ELISA法测定番茄茎叶中的褪黑素含量

胡永静，潘光军，龙 慧，皮 毅，张才鲜，明方艳，谷 佳，陈阿敏，须 文

（贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025）

20世纪50年代后期，研究人员在牛的松果体中发现并鉴定了色氨酸的衍生物——N-乙酰-5-甲氧基色胺，即褪黑素[1-2]。进入21世纪以来，研究者对褪黑素在动物体内的作用进行了深入研究。它是一种非常有效的自由基清除剂[3]，能清除包括活性氧、活性氮等在内的自由基过氧化物。褪黑素一直被认为是动物特有的激素，直到1993年，人们在高等植物中也发现褪黑素的存在[4]，随后研究发现其在植物中也是普遍存在的[5]。在植物体的不同器官（如根和叶）、不同组织中、不同发育阶段，褪黑素的含量并不相同。

非生物和生物胁迫都已被证实可以诱导植物体内褪黑素的合成。在胁迫条件特别是氧化应激下，褪黑素含量的代偿性增加，反过来有助于缓解胁迫环境造成的不良后果。已经报道含有褪黑素的植物主要是中草药和食用植物[6]。相对于中草药植物，日常食用的蔬菜水果中褪黑素含量较少，芸薹属油料作物的种子中褪黑素含量较高，接近200 ng/g。番茄果实中的褪黑素含量很低。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的病害，是造成保护地番茄减产的主要原因之一[7]，目前生产上主要以农药防治为主，但存在着农药残留及环境污染的问题。鱼腥草是一种重要的药食兼用蔬菜，在贵州各地均有种植。鱼腥草提取液中的多种活性成分具有较强的抗菌特性[8]。鱼腥草提取液预处理能不能增强番茄对灰霉菌的抗性？如果能够增强，这种抗性的加强与内源褪黑素含量的增加有没有关系？为了回答这些问题特进行此次试验。

褪黑素的测定方法主要有生化免疫方法、紫外分光光度法、色谱法及色谱-质谱联用法等[9]。酶联免疫吸附试验（ELISA）是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。目前利用该技术来测定动物体内的褪黑素含量已有很多文献报道[10-15]，但是还鲜少有文献报道采用ELISA法来测定植物中的褪黑素含量。试验采用ELISA法测定正常番茄幼苗茎叶中的褪黑素含量，以及鱼腥草提取液预处理和接种灰霉菌孢子后的茎叶中的褪黑素含量，以探讨ELISA法测定番茄中褪黑素含量的有效性，也为进一步研究鱼腥草的有效利用和增强生产上番茄对灰霉病的抗性提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试番茄材料为浙杂809，种子购于浙江浙农种业有限公司；供试番茄灰霉菌由浙江大学蔬菜研究所师恺教授惠赠；鱼腥草采自贵州大学蔬菜教学科研基地；褪黑素标准液购自北京绿源伯德生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄育苗

试验在贵州大学农学院园艺专业基础实验室进行。2017年9月23日将番茄种子用55 ℃温汤浸种15 min，然后置于垫有双层湿润滤纸的培养皿中，于28 ℃恒温箱中避光催芽。9月25日，当种子胚根长为种子直径1/2时，将种子播在V（泥炭）∶V（蛭石）∶V（珍珠岩）＝3∶1∶1的混合基质填充的50孔穴盘中，置于平均温度为白天25 ℃，夜间22 ℃环境中，相对湿度70%，光周期为照光14 h，黑暗10 h，光照强度保持在300mol/（m2·s）的室内培养架上培养。10月5日，番茄苗真叶显露。10月15日，将2叶1心的幼苗移栽于15 cm直径的塑料钵中，培养基质与播种用基质相同。每3 d用N-P2O5-K2O+TE（20-20-20+TE）的水溶肥稀释1 000倍后浇灌幼苗。

1.2.2 番茄茎、叶中褪黑素含量测定

待番茄幼苗长到4叶1心期时，取鲜样测定其茎叶中的褪黑素含量。取样方法：分别从9株植物上取叶片和茎的样品，3株为1个重复，每1个重复取0.3 g，共3次重复。

褪黑素的含量测定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被褪黑素抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的褪黑素呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值）。褪黑素标准品的浓度依次为：0、50、100、200、400、800 pg/mL，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，计算样品浓度。

1.2.3 鱼腥草提取液处理对灰霉菌发病情况及茎、叶中褪黑素影响试验

当番茄长到4叶1心时进行鱼腥草和灰霉菌处理的相关试验。选取生长健康、长势一致的番茄幼苗进行鱼腥草[13]提取液预处理，全株茎叶等部位均匀喷施，对照为蒸馏水处理；24 h后，在叶面、主茎部位均匀喷施番茄灰霉病菌溶液，对照为蒸馏水处理。具体操作方法如下：

鱼腥草提取液处理：准确称取研碎后的鱼腥草地下茎10.0 g，置于250 mL的烧瓶中，按料液比1∶20（g/mL） 加入浓度70%的乙醇溶液，于80 ℃水浴锅中回流浸提以提取地下茎中的抑菌活性成分；将稀释500倍的鱼腥草提取液进行番茄叶面及主茎喷施预处理，均匀喷施于植株表面。番茄灰霉病菌接种处理：24 h后，用浓度为2×105CFU/mL的灰霉菌孢子悬浮液在鱼腥草提取液处理后的番茄叶面、主茎部位均匀喷施，以空白悬浮液试验作为对照（表1）。

接种后保持空气湿度90%以上，待植株发病（2～3 d）后观察植株发病情况，并取样测定叶片的褪黑素含量，取样方法同1.2.2。

1.2.4 数据分析

利用Excel 2010、DPS和Origin软件进行试验数据的统计、整理、分析和作图。

表1 试验设置

2 结果与分析

2.1 正常生长的番茄茎、叶褪黑素检测结果分析

如图1所示，正常生长的番茄叶片和茎的褪黑素含量之间差异极显著，叶片的褪黑素含量达14.53 ng/g，茎的褪黑素含量为2.80 ng/g，叶片的褪黑素含量是茎的5.19倍。

以褪黑素标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制得到标准品线性回归曲线方程为：y＝0.930 6x＋0.014 1（R2＝0.997 9）。试验结果表明，ELISA法可以检出的番茄茎叶中的褪黑素含量高于2.60 ng/g，就灵敏度而言，ELISA法完全可以用来检测植物番茄茎叶中的褪黑素含量。

2.2 鱼腥草提取液和灰霉病侵染对番茄茎、叶的褪黑素含量的影响

为研究鱼腥草提取液对番茄灰霉菌是否有抑制作用，特进行预处理后接种灰霉菌的试验。表型结果如图2所示，番茄植株接种灰霉菌后（T3、T4）叶片尖端有部分萎蔫的表现，叶背面可见分散的病斑点。鱼腥草提取液预处理的叶片（T4）发病比水处理（T3）的叶片发病病状轻一些。另外，灰霉菌侵染番茄茎部，表型无差异。

图1 正常生长的番茄茎叶的褪黑素含量

图2 鱼腥草提取液预处理后的番茄叶片对番茄灰霉菌侵染的表型响应

由图3可知，经灰霉菌侵染后（T3、T4），番茄叶片的褪黑素含量显著增加，其中蒸馏水预处理的（T3）叶片褪黑素含量为17.71 ng/g，而鱼腥草提取液预处理的（T4）为17.82 ng/g，两者差异不显著；而未经灰霉菌侵染的处理（T1、T2）分别为13.53、16.03 ng/g，其中，鱼腥草提取液预处理的叶片（T2）褪黑素含量显著高于未侵染水处理对照（T1）的褪黑素含量。由于灰霉菌侵染和鱼腥草提取液处理对茎部表型无影响，故未测其褪黑素含量。

图3 鱼腥草提取液和灰霉菌侵染对番茄叶片的褪黑素含量的影响

3 结论与讨论

试验探讨了利用ELISA法测定番茄茎叶中的褪黑素含量。结果表明：利用ELISA法可以检出的番茄茎、叶中的褪黑素含量高于2.60 ng/g，就灵敏度而言，ELISA法完全可以用来检测番茄茎、叶中的褪黑素含量。对更为准确的褪黑素含量测定则有赖于HPLC法等方法，但作为定性和准确度要求不高的试验，ELISA法则是更加方便快捷的方法之一。

鱼腥草提取液叶面喷施处理，以及灰霉菌侵染都引起番茄叶片褪黑素含量显著增加，而且鱼腥草提取液预处理有助于减轻番茄茎叶上的灰霉病发病症状；但是这种发病症状的减轻与叶片内源褪黑素含量的增加似乎没有太大的联系，因为不管是鱼腥草提取液预处理还是蒸馏水预处理的发病植株，其叶片的褪黑素含量之间没有显著差异，有可能依赖其他抗性诱导途径。可以肯定的是鱼腥草提取液预处理后番茄叶片褪黑素含量明显增加，植物内源褪黑素含量的增加有助于增强植物应对各种非生物和生物胁迫的抗性[16-19]，这一结论已经被许多研究报道所证实。