三文鱼皮四种蛋白酶酶解物抗氧化活性及功能特性的差异研究

张晓頔 张益奇,2,3 朱 凯 郭丽平 陈 康,2 戴志远,2,3,*

(1 浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310035；3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116000)

2019年世界水产总量超2亿t，我国水产品总产量为6 480万t[1]。水产品在加工过程中会产生头、皮、骨、鳞、内脏等副产物，占总重的40%～55%。这些副产物除部分被用作化肥和饲料外，其余大部分作为垃圾被丢弃，不仅造成了严重的资源浪费，而且给环境保护带来了极大的压力[2]。因此，亟待开发新的有效技术，让水产品副产物得以高附加值化利用。鱼副产物含有丰富的蛋白质，水解后为多肽或小分子肽类，经分离纯化后得到的特定肽段具有某些生物活性，更具经济效益，也可在一定程度上改善环境问题[3]。蛋白酶解物具有良好的生物活性，尤其是抗氧化活性肽能够清除体内过剩的活性氧自由基等，具有防止机体机能受损，维持正常生长代谢的功能[4]，已然成为近年来学界的研究热点。

在全球加工的所有鱼类中，三文鱼(Salmon)占比较大，近年来被大量进口到我国。三文鱼富含蛋白质、ω-3脂肪酸和矿物质等营养成分，是近年来深受消费者喜爱的生身食品，但三文鱼加工过程中也会产生大量的副产物。三文鱼皮蛋白质含量高，氨基酸组成平衡[5]，是制备酶解物的优良资源。酶解是获得具有抗氧化活性三文鱼皮肽的主要方式，通过酶解改性，可提高三文鱼皮蛋白的抗氧化活性并改变其功能特性[6]。同时，有研究表明在酶解过程中，蛋白酶的选择对于蛋白酶解物抗氧化活性的高低至关重要。但目前关于三文鱼皮酶解物的研究多采用特定的蛋白酶或酶制剂进行酶解，而针对不同蛋白酶对其抗氧化活性和功能特性的差异研究还不够全面。因此，本研究采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶3种内切酶和风味蛋白酶(外切酶)对三文鱼皮进行酶解，对比不同蛋白酶的酶解效果以及4种三文鱼皮酶解物的抗氧化活性与功能特性，以期为三文鱼皮在生产中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼皮，悦胜行贸易有限公司；中性蛋白酶(Neutrase®0.8 L)、碱性蛋白酶(Alcalase®AF 2.4 L)、风味蛋白酶(Flavourzyme®500 MG)、复合蛋白酶(Protamex®)，丹麦Novozymes公司；碳酸酐酶、细胞色素C、抑肽酶、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、菲洛嗪(Ferrozine)，美国Sigma公司；BCA(bicinchoninic acid)试剂盒，南京碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；400Y多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；e2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；Spectra MAX 190 酶标仪，美国Molecular Devices公司；DSHZ-300A旋转式恒温振荡器，太仓市实验设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼皮前处理 将新鲜鱼皮残留的碎肉和脂肪剔除后清洗干净，切成小块，置于45℃干燥箱中烘干至质量恒定，用粉碎机粉碎成40目的颗粒，密封保存。

1.3.2 酶解工艺 三文鱼皮粉末与蒸馏水按1∶6(m∶v)的比例混合匀浆，按表1所设计的试验条件调节混合液的温度和pH值，将4种蛋白酶分别按8 000 U·g-1的比例加入到混合液中。在酶解过程中通过连续加入0.1 mol·L-1HCl或NaOH来维持反应液的最适pH值。酶解反应4 h后，95℃加热10 min灭活蛋白酶，8 000 r·min-1离心10 min。去除上层油脂，收集上清液冷冻干燥后-20℃储存，备用。

表1 蛋白酶酶活、最适温度和最适pH值

1.3.3 水解度(hydrolysis degree，DH)的测定 采用pH-stat法[6]测定DH，按照公式计算DH：

(1)

式中，B为酶解过程中消耗的NaOH体积，mL；Nb为NaOH浓度，mol·L-1；Mp为底物中蛋白质总量，g；α为α氨基的平均解离度；htot为底物中蛋白质肽键总数。

1.3.4 三氯乙酸可溶性氮(trichloroacetic acid-soluble nitrogen，TCA-NSI)得率的测定 利用20% TCA沉淀蛋白并结合BCA试剂盒测定酶解物中TCA-NSI得率[7]。

1.3.5 分子质量分布的测定 参照董烨等[7]的方法，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)测定酶解物的分子质量。色谱柱为TSK-gel G2000SWxl(7.8 mm×30 mm)，流动相为乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(v∶v∶v)，柱温：30℃，流速：0.5 mL·min-1；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。样品质量浓度为10 mg·mL-1，0.45 μm的滤膜过滤。以碳酸酐酶(29 000 Da)、细胞色素C(12 400 Da)、抑肽酶(6 500 Da)和HHL(429 Da)为标准品作分子质量校正曲线。将样品的色谱数据代入校正曲线计算方程，得出酶解样品的分子质量及分布范围。

1.3.6 体外抗氧化活性的测定

1.3.6.1 羟基自由基(·OH)清除率的测定 依次加入0.2 mL超纯水、0.05 mL 9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液、0.2 mL样品溶液、0.05 mL 9 mmol·L-1FeCl2溶液和0.05 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液，混匀后于37℃反应30 min，在510 nm波长处测吸光度值[8]。根据公式计算·OH清除率：

(2)

式中，A1为样品的吸光度值；A2为0.05 mL超纯水代替FeCl2溶液测得的吸光度值；A3为0.2 mL超纯水代替样品溶液测得的吸光度值。

1.3.6.2 Fe2+螯合活性的测定 取4.7 mL样品溶液与0.1 mL 20 mmol·L-1FeCl2溶液混合均匀，室温静置反应30 min，加入0.2 mL 5 mmol·L-1Ferrozine，室温反应10 min，在562 nm波长处测吸光度值[2]。根据公式计算Fe2+螯合活性：

(3)

式中，A1为样品的吸光度值；A2为超纯水代替样品溶液测得的吸光度值。

1.3.6.3 还原力的测定 取1.0 mL样品分别与2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mmol·L-1，pH值6.6)和2.5 mL 1%(m/v)K2Fe(CN)6混合，于50℃反应20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应。反应液以6 000 r·min-1离心5 min，取2.5 mL上清液加入1 mL 0.1% FeCl3溶液，于50℃反应10 min。在700 nm波长处测吸光度值，反应物的吸光度值增加表示还原力增加[6]。空白组为蒸馏水代替FeCl3溶液。

(4)

式中，V1为样品组的邻苯三酚自氧化速率；V2为空白组的邻苯三酚自氧化速率。

1.3.7 功能特性的评价

1.3.7.1 溶解性的测定 取0.20 g样品溶解于20 mL蒸馏水中，搅拌10 min后，5 000 r·min-1离心10 min，采用BCA试剂盒测定上清液的蛋白质含量[10]。根据公式计算溶解性：

(5)

式中，A为上清液蛋白质含量；B为样品蛋白质含量。

1.3.7.2 持水及持油性的测定 取1 g样品分散在10 mL水或色拉油中，振荡3次，每次2 min，放置2 h后4 000 r·min-1离心15 min，将上清液倒出后称重[11]。根据公式计算持水性和持油性：

(6)

式中，m为样品的质量，g；m1为离心管和沉淀物的总质量，g；m2为离心管和样品的总质量，g。

1.3.7.3 乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化稳定性(emulsifying stability index，ESI) 根据Noman等[11]的浊度法测定。取蛋白浓度为10 mg·mL-1的溶液与5 mL色拉油混匀，12 000 r·min-1均质2 min后，从底部吸取样液0.1 mL，用10 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液进行稀释。分别于0和10 min在500 nm波长处测定其吸光度值，以SDS溶液作为空白对照。根据公式计算EAI和ESI：

(7)

(8)

式中，dil为稀释倍数；A为乳化液的吸光度值；C为样品浓度，g·mL-1；φ为乳化液中油相的比例；A0为初始乳化液的吸光度值；At为10 min时的吸光度值。

1.3.8 数据分析 试验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示，用SPSS 21.0统计软件进行方差分析(ANOVA)，采用多重比较分析法对各组进行显著性检验(P<0.05)，用Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶种类对三文鱼皮酶解效果的影响

DH用来描述蛋白质酶解的程度，DH值增加表示在酶解过程中裂解了更多的肽键。如图1所示，碱性蛋白酶酶解产物的DH为20.18%，显著高于其他组(P<0.05)，风味蛋白酶酶解产物DH最低。三文鱼皮经酶解后酶解物TCA-NSI得率显著增加，且碱性蛋白酶酶解物TCA-NSI得率显著高于其他组，风味蛋白酶酶解产物的TCA-NSI得率最低。对DH和TCA-NSI得率进行相关性分析发现，酶解产物中DH与TCA-NSI得率呈正相关(r=0.984)。

注：不同字母表示同一指标间差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 分子质量分布情况

图2为标准品相对分子质量分布色谱图，根据其对数与Kav值作曲线，得到标准曲线方程为y=-0.197 9x+6.857 6(R2=0.991 5)。

图2 标准品相对分子质量分布色谱图

由表2可知，与未酶解相比，4种酶解产物的分子质量分布总体表现为：样品中含有大量的小分子肽(<3 000 Da)。4种蛋白酶酶解产物中多肽分子质量分布表现出一定的差异性。碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解产物中低聚肽(<1 000 Da)含量分别达84.97%和65.71%；而中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解物中低聚肽含量只有32.76%和58.00%。根据酶解产物的分子质量，三文鱼皮的酶解效率从大到小依次为碱性蛋白酶>复合蛋白酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶。

2.3 抗氧化活性

表2 三文鱼皮酶解产物的分子质量分布

2.4 评价三文鱼皮蛋白酶解物的功能特性

2.4.1 溶解性 溶解性是蛋白质最重要的功能特性之一，其会进一步影响乳化性、流变性等功能特性[11]。溶解性与酶解物在食品、医药和其他工业中的应用密切相关[10]。由图4可知，三文鱼皮经蛋白酶酶解后，其产物的溶解性显著增加，其中碱性蛋白酶酶解物的溶解性(87.21%)显著高于其他组(P<0.05)。溶解度的增加可能与酶解后产物的粒径变小，形成了更多小分子肽有关[13]，而且氨基酸形成的羧基和氨基，也会增加酶解物的亲水性[14]。由于蛋白酶酶解三文鱼皮时会产生特定的多肽谱，因此不同酶解产物具有不同的溶解性。

2.4.2 持水及持油能力 持水性和持油性是蛋白酶解物在工业应用中的重要特性。由表4可知，所有蛋白酶均提高了三文鱼皮酶解物的持水性和持油性。经碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解的产物持水性较高，分别为26.92和23.87 g·g-1。持水性的差异可能与每种酶解物的肽组成，以及在持水性中起关键作用的、分子质量不同的多肽有关[6]。结合前面的试验结果表明，当酶解物DH处于较高水平时，其持油性较差。经中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解的产物持油性较好，分别为4.67和3.35 g·g-1，显著高于碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解物(P<0.05)。

注：不同大写字母表示同一酶解物不同浓度间存在显著差异(P<0.05)；不同小写字母表示相同浓度下各酶解物间存在显著差异(P<0.05)。

表3 三文鱼皮酶解产物抗氧化活性的IC50值

表4 三文鱼皮酶解产物的持水性和持油性

图4 三文鱼皮酶解产物的溶解性

2.4.3 乳化性能和乳化稳定性 可通过测定乳液在500 nm波长处的浊度来衡量酶解产物的乳化性能[11]。三文鱼皮酶解物是小分子肽段，含亲水基团和疏水基团，因此可以促进水包油乳液的形成[15]。EAI越高，说明分散的脂肪球越细、数量越多，酶解物的乳化性能越好[13]。由图5可知，不同酶解物的EAI和ESI均显著高于未酶解的三文鱼皮蛋白(P<0.05)。中性、碱性、风味和复合蛋白酶酶解物的EAI分别为空白组(4.92 m2·g-1)的3.0、2.2、2.6和2.6倍，ESI分别为空白组(20.95%)的3.8、3.0、4.0和3.3倍。

图5 三文鱼皮酶解产物的乳化性和乳化稳定性

3 讨论

三文鱼皮蛋白中疏水性氨基酸占比达35.63%[16]，碱性蛋白酶可作用于疏水性或芳香族氨基酸的肽键，而风味蛋白酶仅将蛋白水解成较大片段的多肽[17-18]。因此三文鱼皮碱性蛋白酶酶解物的DH相对较高，风味蛋白酶酶解物的DH较低。本研究表明酶解物的DH值与分子质量呈负相关，与Alavi等[6]的研究结果一致。此外，有研究发现分子质量与抗氧化活性呈负相关[19]，分子质量小于3 000 Da的多肽具有良好的抗氧化活性[20]，这与本研究结果相一致。在本研究中，碱性蛋白酶酶解物的抗氧化活性显著高于其他酶解物，酶解产物的抗氧化活性主要取决于分子质量和疏水性氨基酸的含量[21]，而碱性蛋白酶的酶切位点主要是疏水性氨基酸C末端的肽键，进而碱性蛋白酶提高了产物的抗氧化活性。Zhang等[22]利用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解鲢鱼鳍发现，碱性蛋白酶酶解产物具有较强的Fe2+螯合活性；Sinthusamran等[23]将鲑鱼骨酶解后，碱性蛋白酶酶解物的DH和抗氧化活性显著优于其他组，这与本研究结果相一致。因此，从提高三文鱼皮蛋白酶解物生物活性的角度出发，碱性蛋白酶是酶解三文鱼皮的最佳用酶，中性蛋白酶和复合蛋白酶其次，风味蛋白酶的作用效果最差。

本研究发现，碱性蛋白酶酶解产物的溶解性显著高于其他酶解物。酶解物在高DH水平下的溶解性极好，这可能由于在较高的DH下，酶解物中更多的小分子肽类与周围水分子形成更广泛的氢键[6]。有研究表明，较高DH的酶解物会表现更优的溶解性[24]，这与本试验结果一致。这可能是由于随着酶解时间的延长，大量极性基团(如-COOH和-NH2)被释放出来，改善了酶解物的溶解性和吸水能力[25]。并且在反应过程中，蛋白质的三级结构伸展性增大，也会加强水分子与蛋白分子间的相互作用[26]。持油性与蛋白质的种类、来源、加工方法等因素有关，持油性会影响酶解物的乳化性[27-28]。Alavi等[6]研究表明，DH与持油性呈负相关，这与本试验研究结果一致。Noman等[11]研究表明中华鲟酶解物的持水性和持油性分别为1.93 g·g-1、 2.59 g·g-1，本试验酶解物的持水性高于中华鲟酶解物，但持油性低于中华鲟酶解物，这可能是原料不同，酶解过程中释放出的亲水性极性侧链不同。

本研究发现，不同酶解物的EAI和ESI均显著高于未酶解的三文鱼皮。在蛋白酶的作用下，三文鱼皮蛋白结构中的疏水基团逐渐暴露，有利于酶解物与油滴的结合，从而提高酶解物的乳化能力[29-30]。本研究中，碱性蛋白酶酶解物乳化性较差；中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解物因同时具有疏水和亲水基团，可能会在乳化油滴的表面形成更具粘弹性的薄膜，因此表现出较好的乳化性[9]。本试验各酶解物的EAI和ESI均与DH呈负相关，这与Lee等[31]和Amiza等[32]研究结果相一致。

4 结论

本研究分析了4种蛋白酶对三文鱼皮蛋白水解程度和酶解产物抗氧化活性及功能特性的影响，结果表明，碱性蛋白酶酶解物的水解程度、抗氧化活性、溶解性和持水性均最高；中性蛋白酶酶解物的持油性和EAI最强；而风味蛋白酶酶解物虽然抗氧化活性最差，但ESI最高。综上所述，碱性蛋白酶为制备三文鱼皮蛋白抗氧化肽的最优蛋白酶。下一步应重点对其活性肽段进行分离、纯化与鉴定，并进行细胞水平及动物体内的抗氧化活性评价。