海带配子体保存过程中污染菌的分离纯化及药敏试验

武瑞娜，王娜，罗世菊，李晓婕

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台264003）

海带配子体是海带种质资源的重要保存形式，海带配子体在生长过程中常会受到细菌、真菌、等病原生物的危害，导致配子体发病死亡。海带的雌配子体和雄配子体发病情况相类似，在显微镜下观察，配子体在发病初期，细胞壁变厚变黑，色素体聚集颜色变暗，生长速度减慢甚至不再生长，之后产生质壁分离，最后色素全部分解，只剩细胞壁空壳，从而导致配子体最后死亡[1]，因此防控细菌、真菌污染是海带配子体克隆保存过程中需要解决的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料：该实验室保存过程中发生污染的海带配子体克隆。

固体培养基：液体增菌培养基，营养琼脂培养基，马铃薯-葡萄糖-琼脂（PDA）培养基由该实验室自行配制。

药敏纸片：大部分由微生物试剂公司提供，个别如先锋霉素药敏纸片由研究室自制。

试剂：PCR试剂购于上海生工，PCR产物测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 将污染的海带配子体及培养液，在固体培养基上三区划线，进行培养，然后挑出单个菌落，最后获得纯培养。

1.2.2 DNA提取 取纯培养的细菌和真菌接种于液体培养基中过夜培养，收集细菌和真菌。细菌DNA提取采用SDS法，真菌采用CTAB法。提取的DNA加入100μL的双蒸水溶解，-20℃保存。用核酸蛋白浓度测定仪测定DNA的浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.2.3 PCR反应 细菌PCR选用16s rDNA通用引物27F与1492R（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反应体系（50μL）：10×PCR buffer 5μL，25 mM MgCl23μL，d NTP 1μL，上下游引物各1μL，2.5 U的TaqDNA polymerase（上海生工公司）0.5μL，DNA模板0.5μL，双蒸水38μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30个循环）；72℃最后延伸10 min。

真菌PCR扩增ITS片段，选用通用引物ITS1与ITS4(由上海捷瑞公司合成)，引物序列如下：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系（25 ul）：10×PCR bufer 2.5μL，25 mM MgCl22μL，d NTP 0.5μL，引物1TS1与ITS4各0.5 L，2.5 u的Taq DNA polymerase（上海生工公司）0.25 uL，DNA模板0.5μL，双蒸水l8.25μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30个循环），72℃最后延伸10 min。取5μL PCR产物，进行1%琼脂凝胶电泳，紫外灯下检测。

1.2.4 药敏试验 将纯培养得到的真菌、细菌接种在液体培养基中连续培养，制备合适浓度的菌液，均匀涂布于固体培养基表面，等待至表面无明显菌液后，将药敏纸片分别贴在培养基表面，分别放在35℃（细菌）和28℃（真菌）连续倒置培养。按照抑菌圈的大小判断菌株对药物的敏感度。设置标准为：抑菌圈直径小于10 mm，定为对此药物不敏感；抑菌圈直径在10~15 mm之间，定为对此药物中度敏感；抑菌圈直径大于15 mm，定为此对药物高度敏感[2]。

2 结果

2.1 细菌和真菌的培养特性

配子体克隆被微生物污染后，细菌（编号为01016XJ）附着在克隆体表面呈絮状，见图1E。真菌（编号为01016C和01016X）缠绕在克隆之间，见图1B和1C。

细菌分离出的单个菌落（图2）中等大小，圆形，灰白色，格兰氏染色显示为阴性杆菌。

真菌01016C长出的菌落（图3-A，C）为白色棉絮状，开始时菌丝放射状生长明显，后期匍匐生长，可以布满整板，在液体培养基中成团或絮状生长。在倒置显微镜下（图4-A，C），菌丝长且直，孢子长椭圆状，有的略带弯曲，形状均一，内有分隔，3~5个不等。

真菌01016X（图3-B，D）菌落生长速度比粗丝慢，菌落小，不可以铺满整板，略带淡黄绿色，在液体培养基中均匀浑浊生长。在倒置显微镜下（图4-B，D），菌丝弯曲，分枝多。孢子呈哑铃状，长椭圆状等多种形状，有的可见2个分隔，其中可见长的散在的分枝。

图1 被真菌和细菌污染的克隆（400×）

图2 细菌单个菌落和革兰氏染色

图3 真菌的分离培养

2.2 PCR结果

图4 两株真菌显微镜下菌丝和孢子形态

利用真菌18 s rDNA通用引物和细菌16 s rDNA通用引物扩增出来的目的条带长度分别位于500~700 bp之间和1 600 bp左右（见图5）与预期大小一致。

图5 真菌01016C、真菌01016X和细菌01016XJPCR琼脂糖凝胶电泳

2.3 序列比对结果

将所测的基因序列在GenBank中比对发现，与真菌01016C 18 s rDNA ITS序列同源性较高的都是镰刀菌属真菌（Fusarium），同源性为100%。与真菌01016X 18 s rDNA ITS序列同源性较高的是丛赤壳属真菌（Nectria），同源性为99%。与细菌01016XJ 16 s rDNA序列同源性较高的是γ一变形菌纲盐单胞菌属（Halomonas），同源性为99%。

真菌通过ITS区域比对，序列相似性≥99%，判定为相同种；序列相似性≥95%且＜99%，判定为相同属；序列相似性＜95%，判定为同科[3]。对于细菌一般认为16 s rDNA序列相似性≥99%，可以认为是同一个种；序列相似性≥95%且＜99%，判定为相同属；序列相似性在93%～95%之间，可以认为是不同的属[4]。

因此，依据上述结果该试验所分离的真菌01016C为镰刀菌属真菌，真菌01016X为丛赤壳属真菌，细菌01016XJ为盐单胞菌属细菌。

2.4 药敏试验结果

真菌药敏试验的结果见表1。结果显示真菌01016C对制霉菌素中度敏感；真菌01016X对制霉菌素中度敏感，对先锋霉素则是高度敏感（表1），细菌菌株01016XJ的药敏试验结果见表2。

表1 两株真菌对6种药物的药敏试验结果

表2 细菌药敏试验结果

3 讨论

镰刀菌属（Fusarium）是真菌中的一属。它在自然界中分布极广，在土壤、淡水和海水中均有分布，而且分类系统极为复杂，形态变化差异很大。它可侵染多种植物，造成植物的叶片萎焉、根系腐烂、果穗腐烂等好多类型的腐烂病症，从而引起产量严重下降，造成巨大的经济损失。镰刀菌的有性时期分别属于肉座菌科（Hypocreaceae）的赤霉属（Gillerella）、丛赤壳属（Nectria）、丽赤壳属（Calonectria）和小赤壳属（Micronectriella）等[5]。该试验中分离得到两株真菌01016C和01016X虽然从形态上有较大差别，但仍然不排除是一种真菌的不同时期，要确定这两株真菌是不是属于一种真菌的不同的时期，属于哪种时期，还有待进一步的深入研究和探讨。

盐单胞菌（Halornonas）是一类能在NaC1质量分数为0～5.13 mol/L条件下生长的嗜盐盐微生物，在盐湖、盐场、盐碱地、海冰和海洋等环境中都有分布。嗜盐微生物主要包括嗜盐古菌和嗜盐细菌。嗜盐古菌在分类学上，主要属于盐杆菌科，嗜盐细菌则广泛分布在细菌域的分枝中[6]。该试验分离出的细菌从培养特性和16 s rDNA序列同源性比对结果都符合盐单胞菌属特性，后续可以进行更多的实验，如生化试验、耐盐度试验、温度试验等，进一步对此菌的特性和归属进行更细致的研究。

目前还没有海带配子体克隆受多种微生物污染的相关报道，该试验中受上述微生物污染的海带配子体克隆表现为生长缓慢，色素减少，甚至死亡的症状，这些症状是3种微生物共同作用的结果，还是其中一种或两种作用的结果，是由于微生物分泌毒素，还是其他原因仍需进一步研究。此外药敏试验的结果也为配子体克隆的污染筛选出了最佳的治疗药物，为种质保存工作中微生物污染的防治提供了一定的理论依据。