绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

田志龙，汤继顺，孙庆，王玉琴，张效生，张金龙，储明星



绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

田志龙1,2，汤继顺1，孙庆1，王玉琴2，张效生3，张金龙3，储明星1

（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；3天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一，而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据，深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式，并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系，以揭示其影响产羔数的机制，为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先，采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑，小脑，下丘脑，垂体，子宫，卵巢，输卵管，心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，肾上腺，甲状腺，大肠，小肠，胰腺，瘤胃，肾脂 19种组织的表达模式，然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑，垂体，子宫，卵巢，输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY®SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊（n=380）、湖羊（n=101）、苏尼特羊（n=21）、草原型藏羊（n=161）、策勒黑羊（n=52）、滩羊（n=22）6个绵羊品种中进行基因型检测，计算其群体遗传学指标，利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示，SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达，在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体（＜0.01），小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（＜0.05）；基因分型结果表明，g.12485895A＞G，g.12487558G＞A和g.12487190G＞T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著（＜0.05）；而g.12508874T＞C和g.12487467A＞G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著（＞0.05）；群体遗传学分析表明，g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、草原型藏羊中均为中度多态（0.25＜＜0.5），g.12508874T＞C位点在滩羊群体表现为低度多态（＜0.25）；卡方适合性检验表明，g.12485895A＞G和g.12487467A＞G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中处在Hardy-Weinberg不平衡状态（＜0.05），g.12487558G＞A在小尾寒羊和湖羊群体处于Hardy-Weinberg不平衡状态（＜0.05），g.12487190G＞T位点在草原型藏羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态（＜0.05）。其他位点在6个绵羊品种中均处在Hardy-Weinberg平衡状态（＞0.05）；关联分析表明，g.12485895A＞G，g.12487558G＞A，g.12508874T＞C和g.12487467A＞G位点与小尾寒羊产羔数无显著关联。g.12487190G＞T位点TT基因型母羊前三胎的产羔数均显著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。将该位点与小尾寒羊（A746G）不同基因型进行组合后发现，AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（＜0.05）。【结论】与小尾寒羊繁殖密切相关，g.12487190G＞T可作为小尾寒羊产羔性状选育的潜在分子标记。

绵羊；SMAD1基因；组织表达；SNP分型；产羔数

0 引言

【研究意义】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素影响。大多数绵羊都是季节性发情、单羔品种，且绵羊产羔性状的遗传力较低，仅为0.1左右，常规育种技术在短期内很难改良产羔性状。因此，阐明绵羊高繁殖力形成的分子机理，为分子标记辅助选择提供有效位点，就变得尤为重要。【前人研究进展】在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中，需要促性腺激素、性腺类固醇激素和细胞因子等共同调控，其中细胞因子以旁分泌和自分泌方式在生殖细胞间进行信号对话，实现对卵泡发育和颗粒细胞生长分化的调控作用，主要包括Wnt/β-catenin[1-2]、MAPK[3]和TGF-β/Smad[4]信号通路等。SMAD蛋白是TGF-β/SMADs信号通路下游重要的转录因子，介导细胞外TGF-β信号在细胞内的转导[5-6]。研究表明，TGF-β/SMADs信号通路在哺乳动物卵巢卵泡的发育，卵泡的闭锁与选择过程中发挥极其重要的调控作用[7]。SMAD1作为TGF-β/SMADs信号通路下游重要的转录因子，广泛分布于不同的组织并介导多种类型的生理过程[8]。绵羊FecB基因是学术界公认影响绵羊产羔数的主效基因，FecB基因属于TGF-β/SMADs信号通路。一个FecB基因拷贝可以增加排卵数1.3—1.6枚，两个FecB基因拷贝可以增加排卵数2.73枚；携带一个FecB基因拷贝的母羊产羔数增加0.9—1.2只，携带两个FecB基因拷贝的母羊产羔数增加1.1—1.7只[9]。【本研究切入点】国内外对TGF-β/SMADs信号通路相关基因的研究较多，但对SMAD1基因在绵羊中的表达及其多态性的研究并不多见。并且在实际生产中发现，在小尾寒羊群体中FecB基因野生型个体存在产多羔的现象。【拟解决的关键问题】本研究拟通过使用Taqman探针法对小尾寒羊进行分型，选择FecB基因突变野生型小尾寒羊，连续观察黄体数并记录产羔数（产羔数和黄体数均大于或等于2，则定义为多羔）。获得小尾寒羊FecB基因突变野生型单羔群体和多羔群体（下文简称单羔、多羔），以此为研究对象，采用反转录PCR结合实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体中的表达差异，期望从转录水平初步揭示SMAD1基因在绵羊多羔繁殖中的作用，同时对小尾寒羊、湖羊、苏尼特羊、滩羊、策勒黑羊、草原型藏羊等6个绵羊品种的SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T等5个SNPs进行研究，为绵羊标记辅助选择提供新的参考位点。

1 材料与方法

试验于2018年1—8月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验室进行。

1.1 样品采集和主要试剂

不同繁殖力小尾寒羊（基因野生型单羔和多羔）来自天津市畜牧兽医研究所种羊场，从中挑选健康状况良好成年母羊各3只，使用阴道孕酮栓（controlled internal drug release，CIDR）进行同期发情处理，12d后撤栓。在撤栓后45 h屠宰并立即采集大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、大肠、小肠、胰腺、瘤胃、肾脂19个组织，液氮中保存，直至提取RNA。

动物组织总RNA提取试剂盒（DP431）和血液基因组DNA提取系统（DP349）购自天根生化科技有限公司（北京），PCR Master Mix购于北京拓英坊科技有限公司，反转录试剂盒（RR037A）和荧光定量染料(RR820A)均购自大连宝生物公司，基因分型试剂和仪器均来自康普森生物技术有限公司（北京）。

1.2 组织总RNA/DNA的提取和检测

采用动物组织总RNA提取试剂盒/血液基因组DNA提取系统（天根，北京）提取各组织总RNA/DNA，并用Nanodrop 2000检测提取RNA/DNA的纯度和浓度，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA/DNA完整性。

1.3 引物设计

根据GenBank提供的绵羊SMAD1基因mRNA序列（登录号为：XM_012097420.2）利用Primer Premier 6.0软件进行跨外显子引物设计，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase ,）（XM_015089125.1）作为内参基因。FecB基因分型引物及探针参考文献[10]。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成，具体信息见表1。

1.4 半定量RT-PCR反应及荧光定量PCR

试验用cDNA合成及RT-PCR和荧光定量PCR试验过程如周梅[11]所述。简言之，即按反转录试剂盒提供步骤进行cDNA的合成，使用2×PCR Master Mix对SMAD1基因进行PCR，最后使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ进行荧光定量检测。

1.5 实时荧光定量检测及数据处理

荧光定量检测利用Roche Light Cycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行，以为内参基因，每个样品重复检测3次。采用2-ΔΔCT法[12]计算目的基因相对表达量，利用SPSS19.0统计软件对数据进行单因素方差分析，使用邓肯氏（Duncan’s）法进行多重比较。

1.6 基因分型及数据处理

使用Taqman分型技术对有产羔记录的380只小尾寒羊进行FecB（A746G）基因型检测，具体方法如刘秋月之前所述[10]。简言之，以小尾寒羊DNA为模板，利用表1中所述引物和探针，进行荧光定量PCR，检测荧光值的变化并对绵羊FecB（A746G）基因型进行判定。采用Sequenom MassARRAY®SNP技术[11-13]对SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12508874T＞C、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位点进行基因型检测。分型样品选择：有产羔数记录的小尾寒羊380只、湖羊101只、策勒黑羊52只、苏尼特羊21只、滩羊22只、草原型藏羊161只。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA浓度为40—80 ng·μL-1。

表1 绵羊SMAD1基因的引物信息

绵羊SMAD1基因5个SNPs位点的群体遗传学分析及其与小尾寒羊产羔数关联分析如笔者之前所述[14]。将与小尾寒羊产羔产生显著关联的位点，使用yijklmn=μ+Gi+Gj+Gi×Gj+Pl+Sm+eijklmn进行多基因聚合分析。其中，yijklmn是性状观察值（产羔数）；μ为总体均值；Gi为i标记基因主效应；Gj为j标记基因主效应；Gi×Gj为i和j基因的互作效应；Pl为胎次效应；Sm为季节效应；eijklmn为随机残差效应。用SPSS19.0软件程序中一般线性模型完成小尾寒羊基因型与产羔表型数据关联分析，所有数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果

2.1 总RNA提取与cDNA合成

提取不同繁殖力小尾寒羊各组织的总RNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。28S和18S条带清晰可见，且灰度值约为2﹕1，而5S带几乎没有，说明提取的总RNA无明显降解（图1），Nanodrop 2000检测各组织RNA，A260/A280均在1.8—2.1之间，表明提取的RNA纯度较高，可用于后续的荧光定量PCR反应。以反转录之后的cDNA为模板对GAPDH基因进行RT-PCR扩增，结果显示GAPDH基因在小尾寒羊不同组织扩增效果良好，具有明显内参基因特征。

2.2 SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体各组织中的表达分析

半定量RT-PCR结果显示，SMAD1基因在全身性组织均有表达，且在小尾寒羊单、多羔群体中表达量趋势较为一致（图2）。在小尾寒羊单羔群体下丘脑-垂体-卵巢轴组织的表达量略高于多羔群体。随后使用实时荧光定量对小尾寒羊单、多羔群体5个繁殖相关组织SMAD1基因的表达进行研究，结果表明：SMAD1基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴组织均有表达（图3），在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体（＜0.01），小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（＜0.05），在其余组织则不存在显著差异（＞0.05）。

M代表 DL2000 DNA Marker；1-7分别代表：大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管

2.3 SMAD1基因多态性分析

通过分型发现SMAD1基因5个SNPs在绵羊群体中均存在3种基因型，见图4。由表2可知，除了g.12508874T＞C、g.12487467A＞G位点外，其余3个SNPs在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著（＜0.05）。群体遗传学分析发现（表3），SMAD1基因g.12485895A＞G、g.12487558G＞A、g.12487467A＞G、g.12487190G＞T位点在小尾寒羊、湖羊、草原型藏羊、策勒黑羊、苏尼特羊、滩羊群体中均为中度多态（0.25＜＜0.5），g.12508874T＞C位点在滩羊中表现为低度多态（＜0.25），在其他绵羊群体为中度多态（0.25＜＜0.5）。g.12485895A＞G、g.12487467A＞G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中表现为Hardy-Weinberg 不平衡状态（＜0.05）；g.12487558G＞A位点在小尾寒羊和湖羊中表现为Hardy-Weinberg 不平衡状态（＜0.05）；g.12487190G＞T位点在草原型藏羊中表现为Hardy-Weinberg 不平衡状态（＜0.05），其余SNPs在不同绵羊品种中均表现为Hardy-Weinberg 平衡状态（＞0.05）。

M：DL2000 DNA Marker；1-19：大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、大肠、小肠、胰腺、瘤胃、肾脂；253 bp和149 bp分别代表SMAD1和GAPDH基因扩增产物大小；A代表单羔群体、B代表多羔群体

 *表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著（P＜0.01）

表2 SMAD1基因位点在单、多羔绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率

表3 SMAD1基因不同位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

＞0.05表示位点在该品种中处于哈代温伯格平衡状态

＞0.05 indicates the locus was in Hardy-Weinberg equilibrium

2.4 SMAD1基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系

由表4可知，SMAD1基因g.12487190G＞T位点多态性与小尾寒羊前三胎产羔数均显著相关（＜0.05），TT基因型母羊产羔数显著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。其他4个位点与小尾寒羊产羔数之间无显著关联。将该位点与小尾寒羊（A746G）不同基因型进行组合，结果发现，共存在9种不同组合基因型（表5），组合基因型与小尾寒羊第一胎、第二胎、第三胎产羔数均显著关联（＜0.05），其中AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（＜0.05）。

图4 SMAD1基因5个SNPs位点分型结果

表4 SMAD1基因SNPs位点各基因型小尾寒羊产羔数关联分析

对于每一个位点同一列中标不同小写字母表示差异显著（＜0.05）。下同

表5 SMAD1与FecB组合基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

3 讨论

3.1 SMAD1基因表达与动物繁殖的关系

研究表明，TGF-β/SMADs信号通路参与了胚胎早期发生、骨形成和组织修复等过程，在细胞的增殖、分化、迁移和凋亡以及免疫和内分泌等方面发挥着重要的调节作用[15-16]。近来的研究发现，TGF-β/SMADs信号通路在哺乳动物的卵泡发育、卵泡的选择与闭锁过程中发挥极其重要的调控作用[17]。在这一过程中，该通路中的关键成员（配体、受体、信号分子等）在整个生殖系统中都有协调的时空表达模式、控制和调节卵巢的生理学功能[18]。此外，研究发现，有丝分裂原活化蛋白激酶（Ras-MAPK）信号通路以及骨形态发生蛋白（BMPs）通过改变类固醇合成酶基因表达来调节颗粒细胞类固醇的合成[3]。大量研究表明，颗粒细胞的发育与卵泡的发育成熟和排卵密切相关[19]，而颗粒细胞的发育过程又受到多种激素和激素受体的调节，这其中雌二醇、孕酮、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和促黄体素（luteinizing hormone, LH）通过与其它细胞因子互作影响颗粒细胞增殖、分化以及卵泡成熟[20-21]。体外大鼠颗粒细胞的培养试验表明BMP4和BMP7可以提高FSH依赖的E2分泌[22]，而BMP4、BMP6、BMP7和BMP15抑制FSH诱导的P4的分泌[23-25]。其他研究也表明，阻断BMP/SMADs信号通路抑制了类固醇合成酶基因的表达[17]。据报道作为BMP/SMAD信号通路抑制剂，可以通过SMAD1/5/8通路显著影响，和的功能表达，并导致绵羊排卵数增加[26]。因此，推测通过调节，和功能来控制绵羊排卵数进而控制产羔数。目前，对SMAD1基因的研究多集中于小鼠，对小尾寒羊的研究相对较少。本研究中，RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示，SMAD1基因在全身性组织均有表达，且在小尾寒羊单、多羔群体中表达量趋势较为一致。这和牛家强[27-28]等研究结果一致，同样也与所有TGF-β超家族很多成员都需要通过SMAD1蛋白进行信号转导的研究结论一致。SMAD1基因在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量显著高于多羔群体（＜0.01），小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（＜0.05）。下丘脑-垂体-卵巢轴是控制哺乳动物性激素分泌的重要系统，与动物繁殖密切相关。SMAD1基因在此系统的差异表达，意味着该基因可能通过下丘脑-垂体-卵巢轴的负反馈途径调节卵泡的发育和排卵，进而影响不同繁殖力小尾寒羊群体的繁殖性状。但由于并未进行SMAD1蛋白的定量研究，该结果仍需继续研究。

3.2 SMAD1基因多态性与动物繁殖的关系

现阶段关于SMAD1基因多态与动物繁殖的报道多集中于水生动物，在哺乳动物中的研究较少。池秋蝶等[29]通过外显子测序获得文蛤Smad1基因多态信息，并发现其多态性可以影响文蛤的生长发育。本研究发现SMAD1基因g.12487190G＞T位点在小尾寒羊、湖羊、草原型藏羊、策勒黑羊、苏尼特羊、滩羊群体中均为中度多态（0.25＜＜0.5），并且其多态性与小尾寒羊前三胎产羔数显著相关（＜0.05）。对该位点进行基因定位研究发现，该位点处于SMAD1基因第5内含子区域。虽然内含子不编码氨基酸，无法影响蛋白质结构，但其突变可能控制基因转录活性并影响SMAD1基因的表达。关于内含子变异影响动物表型的报道很多。秦川牛SMAD3基因内含子3（g.101664C＞G）和内含子5（g.114523A＞G）变异显著影响其体重、胸围和臀部长度[30]（＜0.05）。皖江白鹅SMAD9基因内含子2的C＞T变异，显著影响其产蛋性能[31]。陕北白绒山羊[32]赖氨酸脱甲基酶6A（lysine demethylase 6A, KDM6A）基因第17内含子的16个碱基的插入缺失导致其mRNA表达量的不同，最终显著提高产羔数（＜0.05）。这些研究表明，内含子变异不仅影响转录和剪接过程，还可以通过控制基因表达来调控动物表型。Xu等[33]研究发现位于SMAD1基因内含子区域的rs40635766突变与湖羊繁殖力密切相关，可能是控制湖羊多羔繁殖的一个主效基因，这和本研究的结果一致。g.12485895A＞G、g.12487467A＞G、g.12487558G＞A、g.12487190G＞T位点在绵羊群体中存在不同程度的Hardy-Weinberg不平衡状态。可能是由于参与分型计算的样本量不够多或者绵羊群体存在人工选育造成的此类现象。本研究发现g.12487190G＞T位点TT基因型小尾寒羊母羊前三胎的产羔数显著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。将该位点与小尾寒羊A746G）不同基因型进行组合，发现AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（＜0.05），而AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数不存在差异（＞0.05）。该结果暗示，SMAD1基因调控绵羊产羔性状的机制与FecBA746G）基因密不可分。

4 结论

本研究发现，SMAD1基因在绵羊组织中呈全身性表达，在小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体、卵巢的表达量高于多羔群体（＜0.05）。g.12487190G＞T突变中TT基因型母羊产羔数显著高于GT和GG基因型母羊（＜0.05）。因此，SMAD1基因可能是影响小尾寒羊产羔数的一个重要候选基因，且g.12487190G＞T位点对小尾寒羊多羔性状选育具有一定的指导意义。

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（责任编辑 林鉴非）

Tissue Expression and Polymorphism of Sheep SMAD1 Gene and Their Association with Litter Size

TIAN ZhiLong1,2, TANG JiShun1, SUN Qing1, WANG YuQin2, ZHANG XiaoSheng3, ZHANG JinLong3, CHU MingXing1

(1Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan;3Tianjin Institute of Animal Sciences, Tianjin 300381)

【Objective】Sheep litter size is a very complex trait influenced by many factors. Ovulation is one of the most important factors. SMAD protein plays an important role in the mammalian follicular development as well as growth and differentiation process of granulosa cell.To reveal the relationship between the SMAD family member 1 (SMAD1) gene and the litter size of sheep and its mechanism affecting litter size, meanwhile to provide a scientific basis for sheep molecular breeding, we researched the expression pattern of【Method】First, reverse transcription PCR was used to detect the expression of SMAD1 gene in Small Tail Han sheep (brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, uterus, ovary, oviduct, heart, liver, spleen, lung, kidney, adrenal glands, thyroid, large intestine, small intestine, pancreas, rumen, and kidney fat) tissues with different lambing abilities. Then, Real-time PCR was performed to investigate the expression of SMAD1 gene in Small Tail Han sheep reproduction tissues (hypothalamus, pituitary, uterus, ovary, and oviduct) with different lambing abilities. Multiparous (Small Tail Han sheep (n=380), Hu sheep (n=101), Cele black sheep (n=52)) and uniparous (Sunite (n=21), Tan sheep (n=22), Prairie Tibetan sheep (n=161)) sheep breeds were selected and Sequenom MassARRAY®SNP assay was applied to genotype five single nucleotide polymorphism sites (SNPs) of SMAD1 gene. Then the association was analyzed between SMAD1 and litter size in Small Tail Han sheep by using SPSS 19.0. 【Result】The results of RT-PCR revealed that SMAD1 gene expressed in 19 tissues. The qPCR showed that the expression ofwas higher in ovary (＜0.01), hypothalamus (＜0.05) and pituitary (＜0.05) of uniparous Small Tail Han sheep than that in multiparous sheep. From genotyping, this study found that the genotype frequencies and allele frequencies of the g.12485895A＞G, g.12487558G＞A and g.12487190G＞T of SMAD1 gene were significantly different between uniparous and multiparous sheep (＜0.05). However, g.12508874T＞C and g.12487467A＞G had no significantly different between uniparous and multiparous sheep (＞0.05). Population genetic analysis indicated that g.12485895A＞G, g.12487558G＞A, g.12508874T＞C, g.12487467A＞G, and g.12487190G＞T loci were at moderate polymorphism (0.25＜＜0.5) in Small Tail Han sheep, Hu sheep, Prairie Tibetan sheep, Cele black sheep, Sunite and Tan sheep, while g.12508874T＞C was at low polymorphism (＜0.25) in Tan sheep. The χ2test indicated that the g.12485895A＞G and g.12487467 A＞G were not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Small Tail Han sheep and Prairie Tibetan sheep. g.12487558 G＞A was not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Small Tail Han sheep and Hu sheep. g.12487190 G＞T was not under Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05) in Prairie Tibetan sheep. Other loci were under Hardy-Weinberg equilibrium (＞0.05) in six sheep breeds. Association analysis indicated that the polymorphism of g.12487190 G＞T had significant correlation with the litter size in Small Tail Han sheep, while the litter size of TT was higher than GT and GG in the first three births (＜0.05). However, the polymorphism of g.12485895A＞G, g.12487558G＞A, g.12508874T＞C and g.12487467A＞G had no significant correlation with the litter size in Small Tail Han sheep. The combination of SMAD1 gene g.12487190G＞T and(A746G) gene showed that the number of lambs in AA-GG, AA-GT, AA-TT genotypes was significantly low than that of other genotypes (＜0.05), respectively. 【Conclusion】Therefore, it could be concluded thatmight be the key gene for litter size and the g.12487190G＞T locus might provide a basis for litter size trait selection in sheep.

sheep; SMAD1gene; tissue expression; SNP genotyping; litter size

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.015

2018-09-03；

2018-12-29

国家自然科学基金（31772580）、国家肉羊产业技术体系专项（CARS-38）、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS13）

田志龙，E-mail：tianzl0515@163.com。通信作者王玉琴，E-mail：wangyq6836@163.com；储明星，E-mail：mxchu@263.net