和硬核期果实(盛花后55～65 d)；同时采集S1期(盛花后90～100 d)、S2期(盛花后100～110 d)、S3期(盛花后110～120 d)、S4期(盛花后120～130 d)和S5期(盛花后130～150 d)5个不同成熟时期果实。样品采集后1 h内运回实验室，立即用液氮冷冻，-80℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 桃总RNA提取及cDNA合成 桃5种组织(花、叶、芽、软核期果实和硬核期果实)和5个成熟时期果实(S1、S2、S3、S4和S5期)总RNA的提取采用植物RNA提取试剂盒(Omega，美国)。然后，以提取的总RNA为模板，根据SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)合成反转录cDNA第一链。

1.2.2PpNAC19的克隆 根据从NCBI数据库中查找获得的桃PpNAC19基因序列，利用Primer Premier 5.0设计开放阅读框(open reading frame, ORF)扩增引物(表1)。以桃果实cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为ddH2O 29 μL、5×SF buffer 10 μL、dNTP Mix 1 μL、cDNA模板5 μL、正反向引物各2 μL、phanta Super-Fidelity DNA Polynerase 1 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性8 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min 20 s,30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与PMD18-T载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送上海华大基因测序。

1.2.3 实时荧光定量PCR 利用Beacon Designer 7软件设计PpNAC19和PpCCD4基因特异性扩增引物，见表1。根据美国赛默飞世尔公司的DyNAmo Flash SYBR Green qPCR试剂盒，以反转录第一链cDNA为模板，反应体系为2×Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。采用CFX96 Touch Real-Time PCR系统进行三步法扩增。程序设置如下：95℃初始变性7 min，95℃保持15 s，进行39个循环，45～60℃退火30 s，75℃保持15 s。以PpTEF2作为内参基因，进行3次生物学重复，最终结果采用2-ΔΔCT方法进行分析。利用IBM SPSS Statistics 21软件对数据进行显著性分析。

表1 引物序列

1.2.4 桃总类胡萝卜素含量的测定 参考梁敏华[19]的方法，略作修改。取10 mL无水乙醇(含0.1%抗坏血酸)加入50 mL离心管中，置于冰上预冷30 min,加入2 g液氮研磨粉末样品，涡旋40 s，置于-20℃下避光浸提10 h。加入550 μL 80%氢氧化钾溶液,涡旋30 s，置于95℃恒温水浴锅中避光皂化45 min。取5 mL预冷去离子水加入皂化液，立刻置冰浴冷却。加入5 mL石油醚(60～90℃)，涡旋30 s萃取皂化液，6 000×g离心10 min，取上清液。重复萃取4次，合并上清液。氮吹去除上清液中的石油醚，再加入3 mL体积比为1∶1 的二氯甲烷、甲醇混合液溶解。取1 mL溶解液，用上述二氯甲烷、甲醇混合液定容至10 mL，混匀，用UV-1900紫外可见分光光度计(日本岛津)测定其在450 nm波长下的吸光度，用二氯甲烷、甲醇(1∶1)混合液作为空白液对仪器进行空白调零，代入公式(1)得出总类胡萝卜素含量：

ρ=A450×v×f×10×1 000×m-1×2 500-1

(1)

式中，ρ：样品中类胡萝卜素的质量浓度，μg·g-1；A450：类胡萝卜素萃取液在450 nm下的吸光值；v：类胡萝卜素萃取液体积，mL(即3 mL)；f：测定时类胡萝卜素萃取液的稀释倍数(即10倍)；m：样品质量，g； 2 500∶1% 类胡萝卜素在最大吸收波长时的平均吸光值。

1.2.5PpNAC19的生物信息学分析 利用NCBI网站中的CD-search工具鉴定PpNAC19基因序列的保守结构域。利用NCBI-BLAST搜索与PpNAC19基因同源性较高的基因，再结合GeneDoc和ClustalW2软件将PpNAC19基因与同源基因进行氨基酸序列比对分析。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在线分析氨基酸序列、蛋白质分子量、氨基酸组成、理论等电点、脂溶指数、亲水系数。利用在线工具Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)进行蛋白质的亚细胞定位分析。利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线分析蛋白质二级结构；利用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质的三级结构。利用MEGA 7.0软件中邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树，自展值(bootstrap)设为1 000。

1.2.6 LUC/REN双荧光素酶试验 利用高保真酶Phanta® Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，南京)和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme，南京)将PpNAC19基因ORF序列插入到pGreenII 62-SK载体的BamHI和HindIII酶切位点区域，将PpCCD4基因启动子序列插入到pGreenII 0800-LUC载体的BamHI和NcoⅠ酶切位点区域，扩增引物见表1。利用电击法将构建好的PpNAC19-62-SK和PpCCD4-0800-LUC重组载体转化到农杆菌EHA105感受态，通过菌液PCR法检测得到阳性转化菌株。挑取单菌落接种于5 mL含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡纳霉素的LB液体培养基，28℃、220 r·min-1活化12 h。取适量活化菌接种于50 mL含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡纳霉素的LB液体培养基，相同条件培养12 h至OD600为1.0～2.0，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清液。用灭菌水洗菌后，加侵染液(10 mmol·L-12-吗啉乙磺酸，10 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH值5.6)调节菌液OD600约为0.25，置于室温避光3 h。将PpNAC19-62-SK和PpCCD4-0800-LUC菌液按8∶1(v∶v)比例混合，用1 mL注射器将其注射到烟草叶片背面下表皮内，置于人工气候箱中培养3 d。采用双荧光素酶报告分析试剂盒(Dual-Luciferase® Reporter Assay System)(Promega，美国)和Luminoskan Ascent化学发光分析仪(Thermo，美国) 测定叶片侵染区中萤火虫光素酶与海肾光素酶催化产生的荧光信号(LUC和REN)比值。

2 结果与分析

2.1 PpNAC19基因序列与蛋白特征分析

以桃果实cDNA为模板进行PCR扩增，得到一段约900 bp的片段。测序结果表明，该片段长度为867 bp，与NCBI数据库中查找获得的桃序列(XP_007223324.1)完全吻合，BLAST结果(图1)显示，该片段含有一个NAM结构域，从N端第10～第134氨基酸，为NAC转录因子特征结构域。

PpNAC19基因编码288个氨基酸，预测蛋白质分子量为33.2 kDa，等电点为7.01，不稳定系数为39.34，属于稳定蛋白。该蛋白的平均疏水系数为-0.719， 属于亲水性蛋白。利用在线工具Cell-PLoc对蛋白进行亚细胞定位分析发现，PpNAC19蛋白定位在细胞核的可能性最大。对蛋白质二级结构进行分析发现，无规则卷曲结构占71.53%，延伸链和α-螺旋结构各占14.24%，与蛋白三级结构预测结果基本一致。

图1 PpNAC19蛋白中NAM结构域分析

2.2 PpNAC19蛋白的同源比对与聚类分析

对桃PpNAC19基因的ORF序列进行NCBI-BLAST分析，发现其编码的氨基酸序列与其他植物NAC蛋白有一定的相似性，其与巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1) 的氨基酸序列同源性最高，达到99.65%，其次为梅(Prunusmume，XP_008221592.1)，同源性为98.61%。通过与其他9种植物序列进行多重比较分析，结果(图2)表明，PpNAC19蛋白与其他物种NAC在N端高度相似，都存在5个保守的NAC转录因子结构域(A～E)，而C端差异较大，是高度变异和具有转录激活功能的调控区。利用MEGA 7.0软件构建进化树，结果表明PpNAC19与巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1)聚类于同一分支(图3)，亲缘性较好。

注：图中字母表示NAC结构域中5个亚结构域A～E。

图3 桃PpNAC19蛋白与其他植物NAC蛋白的聚类分析

2.3 PpNAC19基因表达分析

对不同桃组织(花、芽、叶、软核期果实和硬核期果实)中PpNAC19的表达量进行分析，结果表明(图4-A)，PpNAC19在黄肉桃金丽和白肉桃湖景的所有组织中均有表达，并且在2个品种桃的不同组织中表达趋势一致，即都在硬核期果实中表达水平最高，其次为花和软核期果实，在芽中表达量最低，对2种桃进行比较发现，PpNAC19在金丽硬核期果实中表达量显著低于湖景(P<0.05)，而在2种桃的花、芽、叶和软核期果实中表达量无显著差异(P>0.05)。

由图4-B可知，在金丽和湖景果实成熟过程中PpNAC19基因表达量都呈先上升后下降的趋势，在果实成熟后期(S3～S5)金丽中PpNAC19表达量显著高于湖景果实(P<0.05)。

注：不同小写字母表示在 0.05 水平差异显著。下同。

2.4 桃果实成熟过程中总类胡萝卜素含量分析

由图5可知，在桃果实成熟过程中，金丽果实中总类胡萝卜素含量逐渐上升，并且显著高于湖景果实(P<0.05)，湖景果实中总类胡萝卜素含量在各成熟时期无显著变化(P>0.05)。

图5 不同成熟度果实中总类胡萝卜素含量变化

2.5 桃果实成熟过程中类胡萝卜素代谢基因PpCCD4表达分析

由图6可知，在桃果实成熟过程中，PpCCD4基因表达量在白肉桃湖景中呈现先上升后下降的趋势，在黄肉桃金丽果实中其表达量并无显著变化(P>0.05)，但黄肉桃中该基因的表达量显著低于白肉桃(P<0.05)。

图6 不同成熟度果实中类胡萝卜素代谢基因PpCCD4的表达

2.6 PpNAC19转录因子对PpCCD4基因启动子的转录调控特性

利用同源重组方法，将PpNAC19基因ORF序列插入pGreenII 62-SK构建Effector重组载体，将PpCCD4基因启动子序列插入pGreenII 0800-LUC构建Reporter重组载体(图7-A)。LUC/REN双荧光素酶试验结果如图7-B所示，与阴性对照相比，当PpNAC19与PpCCD4基因启动子共同转化烟草时，萤火虫光素酶与海肾光素酶催化产生的荧光信号(LUC和REN)比值极显著降低(P<0.001)，说明PpNAC19能够转录抑制PpCCD4启动子活性，从而抑制PpCCD4基因表达。

注：A:载体构建； B:将报告基因与效应基因共转化烟草，LUC与REN比值作为最终的转录激活活性；*** 表示差异极显著(P<0.001)。

3 讨论

NAC是植物中特有的一类转录因子，其N端含有高度保守的NAM结构域，由150～160个氨基酸组成，包含了5个子结构域(A～E)，A、C和D子结构域高度保守，B和E子结构域保守性不强[20]。NAC蛋白C端是转录激活域，特异性较高，富含丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸和苏氨酸等[21]。本试验从桃果实中克隆获得了PpNAC19基因，将其编码的氨基酸序列与其他物种NAC进行比对，发现其与巴旦杏、梅和樱花等植物高度同源。对PpNAC19蛋白结构分析发现，该蛋白为亲水性蛋白，与大多数植物中NAC蛋白相似[22]。亚细胞定位预测表明，PpNAC19定位于细胞核，属于典型的核蛋白，表明PpNAC19基因可能在细胞核中发挥重要功能。另外，该蛋白N端含有一个NAM结构域，C端富含丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸和谷氨酸等。其二级结构主要以无规则卷曲结构为主，这与大多数NAC蛋白二级结构相似。以上结果表明PpNAC19是NAC转录因子家族之一，但同一转录因子在不同物种中的功能可能存在差异。

大量研究发现NAC转录因子具有多种生物学功能，参与植物细胞分裂[23]、种胚发育[24]、花的形成[25]、果实的成熟与衰老[26]等过程，并且在植物抗逆境胁迫应答中有一定的功能[27]。本研究中桃的花、芽、叶、果实等组织中均检测到PpNAC19基因不同程度地表达，表明PpNAC19转录因子可能参与了桃的各个生长发育过程。周晖[28]研究发现桃NAC基因能够激活MYB基因转录从而促进桃果实花青苷着色，而本研究中PpNAC19基因在桃花组织中高表达说明PpNAC19转录因子可能参与调控桃花中花色苷的积累。番茄果实的成熟和发育过程由多个NAC转录因子共同调控，并且这些NAC基因表达量都在果实成熟后期(成熟期和完熟期)达到峰值[15]。姚丹等[29]报道果梅果实中存在12个NAC基因大量表达。本研究中PpNAC19在果实期表达量较高，并且硬核期果实中PpNAC19表达显著高于软核期果实，这说明PpNAC19转录因子可能参与桃果实的成熟与发育过程。

Kou等[15]研究发现SlNAC19是促进番茄果实类胡萝卜素积累的正调控转录因子，SlNAC19基因在果实成熟期间的表达趋势与类胡萝卜素的积累相一致。本研究前期从桃中克隆的PpNAC19基因与番茄SlNAC19基因序列相似度高达69.01%；并且PpNAC19在黄肉桃金丽果实成熟后期表达量显著高于白肉桃湖景果实，这与该期间金丽果实中类胡萝卜素含量显著高于湖景果实相一致，这些结果表明PpNAC19可能具有与SlNAC19类似的功能，即可能也对桃果实类胡萝卜素的积累具有正调控作用。类胡萝卜素裂解双加氧酶CCDs作为催化类胡萝卜素裂解的关键酶，在果实类胡萝卜素的积累及果实颜色的形成中发挥重要作用。已有研究发现，不同品种木瓜和柑橘果实的色泽差异分别与CCD1和CCD4 基因表达水平密切相关[30-31]。类似地，本研究中金丽比湖景果实含有更高的类胡萝卜素含量主要与PpCCD4基因在湖景果实中高表达有关，这与Cao等[17]的研究结果相同。Bai等[18]利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术直接证明了抑制PpCCD4基因表达可以提高桃果实类胡萝卜素的含量。而本研究通过LUC/REN双荧光素酶试验发现PpNAC19转录因子对PpCCD4启动子具有转录抑制作用。因此推测PpNAC19转录因子可能通过抑制PpCCD4启动子活性进而影响其表达，并与其他类胡萝卜素代谢相关基因共同参与调控桃果实类胡萝卜素积累。但PpNAC19转录因子调控桃果实类胡萝卜素合成与积累的具体分子机制有待进一步深入研究。

4 结论

本研究在桃果实中克隆了NAC基因PpNAC19，开放阅读框为867 bp，编码288个氨基酸，含有一个NAM结构域。生物信息学结果显示，该基因编码的蛋白质分子量为33.2 kDa，等电点为7.01，为稳定蛋白，且具有亲水性。PpNAC19与巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1)的氨基酸序列相似率最高。通过分析PpNAC19基因在桃果实成熟过程中时空表达、类胡萝卜素代谢相关基因PpCCD4表达，以及PpNAC19对PpCCD4基因启动子的转录调控作用，推测该基因可能通过抑制PpCCD4表达参与桃果实类胡萝卜素积累的转录调控。本研究为进一步探究PpNAC19转录因子调控类胡萝卜素合成与积累的分子机制提供了理论依据。