高压均质-酶解改性提高酸性条件下花生蛋白的溶解性及其稳定性研究

李佳笑 石爱民 赵志浩 冯新玥 胡 晖 刘 丽 王 强

(中国农业科学院农产品加工研究所/农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193)

酸性饮料包括碳酸饮料类、果蔬汁饮料类、运动饮料等，因其余味清爽而深受消费者青睐，占据软饮料市场60%～70%的份额[1]。酸性饮料的主要成分为糖、食用色素以及香精等，蛋白质含量低，无法满足现今消费者均衡饮食的营养需求。若能在传统酸性饮料中加入植物蛋白，可以改善现有酸性饮料营养成分单一的缺陷，也是目前软饮料研发的热点[2]。

花生中蛋白质含量为24%～36%，其蛋白生物价(biological value, BV)为59[3]，净利用率(net protein utilization，NPU)为51，消化率可达90%[4]。花生蛋白具有产量大、营养价值高和易吸收等优点，是一种优质的蛋白资源。如果可以将其添加到酸性饮料中，开发新型花生蛋白酸性饮料，不仅能提升产品的风味，还可以改善现有酸性饮料营养成分单一的缺陷，满足消费者营养均衡的需求。然而，大多数酸性饮料的pH值介于3.0～4.5之间，花生蛋白等电点(isoelectric points，pI)在4.5附近[5]，花生蛋白在等电点处絮凝沉淀限制了其在酸性饮料中的应用。目前，在饮料中加入果胶、海藻胶、黄原胶等多糖类胶体稳定剂[6]，可以通过提高饮料黏度抑制蛋白粒子沉淀从而起到稳定作用，但采用该方法生产的饮料在长期放置后易出现分层或沉淀等现象，影响口感。因此，通过改性提高花生蛋白酸性条件下的溶解性是产业急需解决的关键难题。

提高植物蛋白在酸性条件下溶解度的改性方法包括物理改性、化学改性、酶改性和复合改性[7]。复合改性方法更有效，其中应用较多的复合改性方法为物理-酶解复合改性。

李婷婷等[8]使用超声波联合植酸酶和酸性蛋白酶改性以及挤压膨化联合菠萝蛋白酶改性2种物理-酶解复合改性方法处理大豆分离蛋白，有效提高了大豆分离蛋白在pH值4.0条件下的溶解度。陈剑兵等[9]研究发现30 MPa高压均质预处理菜籽蛋白后，再用碱性蛋白酶进行酶解，可将菜籽蛋白的氮溶指数(nitrogen solubility index，NSI)由16%提升至30%。高压均质预处理使蛋白球状结构更为松散，水分子进入蛋白结构内部与蛋白质发生水合作用增加其溶解度。超高压物理预处理方法的效果较好[10]，包括静态高压处理、高压均化和微射流高压均化。物理-酶解改性较单一酶解法改性效果更好是因为高压处理等物理处理使蛋白质的内部基团暴露出来，导致蛋白质的二硫键被破坏，暴露出更多的酶切位点[11]，使蛋白酶更好地作用于肽键，从而破坏肽键并加速蛋白质分解[12]。

本研究选用高压均质-中性蛋白酶改性方法改性提高花生蛋白粉在pH值4.0条件下的NSI，并将改性后的花生蛋白应用于果汁饮料中，采用Turbiscan多重光稳定性分析花生蛋白对果汁稳定性的影响，确定最优的改性蛋白添加比例，旨在提升花生蛋白在酸性条件下的溶解性，使其可以应用于酸性饮料加工，进而拓宽花生蛋白在食品领域中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂花生蛋白粉(蛋白质含量56.75%，pH值 4.0条件下NSI=4.04%)，由山东青岛长寿食品有限公司提供。100%橙汁纯果汁由山东谷神生物科技有限公司提供。

中性蛋白酶(50 000 U·g-1)、Lowry试剂盒和牛血清白蛋白，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AH-100D纳米高压均质机，上海ATS工程有限公司；HT-110X30水浴振荡器，上海金电仪表有限公司；B290TWCL-B小型喷雾干燥仪, 瑞士步琦有限公司；HT-500调温磁力搅拌加热板，北京瑞成伟业仪器设备有限公司；LYNX 6000离心机，德国Thermo Fisher公司；Turbiscan Lab多重光散射稳定性分析仪，法国Formulation公司；Malvern 500纳米粒度分析仪，英国 Malvern公司。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

1.3.1.1 高压均质单因素试验 称取1.0 g花生蛋白粉若干份，固定单因素试验条件：以料液比[2%、4%、6%、8%、10%， (m∶v)]为变量时，固定均质压力为60 MPa，均质2次[13]；以均质压力(20、40、60、80、100 MPa)为变量时，固定料液比5%(m∶v)配制花生蛋白溶液，均质2次。将处理后样品进行喷雾干燥，用于测定NSI。

1.3.1.2 中性蛋白酶酶解单因素试验 精确称取原料花生蛋白粉末1.00 g于三角瓶中，根据高压均质单因素试验结果，按照最佳料液比配制花生蛋白溶液，选择最佳压力均质2次，然后加入中性蛋白酶进行酶解反应。根据前期试验结果[13]及厂家提供的最佳酶解pH值及酶解温度固定单因素试验条件：以加酶量(100、200、300、400、500、600 U·g-1)作为变量时，固定酶解pH值为7.0、酶解温度为55℃、酶解时间为60 min；以酶解时间(20、30、40、50、60、70 min)为变量时，固定酶解pH值为7.0、酶解温度为55℃、加酶量为500 U·g-1， 水浴震荡(150 r·min-1)进行酶解，酶解反应完成后 95℃灭酶5 min，冷却。将处理后样品进行喷雾干燥，用于测定NSI。

1.3.2 NSI的测定 酸性条件下花生蛋白NSI的测定方法参考文献[14]，并进行适当调整。精确称取原料蛋白粉末或经过改性后蛋白粉末1.00 g于三角瓶中，用蒸馏水配制1%(m∶v)的蛋白溶液，并用0.5 mol·L-1HCl调节溶液pH值至4.0，搅拌40 min后，20℃、10 000×g离心10 min。上清液中的蛋白含量通过Lowry法进行测量[15]，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为标准，NSI为上清液蛋白含量与溶液总蛋白含量的比值。

1.3.3 响应面试验设计 在单因素基础上，采用 Box-Behnken 设计方法，进行4因素3水平响应面试验，以花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI为响应值，用 Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行优化和回归分析。响应面因素水平见表1。

1.3.4 改性后花生蛋白在酸性果汁中的稳定性

1.3.4.1 蛋白果汁制作 取3份纯橙果汁(pH值3.88)，加入改性后的蛋白样品，蛋白添加量分别为3%、4%、5%(m∶v)，加入5%白砂糖，搅拌均匀后罐装。玻璃瓶及瓶盖于120℃高压灭菌30 min。将调配好的蛋白果汁煮沸杀菌90 s后进行热灌装，灌装温度75～80℃。冷却至室温，静置。

1.3.4.2 蛋白果汁稳定性测试 分别取不同蛋白浓度的蛋白果汁样品20 mL置于Turbiscan Lab专用的圆柱形样品玻璃瓶中。光源检测器从样品瓶底部扫描至样品瓶顶部，扫描范围为2～45 mm。测定前静置10 min，测定时间12 h，测定温度25℃，扫描次数38次。

得到不同改性蛋白添加量果汁Turbiscan稳定性图谱的背散射光(backscatterif, BS)曲线，最终应用TurbiSoft-2.0软件分析该图以获得稳定性指数(turbiscan stability index，TSI)，用于评估溶液的稳定性。按照公式计算TSI：

表1 响应面试验因素水平设计

式中，scani(h)为每次测量(i)的平均背散射光指数，scani-1(h)是第i-1次测量的平均背散射光指数。H为样品瓶中样品高度。

TSI将试验期间的所有单次扫描都考虑在内，取其平均值。TSI值越低，说明每两次扫描之间样品稳定性差异越小，溶液稳定性越好[16]。

1.4 数据处理

使用SPSS Statistics version 17软件对试验数据进行分析。通过Ducan的多范围检验确定在95%置信水平下2个平均值之间的显著性差异(P<0.05)。每个试验重复3次或3次以上。

2 结果与分析

2.1 高压均质工艺参数对花生蛋白NSI的影响

2.1.1 均质压力对NSI的影响 由图1可知，当均质压力为60 MPa时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI最高。当均质压力介于 20～60 MPa之间时，花生蛋白的NSI随着压力升高显著增加。这可能是适当高压处理使得蛋白质分子解聚，亚基伸展，致使蛋白质内部的极性基团和亲水基团更大程度地暴露[17]，蛋白质分子表面电荷数量增加，增强了蛋白质的水合作用，从而提高了蛋白质在酸性条件下的溶解性[18]。当均质压力超过60 MPa时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI随着压力升高而显著降低，这可能是由于当蛋白受到的压力过大时，蛋白质暴露的亲疏水基团的平衡被打破[19]，在水中的稳定性有所降低[20]，致使蛋白质絮凝沉淀现象加重，溶解性降低[21]。因此选择均质压力60 MPa为较佳。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.1.2 均质料液比对NSI的影响 由图2可知，当均质料液比为6%时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI最高。当均质料液比介于2%～6%之间时，花生蛋白的NSI随着料液比升高显著增加。当均质料液比大于6%时，花生蛋白的NSI显著降低。这可能是由于溶质的体积过大，会使物料在水中的分散混匀效果变差，不利于植物材料与溶剂的充分接触，也不利于目标化合物的扩散与溶出[22]。若蛋白溶液的料液比较大，在均质过程中会使均质机堵塞，造成仪器的损伤。因此选择均质料液比6%为最佳。

图2 均质料液比对pH值4.0条件下花生蛋白NSI的影响

2.2 中性蛋白酶酶解工艺参数对花生蛋白NSI的影响

2.2.1 加酶量对NSI的影响 由图3可知，当加酶量为500 U·g-1时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI最高。当加酶量介于100～500 U·g-1之间时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI随着酶添加量升高而显著增加，当加酶量大于500 U·g-1时，花生蛋白的NSI显著下降，说明在该底物浓度下，酶浓度已趋于饱和，继续增加蛋白酶用量，对花生蛋白NSI无显著提高，且过度酶解会使蛋白分解成小分子肽，产生苦味影响改性后花生蛋白的应用[23-24]。出于对口感及节约成本的综合考量，选择加酶量为500 U·g-1。

图3 加酶量对pH值4.0条件下花生蛋白NSI的影响

2.2.2 酶解时间对NSI的影响 由图4可知，当酶解时间介于20～50 min时，花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI随着酶解时间的延长显著增加；当酶解时间大于50 min时，随着酶解时间的延长，花生蛋白NSI增加的幅度减小，说明适当延长酶解时间可以使花生蛋白充分酶解，但酶解时间过长，酶的催化活性降低[25-26]。若酶解改性过程过长，水解度控制不佳，蛋白的深度酶解会产生苦味肽，同样影响口感[23]，且酶解时间过长不利于食品工业的实际生产。因此选择酶解时间为50 min。

图4 酶解时间对pH值4.0条件下花生蛋白NSI的影响

2.3 响应面试验结果及回归模型的建立

通过响应面法对均质压力、均质液料比、酶解时间、加酶量4个自变量进行分析，试验方案及结果见表2。

通过增溶试验并对试验测定值进行分析，得到回归方程式，对试验结果进行回归拟合，得到自变量与NSI (Y)的二次多项回归方程为：

Y=34.40+5.71X1+0.59X2+2.02X3+8.18X4-3.36X1X3+2.54X1X4+2.26X2X3+2.26X3X4-5.90X12-2.42X22-3.69X32-7.88X42。

2.4 响应面试验方差分析

表2 响应面试验设计以及实验测定值

2.5 响应面试验交互作用分析

响应面图中曲线越陡峭，表明该因素对花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI影响越大。通过响应面图(图5～图10)及表3显著性分析可知，均质压力与均质料液比、均质料液比与加酶量的交互作用对花生蛋白NSI的影响均不显著；酶解时间与均质压力、酶解时间与均质料液比、加酶量与均质压力、酶解时间与加酶量的交互作用对花生蛋白NSI的影响均显著；通过Design-Expert 软件分析得到最佳改性条件为均质压力79.74 MPa、料液比7.23%，酶解时间48.20 min，加酶量517 U·g-1，此条件下花生蛋白的NSI为39.07%。为证明该响应面结果的可行性，对响应面所得最佳条件进行验证，设5次平行。验证试验测定pH值4.0条件下花生蛋白的NSI为 37.49%，与未改性(4.04%)之间有极显著差异(P<0.01)，与模型预测值接近，说明本研究的响应面结果可靠。

2.6 改性蛋白添加量对蛋白酸性果汁稳定性的影响

将改性后的花生蛋白加入橙汁，静置7 d后均呈现分层现象，不添加蛋白的橙汁也出现分层，符合国家标准橙汁及橙汁饮料中感官要求的状态标准“呈均匀液状，允许有果肉或囊胞沉淀[27]”。根据设备的检测原理， 图11显示不同改性蛋白添加量果汁的 Turbiscan 稳定性图谱的BS曲线，左侧是样品的底部，右端是样品的顶部。如果底部曲线向上移动，则意味着样品反射光增加，说明此区域内样品浓度增加，表明样品体系出现沉淀[28]；顶部曲线向上运动是物质向上漂浮的表现[29-30]。中间曲线移动太多，表明溶液有结块或絮凝现象。将初始扫描样本数据作为0起始线，随着时间的增加，体系的稳定性也发生变化[31-33]。与原始起跑线的偏差越大，稳定性越差[34]。结果表明，3%蛋白添加量的果汁样品溶液体系最稳定，5%蛋白添加量的果汁样品溶液体系稳定性最差，沉淀絮凝情况比其他花生蛋白添加量的果汁严重。

表3 回归方程式系数显著性分析

图5 均质料液比和均质压力对NSI影响的响应面图

图7 加酶量和均质压力对NSI影响的响应面图

图8 酶解时间和均质料液比对NSI影响的响应面图

图9 加酶量和均质料液比对NSI影响的响应面图

图10 加酶量和酶解时间对NSI影响的响应面图

图11 不同改性蛋白添加量果汁的 Turbiscan 背散射光图谱

ΔBS指每两次扫描背散射之间的差值，用于判断每两次扫描间样品体系的变化情况，进而判断样品体系的稳定性。3%蛋白添加量的果汁底部和样品中间部分的ΔBS波动较小，表明蛋白质颗粒的沉淀和絮凝作用不明显。在38～40 mm处有一个小的凸起峰，ΔBS值为1.7%，体系顶部略微有果肉，纤维等杂质上浮。由图11可知，3%蛋白添加量的果汁样品溶液的稳定性与未添加蛋白的果汁差别不大,说明改性后蛋白在果汁体系中稳定性较好。4%蛋白添加量的果汁样品底部(0.0～5.0 mm)ΔBS值为2.7%～3.0%,沉淀情况比3%蛋白添加量果汁样品更明显。样品中间部分存在蛋白质絮凝等波动，在样品的顶部(36.00～40.00 mm)，ΔBS逐渐增加到1.2%。综上，4%蛋白添加量的果汁样品体系比3%稳定性略差。5%蛋白添加量果汁样品在测定的12 h内底部存在蛋白质沉降。样品在4.00～34.00 mm高度范围内，ΔBS为5%，说明样品中部有蛋白的絮凝和聚结，样品顶部(36.00～40.00 mm)出现ΔBS值为9%的上峰值。因此可知，5%蛋白添加量果汁样品的稳定性与其他样品相比较差。

图12体现了不同改性蛋白添加量果汁的Turbiscan稳定性指数(TSI)随时间的变化。此结果与背散射光图谱分析一致，3%改性后蛋白添加量的果汁稳定性最好，平均TSI为1.95，且与未添加蛋白的果汁相比稳定性变化无明显差异；4%改性后蛋白添加量的果汁，平均TSI为2.23，略高于3%蛋白添加量的果汁；5%蛋白添加量的果汁平均TSI为3.29，高于其他蛋白添加量样品，说明5%蛋白添加量果汁稳定性在几种样品中最差。

图12 12 h内不同改性蛋白添加量果汁TSI值

3 讨论

近年来越来越多的研究者采用物理-酶解复合改性方法对植物蛋白进行增溶改性，探究增溶效果更好的物理预处理与酶相结合的方法。改善蛋白质溶解性的物理改性方法主要包括热处理(高温水)、高压均质、超声波处理、高速剪切等。其中，植物蛋白增溶最常用的是高压均质法，高压均质-酶解改性方法操作简单，在以往研究中应用效果较好。赵飞[35]探讨了物理预处理对大豆分离蛋白质结构和分子聚集状态的作用机制, 发现高压均质处理可改变大豆分离蛋白的二级和三级结构, 20和30 MPa高压均质处理使大豆分离蛋白结构由紧实的球状变为多分散线团状，提高其在水中的溶解性。马铁铮[13]采用物理前处理、限制性酶解和高压均质酶解处理工艺对花生浓缩蛋白进行增溶改性，在最优条件下可将花生浓缩蛋白中性条件下NSI平均值提高到 96.57%。但以往研究主要集中于植物蛋白中性条件下的增溶改性，对克服植物蛋白酸性条件下絮凝沉淀的特性，提升其酸性条件下溶解度的研究相对较少；且研究多集中于大豆蛋白的增溶，对花生蛋白酸性条件下的增溶改性的研究还不充分。

基于以往研究，本研究选用高压均质-中性蛋白酶改性方法改性提高花生蛋白酸性条件下的溶解性，可将花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI由4.04%提升至37.49%，改性后蛋白应用于酸性饮料中稳定性良好。提高蛋白在酸性条件下溶解性主要是通过改变蛋白质的分子结构(分子量、表面电荷、疏水性和构象等)从而影响其溶解度等功能性质。植物蛋白在高压均质过程中，均质空化释放的能量改变了蛋白质分子内部空穴和肽链骨架的三维结构，能够更有效地分散蛋白质，进而使其溶解度和稳定性得到提升[34]。高压均质-酶解改性法增溶效果好，绿色安全，可制备出酸性条件下溶解性、稳定性较好的花生蛋白。

酸溶性植物蛋白在食品领域中具有极大的应用潜力，近年国外一些企业开展了对酸溶性植物蛋白的研究和应用，美国Archer Daniels Midland公司研制出一款既澄清又具有完全蛋白营养的大豆分离蛋白CLARISOY，可将其应用于pH值低于4.0的酸性饮料中，溶解后溶液澄清，稳定性良好[2]。郭睿[36]对大豆蛋白采用植酸酶酶解后进行循环超滤渗滤浓缩，将处理过后的浓缩蛋白液经巴氏杀菌、喷雾干燥得到酸溶性大豆蛋白产品，所得蛋白在pH值3.0～4.0条件下NSI高达45%～90%；将其溶解于果汁饮料、运动饮料等酸性溶液中可制备各种功能饮料。酸性条件下具有高溶解度植物蛋白的潜在应用领域广泛，相关研究也日渐增多。但以往研究的酸性可溶蛋白种类主要集中在大豆蛋白上，有关酸性可溶花生蛋白等其他植物蛋白的研究较少，且酸性可溶花生蛋白的相关专利仍较为匮乏，通过改性提高花生蛋白在酸性条件下的溶解性是产业需要迫切解决的瓶颈。但是在改性方法、性质研究和应用方面仍存在以下问题:

(1)对增溶改性后酸性可溶植物蛋白理化性质和功能特性方面的表征不够全面，改性后植物蛋白在酸性条件下能够稳定的机理还有待进一步研究。

(2)虽然近年来国内外在提高植物蛋白酸性溶解性方面开展了相关研究，但目前市场上此种类产品较少，且存在应用于果汁饮料体系当中难以稳定易产生沉淀、应用于运动饮料体系中澄清度低等问题。

因此，本研究致力于开发绿色高效、更适用于工业生产的酸溶性花生蛋白改性制备方法，同时满足消费者对营养饮料、功能饮料的多元化需求，以期为酸性条件下蛋白改性增溶研究奠定基础。

4 结论

本研究建立了高压均质-中性蛋白酶酶解改性花生蛋白的复合工艺。对高压均质和中性蛋白酶酶解的各项条件进行优化，并进行响应面分析得到了高压均质-中性蛋白酶酶解改性的最优参数为均质压力79.74 MPa、料液比7.23%，酶解时间48.20 min，加酶量517 U·g-1， 可将花生蛋白在pH值4.0条件下的NSI由4.04%显著提升至37.49%。将改性后的花生蛋白添加到酸性果汁饮料中，通过稳定性分析确定了改性蛋白的最优添加量为3%。本研究利用复合改性方法制备了在酸性条件下具有较好溶解性和稳定性的花生蛋白，并将其应用到酸性果汁饮料中，为明确蛋白质导致酸性饮料分散体系不稳定的机理提供了理论依据，为花生蛋白的资源开发以及未来其在酸性饮料中应用提供了技术支持。