海稻86响应碱胁迫调节氮代谢的生理与分子机制

车永梅 徐 青 杨德翠 赵方贵 卢松冲 刘 新

(青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

我国现有盐碱地约15亿亩，其中海岸滩涂盐碱地多达1亿亩，由于不合理灌溉及化学肥料过量使用，土壤盐碱化有进一步加剧的趋势[1]，导致土壤盐碱化成为世界范围内影响植物分布和农作物产量的主要非生物逆境之一。一般将以NaCl和Na2SO4等中性盐为主的土壤称为盐土，以碳酸氢盐(HCO3-)和碳酸盐(CO32-)为主的土壤为碱土，碱胁迫对植物的伤害较盐胁迫更严重、更复杂[2-5]。水稻是世界范围内广泛种植的主要粮食作物，但目前大部分水稻栽培品种对碱胁迫比较敏感，海稻86是原生长于广东湛江遂溪海滩的水稻品种，具有极强的耐碱性[6]，阐明其耐碱机制，可为培育耐碱胁迫的水稻品种提供重要理论指导，对于沿海滩涂盐碱地的开发利用具有重大意义。

氮元素是植物必需的大量元素，是构成蛋白质和核酸等重要物质的组成成分，被称为植物生命元素。研究发现，盐碱胁迫会降低植株氮元素含量，干扰植物氮的代谢过程[7-8]，如引起甜菜叶片以及番茄根和叶片硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸合酶(glutamate synthetase，GOGAT)活性以及硝态氮(NO3--N)含量降低，提高铵态氮(NH4+-N)含量和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenases，GDH)活性[9-10]。碱胁迫条件下，敏感型水稻品种日本晴根部NO3-含量显著降低，叶片和根部NR、GOGAT和GS基因表达量下调[11]。不同抗性的植物品种对碱胁迫的反应存在差异，碱胁迫和盐碱胁迫下抗盐碱性强的水稻和甜菜品种比敏感品种能保持较高NR等氮代谢相关酶活性或基因表达量[9,12]。但目前关于碱胁迫对植物氮代谢影响的研究尚不深入。本研究以抗碱性水稻品种海稻86和碱敏感水稻品种珍汕97为材料，研究碱胁迫下水稻根和叶中氮代谢的变化，以探究其耐碱的生理和分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养

试验材料为抗碱性水稻(Oryzasativa)品种海稻86以及碱敏感品种珍汕97。试验在青岛农业大学山东省高校植物生物技术重点实验室进行。

水稻种子用0.1%(w/v)的HgCl2消毒10 min，蒸馏水冲洗干净，于蒸馏水中浸泡12 h后，播于铺有湿润滤纸的培养皿中，于28℃恒温培养箱中催芽至萌发。

将萌发后的种子播于96孔板中进行水培，于14 h光照/10 h黑暗、29℃/25℃(白天/夜晚)条件下培养，12 d后进行碱胁迫处理。

1.2 试验材料的处理

水稻幼苗用Na+浓度为50 mmol·L-1的碱处理液(含Na2CO3、NaHCO3和Na2SO4的混合液，pH值9.0的1/4 Hoagland营养液)或pH值6.0的1/4 Hoagland营养液(对照植株，CK)处理24 h，取根和叶，用于测定基因相对表达量，4 d后，取根和叶，用于生理指标的测定。每天更换一次培养液。

1.3 不同含氮物质含量的测定

氨态氮含量测定参照刘萍等[13]的方法；硝态氮含量测定采用水杨酸-硫酸显色法[14]；可溶性蛋白含量测定参考Zhao等[15]的方法并稍作改进；脯氨酸含量采用高俊凤[16]的方法。

1.4 氮代谢相关酶活性的测定

NR活性测定采用亚硝酸离子显色法[17]；GS活性测定采用FeCl3络合显色比色法[18]；GDH活性测定参照叶利庭等[19]的方法；GOGAT活性测定参照李泽松等[20]的方法。

1.5 氮代谢相关基因表达量测定

采用改良Trizol法提取水稻总RNA[21]。利用实时荧光定量PCR技术检测基因表达量，在NCBI找到基因序列，用Primer Blast设计引物，所用引物见表1。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa Bio公司)反转录获得的cDNA为模板。实时荧光定量PCR程序为：95℃预变性30 s，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；每个样品进行3次重复。以Actin为内参基因，用2-ΔΔCT方法计算基因相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 数据统计和分析

试验均重复3次。采用SPSS 20.0对数据进行统计分析，Tukey法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对海稻86和珍汕97含氮物质含量的影响

由图1-A、B可知，非胁迫条件下海稻86根和叶中脯氨酸的含量与珍汕97无显著差异(P>0.05)；碱胁迫条件下两个品种根和叶片脯氨酸含量均较非胁迫条件下显著升高，其中海稻86根中脯氨酸含量较非胁迫下CK升高4.67倍，升高幅度明显大于珍汕97的3.48倍。非胁迫条件下海稻86根中可溶性蛋白含量与珍汕97无显著差异，叶片可溶性蛋白含量显著大于珍汕97(P<0.05)；碱胁迫条件下海稻86根和叶片可溶性蛋白含量与非胁迫条件下无显著变化，珍汕97叶片中可溶性蛋白含量则较非胁迫条件下显著降低(P<0.05)(图1-C、D)。与非胁迫条件相比，碱胁迫显著减低了海稻86和珍汕97根和叶片硝态氮含量(P<0.05)，其中珍汕97根中硝态氮含量较非胁迫下的CK降低74.09%，海稻86降低49.73%(图1-E、F)。非胁迫条件下海稻86与珍汕97根中氨态氮含量无显著差异，海稻86叶片氨态氮含量低于珍汕97；碱胁迫条件下，海稻86根和叶片氨态氮含量无显著差异，珍汕97根中氨态氮含量显著升高(P<0.05)(图1-G、H)。

注: 不同小写字母表示不同数据间显著性差异(P<0.05)。下同。

图2 碱胁迫对海稻86和珍汕97根和叶片NR活性和OsNR1表达量的影响

图3 碱胁迫对海稻86和珍汕97根和叶片GS活性以及OsGS1;2和 OsGS2表达量的影响

2.2 碱胁迫对海稻86和珍汕97 NR活性和基因表达量的影响

NR是植物氮代谢的关键酶，催化NO3-还原为NO2-。由图2-A、B可知，非胁迫条件海稻86根和叶片NR活性均显著高于珍汕97，碱胁迫下海稻86及珍汕97根中NR活性均较非胁迫条件无显著变化，叶片NR活性则显著降低(P<0.05)，珍汕97降低幅度高于海稻86。碱胁迫诱导NR基因OsNR1表达量下调(P<0.05)，珍汕97下调幅度高于海稻86(图2-C、D)。NR活性和OsNR1表达量变化较一致。

2.3 碱胁迫对海稻86和珍汕97 GS活性和基因表达量的影响

水稻主要通过GS/GOGAT途径同化NH4+。由图3-A、 B可知，非胁迫条件下海稻86根部GS活性显著高于珍汕97(P<0.05)，两个水稻品种叶片GS活性无显著差异；碱胁迫对海稻86 GS活性无显著影响，但显著降低了珍汕97 GS活性(P<0.05)。

OsGS1;2和OsGS2分别是在水稻根部和叶片中表达的主要OsGS家族基因，非胁迫条件下海稻86和珍汕97根部OsGS1;2表达量无显著差异，海稻86叶片OsGS1;2表达量显著高于珍汕97(P<0.05)；碱胁迫诱导珍汕97OsGS1;2表达量上调，但对海稻86OsGS1;2表达量无显著影响(图3-C、D)；碱胁迫条件下，海稻86和珍汕97根和叶片中OsGS2表达量显著降低(P<0.05)(图3-E、F)。

2.4 碱胁迫对海稻86和珍汕97 GOGAT活性和基因表达量的影响

GOGAT根据其电子供体的不同有NADH-GOGAT和Fd-GOGAT两种类型，NADH-GOGAT主要存在于非光合组织，如根中，而Fd-GOGAT主要存在于光合组织中。正常条件下海稻86根和叶片NADH-GOGAT活性显著高于珍汕97，碱胁迫诱导两个水稻品种NADH-GOGAT活性显著降低，珍汕97降幅大于海稻86(图4-A、B)。碱胁迫对两个水稻品种根中Fd-GOGAT无显著影响，但诱导叶片Fd-GOGAT活性升高(图4-C、D)。水稻中NADH-GOGAT由OsNADH-GOGAT1和OsNADH-GOGAT2编码，碱胁迫条件下两个品种根和叶片OsNADH-GOGAT1和OsNADH-GOGAT2相对表达量均显著升高，两个水稻品种根中OsFd-GOGAT相对表达量有所降低，叶片中升高，海稻86显著升高，珍汕97根中OsNADH-GOGAT1相对表达量显著升高，叶中OsNADH-GOGAT1以及根和叶中OsNADH-GOGAT2相对表达量升高，但不显著。

图4 碱胁迫对海稻86和珍汕97根和叶片GOGAT活性以及OsFd-GOGAT和OsNADH-GOGAT表达量的影响

2.5 碱胁迫对海稻86和珍汕97 GDH活性和基因表达量的影响

GDH催化α-酮戊二酸与NH4+合成谷氨酸的可逆反应。由图5可知，碱胁迫对海稻86根和叶片NADH-GDH活性无显著影响，但显著提高珍汕97 NADH-GDH活性；碱胁迫下海稻86和珍汕97OsGDH1、OsGDH2、OsGDH3和OsGDH4表达量均有不同程度提高，珍汕97增幅大于海稻86。

3 讨论

海稻86具有极强的耐盐碱性[22-23]，但其耐碱胁迫的生理和分子基础鲜见研究报道。氮元素是构成核酸、蛋白质和叶绿素等许多重要物质的组成成分，维持氮代谢的稳定对于植物适应盐碱胁迫至关重要[24]。本研究表明，在正常条件下海稻86和珍汕97两个水稻品种根和叶片脯氨酸含量无显著差别，碱胁迫诱导两个品种脯氨酸含量显著升高，海稻86根中脯氨酸含量增幅大于珍汕97(图1-A、B)。脯氨酸是渗透胁迫条件下植物体内合成的主要渗透调节物质，并具有清除活性氧，保护膜结构等作用[25-26]，根部与盐碱直接接触，受影响最直接，碱胁迫下，海稻86根中脯氨酸大量积累，表明其具有更强的渗透调节能力。同时，碱胁迫诱导珍汕97根和叶片可溶性蛋白和NO3-含量显著降低，NH4+大量积累，海稻86可溶性蛋白和NO3-含量无显著变化或下降幅度较小，根中NH4+积累量也显著低于珍汕97(图1-C、H)。NR、GS和GOGAT是参与硝酸盐还原和氨同化的关键酶[27]，正常条件下海稻86根部和叶片NR、GS和GOGA显著大于珍汕97，盐碱胁迫显著降低珍汕97的NR、GS和GOGA活性，海稻86酶活性无显著变化或降幅显著低于珍汕97，推测盐碱胁迫下海稻86可溶性蛋白、NO3-和NH4+含量变化较小可能因其具有较高的氮代谢相关酶活性和较强的同化能力，珍汕97 NH4+大量积累可能与氨同化作用受抑制蛋白质合成能力下降有关。碱胁迫下，海稻86 GDH活性无显著变化，珍汕97则显著升高。GDH对氨的亲和力低，非胁迫条件下GDH不是参与氨同化的主要酶，水稻氨同化主要通过GS/GOGAT途径进行[27-28]，碱胁迫条件下珍汕97 GDH活性的显著升高可能与氨的积累有关，可以部分缓解GOGAT/GS途径减弱对氨同化的影响，防止游离态NH4+过多积累，这与Wang等[11,29-30]研究结果相似；他还发现盐胁迫和碱胁迫条件下，盐碱敏感的水稻品种日本晴(Nipponbare)和吉粳88(Jijing88)GDH基因表达量均显著上调，认为盐碱胁迫导致其氮同化途径发生改变，GOGAT/GS途径减弱，GDH途径加强。

进一步检测碱胁迫对氮同化相关酶基因表达的影响，结果表明，碱胁迫下，海稻86和珍汕97 NR以及GDH基因表达量与酶活性变化较一致，NR基因OsNR1表达呈下降趋势，GDH基因OsGDH1、OsGDH2、OsGDH3及OsGDH4表达呈升高趋势(图2和图5)；NADH-GOGAT基因表达变化与酶活性变化存在差异，NADH-GOGAT活性显著降低，但OsNADH-GOGAT1和NADH-GOGAT2表达量显著升高(图4)，这与Shi等[27]研究结果类似，两个氮利用效率不同的水稻品种，低氮条件下GS和NADH-GOGAT基因表达水平无显著差别，但酶活性显著不同，推测低氮条件下水稻幼苗根部GS和NADH-GOGAT活性的调节可能发生在转录后水平；碱胁迫下海稻86和珍汕97 NADH-GOGAT活性变化与基因表达间的差异暗示存在转录后调节，是否与mRNA的翻译过程和酶蛋白的稳定性有关尚需进一步研究。GS存在两种形式GS1和GS2，GS1由OsGS1;1、OsGS1;2和OsGS1;3编码，OsGS2编码GS2，OsGS1;2和OsGS2分别是在水稻根部和叶片中表达的主要OsGS家族基因[11]。碱胁迫对两个品种OsGS1;2和OsGS2表达的影响存在差异，碱胁迫下，海稻86和珍汕97根和叶片OsGS2表达量均显著降低，海稻86根和叶片OsGS1;2无显著变化，珍汕97根和叶片OsGS1;2表达量显著升高，且表达量显著高于海稻86，与两个品种GS活性的表现不同，海稻86的GS活性显著高于珍汕97(图3)，猜测两个水稻品种GS活性与基因表达变化的差异可能与碱胁迫诱导其他GS基因如OsGS1;1和OsGS1;3表达的变化有关。Wang等[11]发现碱胁迫提高OsGS1;1和OsGS1;3在总表达量中的比例；Wang等[30]研究表明，盐胁迫能诱导基因表达组织特异性发生改变，如非胁迫条件下OsGS1;3在小穗中特异表达，但盐胁迫诱导其在老叶中表达，碱胁迫下GS基因的表达是否存在类似变化有待进一步研究。

4 结论

海稻86具有强耐碱胁迫能力，本研究分析了碱胁迫下海稻86氮代谢的变化，表明海稻86具有强耐碱能力可能与其具有较高氮代谢活性，碱胁迫下氮代谢酶活性和相关基因表达量受影响小有关，可为进一步研究海稻86耐碱胁迫机理和耐碱胁迫相关基因的挖掘提供理论基础。但碱胁迫下海稻86氮代谢酶活性和相关基因表达量维持稳定的分子机制有待深入研究。