抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

李允静，肖芳，武玉花，李俊，高鸿飞，翟杉杉，梁晋刚，吴刚

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

李允静1，肖芳1，武玉花1，李俊1，高鸿飞1，翟杉杉1，梁晋刚2，吴刚

1中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室/农业农村部植物生态环境安全监督检验测试中心（武汉）/农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室，武汉 430062；2农业农村部科技发展中心，北京 100176

【目的】抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法，为抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证，采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性，利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合，建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性qPCR方法，扩增片段为138 bp，优化的反应体系引物终浓度为0.4 μmol·L-1、探针终浓度为0.2 μmol·L-1；IND-ØØ41Ø-5和标准曲线的线性动力学范围为33—83 190 copies的基因组DNA，该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-ØØ41Ø-5测试样品，偏差和相对标准偏差（RSD）均小于25%；确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%，且具备良好的实验室间重复性和再现性，经测量不确定度预评定后，获得5份抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5测试样品的测量结果分别为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，能够实现抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分的精准定量检测。

转基因；抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5；转化体特异性；实时荧光定量PCR

0 引言

【研究意义】据国际农业生物技术应用服务组织统计，在世界范围内，转基因大豆的种植面积最大，2019年种植面积达9 190万hm2，占全球转基因种植面积的48%。在世界范围内，31个国家/地区批准了38个转基因大豆转化体，用于种植或进口加工[1]。近年来，中国转基因大豆进口量维持在8 000万t以上[2]。截至2022年3月，中国已审批进口用作加工原料安全证书转基因大豆转化体20个[3]。随着中国需求的不断增长和人们食品消费结构的持续升级，中国对转基因大豆的需求量必定会不断增加。同时，转基因技术迅速发展及其应用，使得转基因产品安全性备受社会各界关注。各个国家根据自身国情制定了不同的管理政策和措施，如加拿大采取自愿标识管理政策，欧盟、韩国、日本等国家分别设置0.9%、3%和5%的标识阈值进行管理[4]。目前，中国规定对列入目录的转基因大豆、玉米、棉花、番茄等5类17种产品实施定性强制标识[5]。随着中国生物技术的不断发展进步，为了更好地保护消费者的知情权和选择权，与国际接轨，转基因生物定量标识管理是未来发展的必然趋势。然而，建立特异、准确、灵敏、标准化的定量检测方法，是定量标识管理制度顺利实施和转基因生物有效监管的重要技术保障。【前人研究进展】目前，基于DNA水平的转基因成分检测是最主要、应用最广泛的方法[6]，除了传统的定性PCR和实时荧光定量PCR检测技术[7-11]之外，高通量测序技术[12-13]、数字PCR技术[14-15]、恒温扩增技术[16-17]、生物传感器检测技术[18]也得到了应用和发展。然而，实时荧光定量PCR方法通常被认为是核酸定量检测的“金标准”[19]。依据PCR的特异性可将转基因检测分为元件筛查检测、基因特异性检测、构建特异性检测和转化体特异性检测等四类方法[20]。其中，转化体特异性检测方法具有高度专一性和唯一性，已成为国际上转基因产品检测标准化方法的首选，能够满足各个国家对转基因品种转化体监管的需求。【本研究切入点】抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5是罗萨里奥农业生物技术学院公司研发的转的抗逆大豆转化体，于2022年获得中国进口用作加工原料的安全证书，但中国还尚未建立针对该转化体特异性的定量检测方法。【拟解决的关键问题】本研究以抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的5′端转化体特异性序列为靶标，通过引物探针筛选、特异性测试、准确性测试、检测限和定量限等试验，结合现有大豆内标准基因[21]实时荧光定量PCR方法，建立抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，通过多家实验室针对该方法的准确性、重复性和再现性等各项参数进行联合验证，为抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5在国内安全检测监测提供技术支撑，为其定量标识管理和有效安全监管提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料

抗逆大豆（）IND-ØØ41Ø-5、非转基因大豆受体以及以相应非转基因作物填充的转化体含量为1%的转基因作物混合粉末（表1），由农业农村部科技发展中心提供；非转基因大豆混合样品（天隆1号、Williams 82、华春3号）由中国农业科学院油料作物研究所实验室保存并配置，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5及其非转基因大豆受体在温室种植，取其幼苗叶片用于提取基因组DNA。试验于2021年至2022年在中国农业科学院油料作物研究所实验室进行并完成数据统计分析。

表1 试验材料信息

1.2 大量DNA的提取与纯化

参考高质量水稻叶片DNA抽提方法[22]，稍作改良，最终将获取的DNA溶于800 μL TE溶液中。采用紫外分光光度计NanoDrop OneC（美国，Thermo Fisher）测定DNA浓度并评价其质量，储存于-20 ℃备用。

1.3 小量DNA提取及纯化

采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为，CW0531M）提取和纯化少量叶片或种子粉末DNA，具体操作步骤见说明书。经紫外分光光度计NanoDrop OneC（美国，Thermo Fisher）测定DNA浓度并评价其质量，-20 ℃保存备用。

1.4 材料纯合度鉴定

微滴数字PCR反应体系为20 µL，包含2×ddPCR Master Mix（美国伯乐，1863010）10 µL、10 µmol·L-1上下游引物溶液各0.8 µL、10 µmol·L-1探针溶液0.4 µL、20 ng·μL-1DNA模板1 µL。将20 µL PCR反应体系和70 µL微滴生成油依次加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。PCR扩增程序为95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 60 s，40个循环；98 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中进行信号读取，采用QuantaSoft V1.3.2.0软件分析试验数据，获得绝对定量结果。

1.5 引物探针设计

采用Beacon designer 8.0软件，针对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端（RB端）旁侧序列设计6条正向引物、3条反向引物和2条探针[23]，将设计的正向引物和反向引物两两配对（电子附表1）；结合罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的一对引物探针（RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1）共有19对引物探针组合，大豆内标准基因实时荧光PCR检测引物探针直接采用国家标准[21]（表2）。所有引物探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，离心后用双蒸水稀释至10 µmol·L-1，避光保存备用。

表2 抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR引物探针

1.6 反应体系及程序

25 µL实时荧光定量PCR方法反应体系包括2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）混合液12.5µL（Takara，RR390A）、10 µmol·L-1上下游引物溶液各1.0 µL、10 µmol·L-1探针溶液0.5 µL、DNA模板2.0 µL，双蒸水补齐25 µL。反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环数≥40；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。

1.7 反应体系优化

分别设置不同梯度引物/探针浓度（0.9 μmol·L-1/ 0.25 μmol·L-1、0.8 μmol·L-1/0.40 μmol·L-1、0.6 µmol·L-1/ 0.30 µmol·L-1、0.4 µmol·L-1/0.20 µmol·L-1、0.2 µmol·L-1/ 0.10 µmol·L-1），配置好反应体系后，按照1.6的反应程序进行实时荧光定量PCR扩增。

1.8 特异性测试

设置拷贝数比值为1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5为阳性对照、非转基因受体大豆为阴性对照、双蒸水为空白对照，将其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样作为测试样品，对实时荧光定量PCR方法特异性进行测试。

1.9 正确度和精密度测试

将鉴定为纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5叶片基因组DNA初始浓度稀释至50 ng·µL-1，分别设置100、10、1、0.2和0.04 ng 5个点的标准溶液，试验设3个平行，重复3次。根据标准曲线模板的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制大豆内标准基因和抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性序列的标准曲线[24]。将纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA同受体非转基因对照按照拷贝数比值分别为M1（5%）、M2（1%）和M3（0.1%）配置测试样品，进行正确度和精密度测试，试验设3个平行，重复3次。利用实时荧光定量PCR的Ct值以及绘制的标准曲线，分别计算大豆内标准基因和IND-ØØ41Ø-5转化体的拷贝数，按照公式1计算样品中转基因成分含量（，%）。

1.10 检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）测定

设置非转基因受体大豆为阴性对照、双蒸水为空白对照，将抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA及其非转基因受体基因组DNA分别进行梯度稀释，制备拷贝数比值为0.05%和0.025%样品，分别进行60次测试，PCR反应体系中加入50 ng DNA模板，相当于分别含有20拷贝和10拷贝的IND-ØØ41Ø-5转化体特异性序列，检测抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法的检出限[23, 25-26]。同时，配置拷贝数比值为0.1%的样品，进行16次定量测试，检测IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法定量限[23, 25-26]。

1.11 方法的实验室间验证

邀请8家有资质的单位对定量检测方法的以下参数进行实验室间验证[23]：（1）特异性和检出限验证：特异性测试样品设置见1.8，检出限测试样品为拷贝数比值0.05%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体基因组DNA，扩增设置6个平行。（3）准确性验证：测试样品为拷贝数比值5%（S1）、2%（S2）、1%（S3）、0.5%（S4）、0.1%（S5）的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体基因组DNA。将纯合IND-ØØ41Ø-5基因组DNA梯度稀释获得G1、G2、G3、G4和G5等5个点的标准溶液，其中G1样品的拷贝数含量高于S1，G5样品的拷贝数含量低于S5，每个样品扩增设置3个平行，重复3次试验。（4）定量限验证：测试样品为拷贝数比值0.1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体基因组DNA，扩增设置3个平行，重复3次试验。

1.12 测量不确定度预评定

2 结果

2.1 引物探针筛选与确定

针对19对实时荧光定量PCR方法引物探针组合，以拷贝数比值为1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5基因组DNA为模板，采用推荐的实时荧光定量PCR扩增体系和反应程序进行特异性初筛（图1）。综合考虑扩增结果的信号强度、Ct值和PCR引物探针位置等因素，遴选引物探针组合12（RB-QF4/RB-QR3/RB-QP1）和19（RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1）作为候选引物探针，并对这两对引物探针组合做进一步比较。

图1 IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR引物探针的筛选

将2对候选引物探针12和19分别绘制标准曲线，扩增模板DNA为50、10、2、0.4、0.08和0.016 ng。结果显示，12引物探针组合的扩增效率为87.8%，且斜率为-3.655；而19引物探针组合的扩增效率为92.5%，且斜率为-3.517，19引物探针组织的扩增效率为90%—110%，斜率为-3.6—-3.1（图2），满足标准要求[23, 25-26]，而12引物探针组合的扩增效率不能满足标准要求。最终确定19为最终候选引物探针组合，并对其进行引物探针浓度优化和特异性测试。

2.2 引物和探针浓度的确定

设置不同的引物探针浓度组合，优化最佳反应体系（表3）。根据平台期的信号强度及扩增效率、稳定性，发现虽然0.8 μmol·L-1引物和0.40 μmol·L-1探针浓度组合的信号最高，但是Ct值差异很小（表3和图3）。为了和国家标准中内标准基因实时荧光PCR方法的反应体系保持一致，调整反应体系引物浓度0.4 μmol·L-1和探针浓度0.20 μmol·L-1，分别绘制标准曲线进行比较，扩增模板DNA为100、10、1、0.2和0.04 ng，发现2组数据Ct值差异极小，且扩增效率均为90%—110%，线性决定系数均大于0.98，满足标准要求（图4）。因此，确定IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测体系中的引物浓度为0.4 μmol·L-1，探针浓度为0.20 μmol·L-1。

A：12引物探针扩增曲线图；a：对应图A的标准曲线；B：19引物探针扩增曲线图；b：对应图B的标准曲线

1：空白对照；2：引物浓度0.2 μmol·L-1，探针浓度0.10 μmol·L-1；3：引物浓度0.4 μmol·L-1，探针浓度0.20 μmol·L-1；4：引物浓度0.9 μmol·L-1，探针浓度0.25 μmol·L-1；5：引物浓度0.6 μmol·L-1，探针浓度0.30 μmol·L-1；6：引物浓度0.8 μmol·L-1，探针浓度0.40 μmol·L-1

2.3 特异性测试

经特异性测试，发现19引物探针仅从1%含量IND-ØØ41Ø-5转化体中获得预期特异性典型扩增曲线，而在其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样中均未获得典型扩增曲线（图5）。因此，选择19引物探针组合作为IND-ØØ41Ø-5检测实时荧光PCR方法的候选引物，并将该引物探针组合命名为IND-ØØ41Ø-5/qF/IND-ØØ41Ø-5/qR/IND-ØØ41Ø-5qP，片段大小为138 bp，测序验证结果与罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的分子特征信息一致。

2.4 材料纯合度鉴定

采用单株抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体基因组DNA，利用微滴数字PCR平台分别检测大豆内标准基因和抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体的拷贝数（表4）。单重微滴PCR检测结果显示，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体与大豆内标准基因的百分比为97.17%—103.47%，平均值为99.26%，表明所选抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体单株均为纯合体。

表3 抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR反应体系优化

A：0.8/0.40 μmol·L-1引物探针组合扩增曲线图；a：对应图A的标准曲线；B：0.4/0.20 μmol·L-1引物探针组合扩增曲线图；b：对应图B的标准曲线

2.5 标准曲线的建立

采用大豆单倍体基因组大小为1 115 Mb[28]，配置5个点的标准溶液对应的拷贝数分别为83 190、8 319、831、166和33，针对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体和大豆内标准基因进行实时荧光定量PCR扩增，分别绘制IND-ØØ41Ø-5和的标准曲线（图6）。结果显示，3次重复试验中，IND-ØØ41Ø-5和标准曲线的决定系数2均大于0.98、扩增效率E为90%—110%、斜率为-3.6—-3.1，均满足标准要求的范围，表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体和大豆内标准基因检测体系的Ct值与模板拷贝数的对数间均具有良好的线性关系。

1：空白对照、阴性对照、其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样；2：1%抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体

表4 单株基因型鉴定结果

2.6 正确度和精密度测试

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR正确度和精密度测试结果显示，M1（5%）、M2（1%）和M3（0.1%）等3个测试样品的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5测定含量的偏差（Bias）均小于25%，相对标准偏差（RSD）均小于25%（表5），表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR检测方法的正确度与精密度均符合标准要求[23, 25]，结果准确、重复性良好。

A、B、C：IND-ØØ41Ø-5转化体标准曲线的3次重复；a、b、c：Lectin标准曲线的3次重复

2.7 检出限（LOD）和定量限（LOQ）的确定

检出限测试结果显示，0.05%抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的60次PCR测试均有典型扩增曲线（图7-a）；0.025%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的60次PCR测试均有扩增信号，但Ct值相对较大（图7-b）。因此，综合考虑实验室内部测定结果以及实际检测中的适用性，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法检出限不高于0.05%，反应体系加入50 ng DNA模板，相当于20个拷贝。

表5 正确度和精密度测试

a：0.05%抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的扩增结果；b：0.025%抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的扩增结果

定量限测试结果发现，16次测定0.1%样品的平均偏差和相对标准偏差分别为14.51%和8.59%，均小于25%（表6）。因此，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光PCR方法的定量限确定为0.1%，反应体系加入50 ng DNA模板，相当于40个拷贝。

2.8 方法的实验室间验证

2.8.1 特异性及检出限验证 8家实验室针对实时荧光定量PCR方法进行特异性测试，结果显示，1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5样品中均有典型扩增曲线，在其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样中均无典型扩增曲线（表7），表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法的特异性良好。

8家实验室对0.05%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5样品进行检出限测试，发现均有典型扩增曲线，且Ct值小于36，与实验室内部测试结果一致（表7和表8）。表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法检出限不高于0.05%（20拷贝）。

表6 定量限测试

表7 特异性和检出限验证结果

P：阳性结果；N：阴性结果 P: positive results; N: negative results

表8 8家实验室检测限扩增Ct值

2.8.2 标准曲线的线性及扩增效率 针对大豆内标准基因和抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体进行实时荧光定量PCR扩增，并绘制标准曲线（表9）。发现大豆内标基因的标准曲线扩增效率为91.10%—109.60%，斜率平均值为-3.355、扩增效率平均值98.85%、决定系数2平均值为0.996；抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体的标准曲线扩增效率为90.80%—104.60%，斜率平均值为-3.403、扩增效率平均值96.89%、决定系数2平均值为0.998，均符合标准要求[23, 25-26]。

2.8.3 准确性验证 采用科克伦法和格拉布斯法对5份准确性测试样品结果进行异常值检验[29]，当实验室数量p=8，试验重复n=3时，分别计算测试样品的值和G值，在置信区间1%和5%的临界值下，发现Lab6实验室1%含量的样品中出现了一个科克伦法检验的离群值（表10）。剔除异常值后，5份测试样品中抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5含量测量平均值稍偏离真值，5%样品的偏差为-10.83%—11.38%，2%样品的偏差为-4.19%—14.12%，1%样品的偏差为-5.42%— 13.76%，0.5%样品的偏差为-8.92%—13.29%，0.1%样品的偏差为-4.61%—23.05%，5个样品偏差平均值为2.64%—5.06%，测量值的偏差均小于25%（图8）。结果表明，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法在实验室间具备良好的准确性。

图8 转基因含量的测量值与真值间的相对偏差

表9 8家实验室标准曲线验证结果

2.8.4 重复性与再现性 根据5份测试样品准确性测试结果，统计分析8家实验室内重复性相对标准偏差（RSDr）和实验室间再现性相对标准偏差（RSDR）（表11），结果发现，5份测试样品的RSDr值分别为4.61%、6.18%、3.66%、5.59%和7.75%，均小于25%；RSDR值分别为8.34%、8.61%、6.60%、8.86%和11.58%，均小于35%，正确度和精密度符合标准要求[23, 29]。结果表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法具备良好的重复性和再现性。

2.8.5 定量限验证 8家实验室对拷贝数比值为0.1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体定量限测试，结果显示，8家实验室的测试结果平均值为0.10%，实验室内重复性相对标准偏差RSDr为1.69%—16.82，均小于25%，实验室间再现性相对标准偏差RSDR为8.61%，小于35%（表12）。表明抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法的定量限不高于0.1%（40拷贝），与实验室内部测试结果相符。

表10 测试样品的百分含量

*：科克伦检验的离群值 *: Outlier from Cochran's test

2.8.6 测量不确定度预评定 采用线性最小二乘法对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法测量不确定度进行预评定[23, 27]，以8家测量5份测试样品结果的再现性标准偏差（SR）为纵坐标与5份测试样品结果的平均值（）为横坐标绘制回归曲线（图9），标准不确定度0为0.0019，相对标准不确定度为0.0838。测量标准不确定度，扩展不确定度为=2×，5个测试盲样的测试平均值分别是0.10%、0.53%、1.05%、2.05%和5.18%（w/w），计算出的扩展不确定度分别是0.02%、0.09%、0.18%、0.34%和0.87%（w/w）。因此，5个测试样品的测定含量分别表示为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，5份样品测量结果的扩展不确定度均在联合测量平均值的20%以内。结果表明，测量数据分散性小，接近真值，建立的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR方法测量结果精准可靠，可实现标准化应用。

表11 验证结果汇总

表12 8家实验室LOQ测量值结果汇总

3 讨论

3.1 定量检测方法的建立

本研究针对抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性序列的5′端设计了18对引物探针组合，结合罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的1对引物探针，经特异性筛选、反应体系优化与比较，最终确定了研发者提供19号引物探针组合为最优抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法。本方法优化后PCR反应体系与国家标准大豆内标准基因的体系一致，与罗萨里奥农业生物技术学院公司的方法相比成本低，适用性强，更易于标准化和推广应用。本研究测定实时荧光定量PCR方法的检出限为0.05%，约为20个拷贝的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体序列，与该公司结果相当；测定的定量限为0.1%，反应体系中50 ng的DNA模板，相当于40个拷贝的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体序列，而罗萨里奥农业生物技术学院公司测定的定量限为0.058%，但反应体系中100 ng的DNA模板，相当于50个拷贝，表明本研究抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法能够测定更低的转基因成分含量。转基因检测实时荧光定量PCR方法的检出限应不高于目标浓度的1/20，定量限应不高于目标浓度的1/10[23,26]，由于中国法律法规尚未规定转基因的标识阈值，本研究参考欧盟管理阈值0.9%，将目标浓度设定为1%，本方法确定的检出限0.05%和定量限0.1%，能满足国际上定量检测需求。在准确性测试中，直接采用未经定值的纯合抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体基因组DNA作为标准溶液，虽然科学性有待加强[30-31]，但是在没有标准物质的情况下，能够准确地测定样品的转基因含量，甚至含量低至0.1%的样品。本研究成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法。

图9 再现性标准偏差（SR）与测试样品平均值（）间的回归曲线

3.2 方法的实验室间验证

本研究组织了8家业内有资质的实验室对本方法进行实验室间联合验证，本方法特异性好、稳定性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%。采用科克伦法和格拉布斯法对5份准确性测试样品测定结果进行数据统计分析[29, 32]，每份测试样品的偏差均小于25%，表明本方法的准确性和精密度良好；实验室内重复性标准偏差（RSDr）小于25%，实验室间再现性标准偏差（RSDR）小于35%，充分证明重复性和再现性表现良好。然而，技术资料显示，罗萨里奥农业生物技术学院公司仅提供了3家实验室验证数据，尚不能达到实时荧光定量PCR方法标准化的要求。本研究建立的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法经多家实验室联合验证后，能够实现标准化应用。

3.3 测量不确定度预评定

测量不确定度是衡量检测结果质量的重要指标，能表示检测数据的分散范围[33]。在转基因生物安全管理实施定量标识的国家，测量不确定度对准确表示定量检测结果具有重要意义，尤其当检测结果接近标识阈值的时候，是否对转基因产品进行标识依赖于不确定度提供的测量结果的置信区间[34]。近年来，测量不确定度评定被越来越多地引入转基因定量检测工作中[27,33-36]，但是由于中国还没有采用定量标识管理，在转基因检测行业内尚未得到广泛应用。本研究利用8家实验室对拷贝数比值为0.1%、0.5%、1%、2%和5%的5份样品的联合测试结果的再现性标准差，采用线性最小二乘法对测量不确定度进行预评定。根据测量不确定度评定结果，样品中抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5的含量分别表示为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%；该结果与2013年6家实验室验证转基因水稻TT51-1实时荧光定量PCR检测方法获得的不确定度相比[26]，抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性实时荧光定量PCR方法获得的不确定度明显要小得多，一方面表明本研究联合验证结果具有良好的一致性和准确性，另一方面表明中国转基因检测实验室的转基因定量检测能力有很大的提升。随着实时荧光定量PCR检测方法在转基因检测行业不断应用，中国转基因检测机构定量检测水平大幅度提高，定量检测技术、人员、设施储备充足，能够为中国转基因定量标识管理提供更有力技术支撑。

4 结论

成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体实时荧光定量PCR检测方法，该方法的特异性强和稳定性好，且能精准地定量拷贝数比值为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分，检出限为0.05%，定量限为0.1%，并具备良好的重复性和再现性，能够实现抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体成分定量检测。

致谢：农业农村部科技发展中心为本研究提供试验材料，并组织了方法的实验室间验证。农业农村部植物及植物用微生物生态环境安全监督检验测试中心（广州）（Lab1）、农业农村部农产品及加工品质量安全监督检验测试中心（杭州）（Lab2）、农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心（合肥）（Lab3）、农业农村部农作物及产品成分监督检验测试中心（哈尔滨）（Lab4）、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心（长春）（Lab5）、农业农村部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）（Lab6）、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心（天津）（Lab7）、农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心（太原）（Lab8）参加了本方法的实验室间验证，特此致谢！

[1] 国际农业生物技术应用服务组织. 2019年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势. 中国生物工程杂志, 2021, 41(1): 114-119.

International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Global commercialization of biotechnology/transgenic crops in 2019. China Biotechnology, 2021, 41(1): 114-119. (in Chinese)

[2] 陈佳俊, 高维新. 我国大豆进口冲击下的大豆产业优化发展路径. 市场周刊, 2022, 35(1): 85-89.

CHEN J J, GAO W X. Optimal development path of soybean industry under the impact of soybean import in China. Market Weekly, 2022, 35(1): 85-89. (in Chinese)

[3] LIANG J G, YANG X W, JIAO Y, WANG D X, ZHAO Q, SUN Y, LI Y H, WU K M. The evolution of China’s regulation of agricultural biotechnology. aBIOTECH, 2022, 3(4): 237-249.

[4] 黄耀辉, 樊殿峰, 焦悦, 吴小智, 叶纪明. 浅谈多国转基因产品标识制度对我国的启示. 生物技术进展, 2022, 12(4): 516-522.

HUANG Y H, FAN D F, JIAO Y, WU X Z, YE J M. Enlightenment of GMO labeling system in other countries to China. Current Biotechnology, 2022, 12(4): 516-522. (in Chinese)

[5] 徐琳杰, 刘培磊, 李文龙, 孙卓婧, 宋贵文. 国际转基因标识制度变动趋势分析及对我国的启示. 中国生物工程杂志, 2018, 38(9): 94-98.

XU L J, LIU P L, LI W L, SUN Z J, SONG G W. Analysis of the recent trends of international labeling policies for genetically modified products and the enlightenment to China’s labeling management. China Biotechnology, 2018, 38(9): 94-98. (in Chinese)

[6] RANDHAWA G, SINGH M, SOOD P. DNA-based methods for detection of genetically modified events in food and supply chain. Current Science, 2016, 110(6): 1000.

[7] WU G, Wu Y H, XIAO L, LU C M. Event-specific qualitative and quantitative PCR methods for the detection of genetically modified rapeseed Oxy-235. Transgenic Research, 2008, 17(5): 851-862.

[8] WU G, WU Y H, NIE S J, ZHANG L, XIAO L, CAO Y L, LU C M. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1. Food Chemistry, 2010, 119(1): 417-422.

[9] WU Y H, WANG Y L, LI J, LI W, ZHANG L, LI Y J, LI X F, LI J, ZHU L, WU G. Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods. Scientific Reports, 2014, 4: 7358.

[10] LONG L K, YAN W, LI C C, DONG L M, LIU N, XING Z J, LI F W. Event-specific quantitative polymerase chain reaction methods for detection of double-herbicide-resistant genetically modified corn MON 87419 based on the 3’-junction of the insertion site. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2021, 85(6): 1468-1475.

[11] LI Y J, XIAO F, ZHAI C, LI X F, WU Y H, GAO H F, LI J, ZHAI S S, LIU B, WU G. Qualitative and quantitative real-time PCR methods for assessing false-positive rates in genetically modified organisms based on the microbial-infection-linkedgene. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(17): 10000.

[12] YANG L T, WANG, C M, HOLST-JENSEN A, MORISSET D, LIN Y J, ZHANG D B. Characterization of GM events by insert knowledge adapted re-sequencing approaches. Scientific Reports, 2013, 3: 2839.

[13] LI Y J, LI J, WU Y H, CAO Y L, LI J, ZHU L, LI X F, HUANG S M, WU G. Successful detection of foreign inserts in transgenic rice TT51-1 (BT63) by RNA-sequencing combined with PCR. Journal of the Science of food and Agriculture, 2017, 97(5): 1634-1639.

[14] LI X F, WU Y H, LI J, LI Y J, LONG L K, LI F W, WU G. Development and validation of a 48-target analytical method for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Scientific Reports, 2015, 5: 7616.

[15] DEMEKE T, LEE S J, ENG M. Increasing the efficiency of canola and soybean GMO detection and quantification using multiplex droplet digital PCR. Biology, 2022, 11(2): 201.

[16] XU J Y, ZHENG Q Y, YU L, LIU R, ZHAO X, WANG G, WANG Q H, CAO J J. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of genetically modified maize T25. Food Science & Nutrition, 2013, 1(6): 432-438.

[17] TAKABATAKE R, KAGIYA Y, MINEGISHI Y, FUTO S, SOGA K, NAKAMURA K, KONDO K, MANO J, KITTA K. Rapid screening detection of genetically modified crops by loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow dipstick. Journal of agricultural and food chemistry, 2018, 66(29): 7839-7845.

[18] SÁNCHEZ-PANIAGUA LÓPEZ M, MANZANARES-PALENZUELA C L, LÓPEZ-RUIZB. Biosensors for GMO testing: Nearly 25 years of research. Critical reviews in analytical chemistry, 2018, 48(5): 391-405.

[19] BROEDERSA S, HUBERB I, GROHMANNC L, BERBEND G, TAVERNIERSE I, MAZZARAF M, ROOSENSA N, MORISSETG D. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends in Food Science & Technology, 2014, 37(2): 115-126.

[20] HOLST-JENSEN A, BERTHEAU Y, DE LOOSE M, GROHMANN L, HAMELS S, HOUGS L, MORISSET D, PECORARO S, PLA M, VAN DEN BULCKE M, WULFF D. Detecting un-authorized genetically modified organisms (GMOs) and derived materials. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1318-1335.

[21] 农业部2031号公告—8—2013, 转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR方法. 北京: 中国农业出版社, 2013.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2031-8-2013. Detection of genetically modified plants and derives products target-taxon specific qualitative PCR method for soybean. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)

[22] 吴昊, 陈太钰, 林拥军, 陈浩. 水稻叶片高质量DNA抽提. Bio-Protoc, 2018, 101, e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102.

Wu H, Chen T Y, Lin Y J, Chen H. High-quality DNA extraction from rice leaves. Bio-Protoc, 2018, 101, e1010102. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010102. (in Chinese)

[23] 农业部2259号公告—5—2015, 转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法制定指南. 北京: 中国农业出版社, 2015.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2259-5-2015. Detection of genetically modified plants and derives products technical guidelines for development of real-time quantitative PCR methods. Beijing: China Agriculture Press, 2015. (in Chinese)

[24] 农业部2122号公告-8-2014, 转基因植物及其产品成分检测抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定量PCR方法. 北京: 中国农业出版社, 2014.

Announcement by the Ministry of Agriculture No.2122-8-2014. Detection of genetically modified plants and derives products quantitative PCR method for insect-resistant rice TT51-1 and its derivates. Beijing: China Agriculture Press, 2014. (in Chinese)

[25] Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 2009, 55(4): 611-622.

[26] MARCO M, CRISTIAN S, CHRYSTELE C D, HERMANN B, ANDREW D, CLAUDIA P, DEN EEDE GUY V. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Network of GMO Laboratories, 2015.

[27] WU Y H, YANG L T, CAO Y L, SONG G W, SHEN P, ZHANG D B, WU G. Collaborative validation of an event-specific quantitative real-time PCR method for genetically modified rice event TT51‑1 detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(25): 5953-5960.

[28] 段武德. 转基因植物检测. 北京: 中国农业出版社, 2008.

DUAN W D. Detection of genetically modified plants. Beijing: China Agriculture Press, 2008. (in Chinese)

[29] GB/T 6379. 2-2004, 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分: 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法. 北京: 中国标准出版社, 2004.

GB/T 6379. 2-2004. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results-Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. Beijing: China standard press, 2004. (in Chinese)

[30] LI J, ZHANG L, LI L, LI X Y, ZHANG X J, ZHAI S S, GAO H F, LI Y J, WU G, WU Y H. Development of genomic DNA certified reference materials for genetically modified rice Kefeng 6. ACS Omega, 2020, 5(34): 21602-21609.

[31] 安娜, 柳方方, 董美, 胡晓颖, 宛煜嵩, 金芜军, 兰青阔, 李亮, 韩阳. 基于PCR技术的DNA分析测试关键要素. 基因组学与应用生物学, 2019, 38(2): 624-629.

AN N, LIU F F, DONG M, HU X Y, WAN Y S, JIN W J, LAN Q K, LI L, HAN Y. Key elements of DNA analysis and testing based on PCR technology. Genomics and Applied Biology, 2019, 38(2): 624-629. (in Chinese)

[32] 王颢潜, 肖芳, 杨蕾, 缪青梅, 张旭冬, 张秀杰. 转基因玉米双抗12-5转化体特异性PCR方法验证结果分析. 生物技术通报, 2020, 36(5): 48-55.

WANG H Q, XIAO F, YANG L, MIAO Q M, ZHANG X D, ZHANG X J. Analysis of verification results by PCR methods for genetically modified double-resistant 12-5 event-specific maize. Biotechnology Bulletin, 2020, 36(5): 48-55. (in Chinese)

[33] 宋君, 常丽娟, 张富丽, 王东, 李洁. 采用蒙特卡洛法评定转基因水稻样品中NOS终止子的测量不确定度. 计量学报, 2019, 40(1): 164-171.

SONG J, CHANG L J, ZHANG F L, WANG D, LI J. Measurement uncertainty in NOS terminator from genetically modified rice estimated by Monte Carlo method. Acta Metrologica Sinica, 2019, 40(1): 164-171. (in Chinese)

[34] 杨冬燕, 杨永存, 李浩. 转基因成分定量检测数据分析及不确定度评估现状概述. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(8): 3025-3028.

YANG D Y, YANG Y C, LI H. Data analysis and uncertainty evaluation of genomic modified ingredients quantitation by real- time PCR. Journal of Food Safety & Quality, 2016, 7(8): 3025-3028. (in Chinese)

[35] TRAPMAN S, BURNS M, CORBISIER P, GATTO F, ROBOUCH P, SOWA S, EMONS H. Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories-3rdedition. European Union, 2020. DOI: 10.2760/738565.

[36] 黄文胜, 邓婷婷, 韩建勋, 吴亚君, 陈颖. 转基因定量检测的不确定度研究. 中国生物工程杂志, 2012, 32(1): 49-55.

HUANG W S, DENG T T, HAN J X, WU Y J, CHEN Y. Estimate the uncertainty on quantification of GMO by the fluorescence real-time PCR method. China Biotechnology, 2012, 32(1): 49-55. (in Chinese)

Establishment and standardization of event-Specific real-time quantitative PCR detection method of stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5

LI YunJing1, XIAO Fang1, WU YuHua1, LI Jun1, GAO HongFei1, ZHAI ShanShan1, LIANG JinGang2, WU Gang

1Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ Supervision and Test Center (Wuhan) for Plant Ecological Environment Safety, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Agricultural Genetically Modified Organisms Traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100176

【Objective】Stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 has been authorized as a safety certificate for imported processed raw materials in China. This study aims to develop a specific, accurate, and sensitive real-time quantitative PCR (qPCR) assay for the quantification of the stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event, providing a precise measurement technique for regulating its safety in China. 【Method】18 pairs of primers and probes were designed using Beacon designer 8.0 software for the 5′ end flanking sequence of the stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event, in combination with one pair of primer and probe providing by Instituto de Agrobiotecnologia Rosario (INDEAR) S.A. Subsequently, the specific screening of the primers and probes was performed using real-time PCR technology, and one pair of candidate primer and probe was selected. The reaction system parameters, such as primer and probe concentration, were optimized during the establishing the qPCR method. A specificity test was performed using different test samples. The pure stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 genomic DNA was serially diluted into standard solution templates, and standard curves were plotted to investigate the linear dynamic range of the qPCR method. Test samples with copy number ratios of 5%, 1% and 0.1% were prepared by mixing IND-ØØ41Ø-5 genomic DNA with non-GM counterpart to evaluate the accuracy of the qPCR method. The limit of detection (LOD) was detected by using test samples with copy number ratios of 0.05% and 0.025%. The limit of quantification (LOQ) was determined after 16 tests on samples with a copy number ratio of 0.1%. Finally, the technical parameters of qPCR assay for the stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event were determined. The specificity, LOD, LOQ and accuracy of the qPCR method were validated by eight qualified testing laboratories. The repeatability and reproducibility of the qPCR were evaluated by Cochran′s test and Grubbs' test, and the measurement uncertainty of the accuracy samples were pre-evaluated by linear least-square method. 【Result】The RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1 primer and probe combination was selected as a candidate to establish the qPCR for the stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event, with an amplified fragment of 138 bp. The optimized reaction system had a final concentration of 0.4 μmol·L-1for the primer and 0.2 μmol·L-1for the probe. Standard curves of IND-ØØ41Ø-5 andgene assay showed good linearity with the dynamic range from 33 to 83190 copies of genomic DNA. The qPCR can accurately quantify 5%, 1%, and 0.1% content of IND-ØØ41Ø-5 test samples with less than 25% bias and relative standard deviation (RSD). The LOD was determined to be 0.05%, and the LOQ was 0.1%. After validation by eight qualified laboratories, the results indicated that the method was stable, specific and had good repeatability and reproducibility, with the LOD of 0.05% and LOQ of 0.1%. After pre-evaluating the measurement uncertainty, the content of IND-ØØ41Ø-5 in the five test samples was found to be (0.10±0.02)%, (0.53±0.09)%, (1.05±0.18)%, (2.05±0.34)% and (5.18±0.87)%, respectively. These results demonstrate the accuracy and reliability of the qPCR method established in this study for the quantification of stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event components.【Conclusion】This study successfully developed a specific, accurate, and sensitive qPCR assay for the quantification of stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5 event using real-time PCR technology. The results show that method is capable of achieving precise measurement and reliable quantification of IND-ØØ41Ø-5 event components.

transgenic; stress-resistant soybean IND-ØØ41Ø-5; event-specific; real-time quantitative PCR (qPCR)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.002

2023-02-27；

2023-04-12

农业生物育种重大项目（2022ZD04019）、中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASYIP-2021-OCRI）

李允静，E-mail：liyunjing@caas.cn。通信作者吴刚，E-mail：wugang@caas.cn。通信作者梁晋刚，E-mail：liangjingang@agri.gov.cn

（责任编辑 李莉）