谷子萌发期响应干旱胁迫的基因表达谱分析

许冰霞，尹美强，温银元，裴帅帅，柯贞进，张彬，原向阳



谷子萌发期响应干旱胁迫的基因表达谱分析

许冰霞，尹美强，温银元，裴帅帅，柯贞进，张彬，原向阳

（山西农业大学农学院，山西太谷 030801）

【目的】谷子是一种耐旱作物，通过二代测序技术获得大量的谷子萌发期响应干旱胁迫的差异基因，进而挖掘谷子萌发期抵御干旱的关键基因及其相关的分子机制。【方法】以晋谷45为材料，谷子萌发期分别用18%PEG-6000干旱胁迫（处理组）和蒸馏水（对照组）处理种子并测定1、10和18 h种子的SOD、POD和CAT活性。SOD活性用氮蓝四唑（NBT）法测定，POD活性用愈创木酚法测定，CAT活性用比色法测定；对萌发10和18 h种子的对照组和处理组构建cDNA文库并进行差异基因表达谱分析；利用Bowtie将reads比对到参考基因组，采用RSEM对bowtie的比对结果进行表达量估计；使用DESeq进行差异表达基因分析；利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO在线数据库对差异基因进行功能注释，挖掘调控谷子萌发的关键基因；利用qRT-PCR验证测序结果的可靠性。【结果】处理组的SOD活性整体比对照组高，而POD活性和CAT活性与之相反；随着萌发时间的变化，SOD活性在不断地增加，但CAT和POD活性逐渐减小。基因表达谱序列与所选参考基因组序列高度一致，基因表达呈现出高度不均一性。通过高通量测序最后获得35 470个基因，以RPKM≥0.01为筛选标准，对照样本中分别筛选出24 030和24 486个表达基因，PEG干旱胁迫处理10和18 h的样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因；差异表达基因分析表明，谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因，其中87和267个上调表达基因，369和278个下调表达基因；GO功能显著性富集分析表明，差异基因主要涉及代谢过程，细胞进程和响应刺激；KEGG富集分析表明，差异基因参与到苯丙烷代谢和植物激素信号转导过程；通过qRT-PCR对5个差异基因在干旱胁迫下种子萌发时的表达分析表明，其表达趋势与表达谱分析结果基本一致。【结论】差异表达基因广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程；和可能在干旱胁迫下调节种子的萌发。

谷子；干旱胁迫；种子萌发；基因表达谱

0 引言

【研究意义】种子萌发率在作物生产中直接影响作物的出苗率以及作物生长和最终的产量。种子自身的休眠与萌发机制调节种子的萌发率，而外界的环境条件也会影响种子的萌发率。其中，水分是种子萌发的首要条件，种子萌发起始需要吸收大量水分启动一系列的生理生化活动为种子发芽做准备。提高干旱环境下作物种子的萌发率，可以解决干旱环境下出苗率低、出苗不齐等问题，从而达到保障产量稳定的目的。【前人研究进展】谷子是一种古老的禾本科耐旱稳产作物，与象草、柳枝稷等一些生物燃料作物有很近的亲缘关系，同时也是世界上许多干旱和半干旱地区的重要粮食和饲料作物[1]，因此，已有许多关于谷子抗旱性的鉴定，以及形态指标和生理指标与抗旱性关系的研究报道[2-3]，如裴帅帅等[4]和代小冬等[5]采用PEG渗透剂模拟干旱胁迫对不同品种谷子种子的抗旱性进行研究，并通过测定可溶性蛋白、脯氨酸、SOD和POD活性、MDA含量等生理指标以及相对发芽势、相对发芽率、发芽指数和抗旱指数等指标来鉴定不同品种谷子的抗旱性。同时谷子也是进化研究、生理研究和基因组研究的模型[6]，随着栽培谷子和野生谷子基因组测序的完成及公布[7-8]，使得基因组数据和基因资源的积累越来越多；因此有关谷子的抗旱性研究也在逐渐增加，许多研究是对谷子幼苗进行干旱胁迫，例如：谷子的鉴定[9]及脱水胁迫下差异表达基因的转录组分析[10]。尽管在谷子中已克隆出DnaJ蛋白（SiDnaJ）[11]、DREB转录因子[12]、C2H2型锌指蛋白基因（）[13]等抗旱基因，但更多的研究是将抗旱基因通过基因工程的手段转入其他模式植物鉴定其抗逆性，如窦祎凝等[14]通过谷子NAC类转录因子基因在拟南芥中过表达分析，发现可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程；王一帆等[15]发现在NaCl、PEG、ABA、GA、MeJA等不同处理下都会响应，尤其在盐胁迫条件下更为明显，并将其转化水稻验证，进而推测该基因会对谷子抗盐和抗逆起到一定作用。【本研究切入点】目前，关于谷子的抗旱性研究较多集中于抗旱性鉴定和幼苗期，但是在分子水平对谷子种子萌发期的抗旱机制研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究利用数字表达谱来探究萌发期抗旱性强的晋谷45在干旱胁迫10和18 h时基因表达种类及丰度，快速准确地挖掘谷子萌发期的特有抗旱基因，在分子水平深入研究谷子萌发期对干旱胁迫响应的分子机制，并为转基因耐旱谷子提供参考和提高谷子萌发率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以晋谷45（山西农业大学植物生理实验室抗旱萌发鉴定中抗性最强的品种）为材料，挑选成熟饱满大小均一且谷壳完好无病虫害的种子，用0.1% HgCl2浸泡消毒10 min，蒸馏水冲洗5—6次，晾干，然后均匀摆放在培养皿中，每皿100粒。试验组用18%（m/v）PEG-6000溶液进行模拟干旱胁迫处理，对照组使用蒸馏水处理，两组均进行3次重复，将处理好的样品置于25℃恒温培养箱中暗培养1、10和18 h，用于SOD、POD和CAT活性的测定，暗培养10和18 h，液氮速冻-80℃保存备用。

1.2 SOD、POD和CAT活性的测定

SOD活性用氮蓝四唑（NBT）法测定，POD活性用愈创木酚法测定，CAT活性用比色法测定。

1.3 总RNA的提取、cDNA文库的构建和测序

总RNA的提取、检测及cDNA文库的构建由中国北京百迈克公司完成。

1.3.1 总RNA的检测 分别采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等，合格的RNA进行基因表达谱测序。

1.3.2 cDNA文库构建 主要流程如下：

（1）用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；

（2）加入fragmentation buffer将mRNA进行随机打断；

（3）以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；

（4）纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择；

（5）最后通过PCR富集得到cDNA文库。

共4个样本进行高通量测序建库，谷子萌发10 h对照组命名为10hCK，谷子萌发10hPEG胁迫处理组命名为10hPEG，谷子萌发18 h对照组命名为18hCK，谷子萌发18hPEG胁迫处理组命名为18hPEG。测序数据为3次重复。

1.3.3 测序 用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为SE50。

1.4 基因表达分析及功能注释

1.4.1 基因表达分析 采用Bowtie[16]将样品的reads与参考基因组豫谷1号的基因组进行序列比对，使用RSEM[17]对bowtie的比对结果进行表达量估计，最后利用RPKM[16]值来反应基因的表达丰度。

1.4.2 差异基因表达分析 使用DESeq[18]进行差异表达分析，筛选出差异表达基因；最后采用Benjamini- Hochberg方法对基因的表达值进行统计检验，也就是用FDR（false discovery rate）作为差异表达基因筛选的指标。在筛选差异基因的过程中，将FDR＜0.01且FC（fold change）≥2作为筛选标准。

1.4.3 功能注释 使用BLAST[18]软件进行搜索比对，找到每一条基因的描述。在NR[19]、Swiss-Prot[20]、KEGG[21]、COG[22]和GO[23]在线数据库中进行比对，获得差异表达基因的功能注释。利用topGO[24]软件对差异基因进行富集分析。

1.5 实时荧光定量PCR分析

随机挑选5个响应干旱的差异表达基因，用实时荧光定量技术验证表达谱测序数据的可靠性。通过Trizol法提取样品总RNA，用反转录试剂盒PrimeScript®RT Reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA。荧光定量使用SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa）。使用Beacon Designer7.5设计引物（表1），长度为18—20 bp，扩增长度为80—200 bp，以谷子组成型表达基因作为内参基因，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。扩增程序为95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s；40个循环。采用2-△△CT计算差异表达基因的相对表达量，每个样品3个技术重复。

2 结果

2.1 谷子萌发过程中SOD、CAT和POD活性的差异分析

整体来看，种子萌发过程中CAT活性无显著性差异，SOD活性有极显著差异（＜0.01），POD活性有显著差异（＜0.05）。处理组的SOD活性整体比对照组高，而POD活性和CAT活性与之相反；处理组比对照组的SOD活性分别高出20.47%、26.18%和21.06%，POD活性分别低3.02%、24.86%和12.81%，而CAT活性分别降低20.00%、12.90%和2.82%，随着萌发时间的变化SOD活性在不断地增加，但CAT和POD活性逐渐减小（图1）。

2.2 测序质量的分析

对Raw Data中的测序引物、接头等人工序列进行截除，并将其中的低质量数据过滤，获得高质量数据即Clean data（表2）。谷子萌发10 h的对照样本和PEG干旱胁迫处理样本的Total reads分别为其12 080 922和10 669 558，谷子萌发18 h的对照样本和PEG干旱胁迫处理样本的Total reads分别为12 248 194和10 405 536，reads长度为50—100 bp，表明数据深度足够进行基因表达定量分析。GC含量在4组样本中均大于50%，分别为56.38%、56.59%、56.72%和56.59%，同时碱基质量值（quality score或Q-score）Q30都在85%以上，表明测序质量非常可靠，可以进一步进行分析。

表1 引物序列信息

不同字母表示在对照组和处理组之间的差异显著

表2 样品序列与参考基因组比对分析

对照样本和PEG干旱胁迫处理样本的reads被注释到参考基因组的情况相似，都大于86%，表明所选用的谷子材料与参考基因组的生物学分类关系较近，遗传基础差异较小，参考基因组满足后续分析的要求。另一方面，比对位置多于1个的reads数量较少（对照样本分别为14.67%和15.66%，PEG干旱胁迫处理样本分别为15.57%和16.75%），大多数reads比对到1个位置（对照样本分别为85.33%和84.34%，PEG干旱胁迫处理样本分别为84.43%和83.25%），表明reads质量较好，相对比对率高。片段随机性分析表明mRNA片段随机性较高，样本没有严重的降解现象；测序数据饱和度分析（随着数据量的增加，新增加的基因逐渐减少）表明样本有效数据充足；这两者从不同的角度说明了表达谱测序文库质量较高可以用于后续的信息分析。

2.3 谷子萌发时期响应干旱胁迫的基因表达分析

通过高通量测序最后获得35 470个基因，这些基因的表达丰度用RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）来反映。以RPKM≥0.01为筛选标准，对照样本分别共筛选出24 030和24 486个表达基因，PEG干旱胁迫处理样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因，4组样本中落在RPKM的不同区间的基因数目及比例大致相同，但是同一样本中落在RPKM的不同区间的的基因数目及比例存在显著差异，RPKM在0—5的基因达到35%以上，接近50%的基因的RPKM值在6—80（表3）。

表3 不同表达水平区间的基因数目

2.4 谷子萌发时期响应干旱胁迫的基因差异表达分析

以FDR＜0.01且差异倍数FC（Fold Change）≥2筛选标准，对对照样本和PEG处理样本进行差异表达基因分析，发现在谷子萌发10 h和18 h分别获得了456和545个差异表达基因，分别有87和267个基因上调表达，369和278个基因下调表达。其中，表达上（下）调2—4倍的基因分别占差异表达上（下）调基因总数的15.35%和38.16%（66.89%和39.63%）；表达上（下）调4—8倍的基因分别占2.85%和7.7%（10.75%和8.62%）；表达上（下）调8—16倍的基因分别占0.44%和2.20%（2.41%和2.01%）；表达上（下）调16倍以上的基因分别占0.44%和0.73%（0.88%和0.92%）。从火山图中可以直观地看出对照样本与PEG处理样本之间的表达水平具有显著的差异，同时也可以看出谷子萌发10 h和18 h时差异表达基因数目整体有增加，说明随着胁迫时间的增加，干旱对谷子萌发的影响也在不断增加，从而阻碍谷子萌发的进程（图2）。由图3和图4可知，种子萌发10 h和18 h对照组有20个差异基因同样在对照组和处理组之间也是差异表达，这20个基因在谷子萌发阶段响应干旱胁迫，同一基因在处理组与对照组之间表达量有很大变化，在对照组之间随着种子的萌发表达量也有很大变化（电子附表1）。

2.5 差异表达基因功能的注释和富集分析

使用BLAST软件分别将谷子萌发10和18 h 的456（电子附表2）和545（电子附表3）个差异基因与nr（non-redundant，NCBI）、Swiss-Prot、COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins，NCBI）、GO（the Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）5个蛋白质数据库进行序列比对，获得差异表达基因的注释信息。

将比对到COG、GO和KEGG的差异表达基因再进行分类分析。这些差异表达基因注释到GO数据库中进行功能分类。结果显示，谷子萌发10 h和18 h注释到细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物过程（biological process）的差异基因分别有326和367、308和325及304和348个。以-value≤0.01为筛选标准，发现生物过程（图5）中有128和140个基因显著富集到20和15功能类别，其中氧化应激反应（response to oxidative stress，GO：0006979）、氧化还原过程（oxidation- reduction process，GO：0055114）、纤维素微纤丝组织（cellulose microfibril organization，GO：0010215）和有性生殖（sexual reproduction，GO：0019953）是种子萌发10 h和18 h共同富集的通路。分子功能（图6）包含17个功能类别，分别有91和149个基因富集到这些功能类别中，其中铁离子结合（iron ion binding，GO：0005506）、酪氨酸氨解酶活性（tyrosine ammonia- lyase activity，GO：0052883）、木葡聚糖转移酶活性（xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity，GO：0016762）和纤维二糖葡萄糖苷酶活性（cellobiose glucosidase activity，GO：0080079）是种子萌发10 h和18 h共同富集的通路。在这些共同富集的生物功能中氧化应激反应，氧化还原过程和铁离子结合是有显著差异的，随着萌发时间的增加富集到这些功能类别的差异基因也在增加，再加上一个基因会有一个或者多个功能注释，因此，可以推断谷子萌发期响应干旱胁迫时，其代谢是复杂的。

A：10hCKvs10hPEG；B：18hCKvs18hPEG

图3 差异基因维恩图

COG分析发现在种子萌发10和18 h时差异基因涉及21个功能类别（图7），在这些基因中基因数目最多的功能类别是一般功能（general function prediction only），基因数目达到52个；在种子萌发10 h时基因数目大于10的功能类别有转录（transcription）有18个基因，复制、重组和修复（replication, recombination and repair）有16个基因，信号转导机制（signal transduction mechanisms）有26个基因，能量的产生和转化（energy production and conversion）有19个基因，碳水化合物转运和代谢（carbohydrate transport and metabolism）有27个基因以及氨基酸转运与代谢（amino acid transport and metabolism）有24个基因，其他的功能类别涉及到的基因均等于或低于10；而在种子萌发18 h时基因数目大于10的功能类别分别为翻译、核糖体结构与生物合成（translation, ribosomal structure and biogenesis）有15个基因，转录（transcription）有21个基因，复制、重组和修复（replication, recombination and repair）有16个基因，信号转导机制（signal transduction mechanisms）有22个基因，胞壁/膜生物发生（cell wall/membrane/envelope biogenesis）有14个基因，蛋白质翻译后修饰与转运（posttranslational modification, protein turnover, chaperones）有15个基因，碳水化合物转运和代谢（carbohydrate transport and metabolism）有26个基因，能量的产生和转化（energy production and conversion）有16个基因，氨基酸转运与代谢（amino acid transport and metabolism）为19个基因，次生代谢产物的生物合成、运输和分解代谢（secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism）有15个基因。尽管其他的功能类别的差异基因数目并不客观，但是囊括种类较多说明种子萌发阶段受到PEG胁迫后，物质代谢及能量转化受到较大的影响并且一直伴随着种子萌发整个过程，而种子萌发到18 h时开始进入发芽，在发芽早期种子会进行DNA修复以及一些复合体如核糖核蛋白体的水解，因此，PEG胁迫以后对蛋白质翻译后修饰与转运和翻译，核糖体与生物合成功能的影响显著增加；同时随着胁迫时间的增加，次生代谢物质也在种子萌发过程中不断增加。

图4 差异基因表达谱

图5 谷子萌发10 h和18 h差异基因的生物过程分类

差异基因被注释到98条KEGG代谢通路中，广泛涉及到物质代谢、能量代谢、信号转导及次生代谢（图4）。以-value≤0.05为筛选标准，发现这些基因在干旱处理10 h显著的富集到16个代谢通路中，处理18 h显著富集到12个代谢通路中（表4）。

干旱胁迫10 h，富集到植物激素信号转导、氧化磷酸化、糖酵解、苯丙烷类代谢及植物病源菌的相互作用的差异表达基因达到了51%，其中植物激素信号转导的差异表达的基因数目最多为10个。干旱胁迫18h，富集到苯丙烷类代谢、苯丙氨酸代谢、植物激素信号转导及氧化磷酸化的差异基因达到51%，其中富集到苯丙烷类代谢通路的差异表达基因数目最多为10个。

植物内源激素广泛参与到种子萌发过程，对种子的萌发进程起到一定调节作用。在干旱胁迫下，通过分析KEGG代谢通路发现，谷子萌发过程中关键的2个时间点10 h及18 h分别有10个和8个基因发生了差异表达，涉及生长素、乙烯、脱落酸、茉莉酸、水杨酸和油菜素内酯6种激素（图8）。其中上调表达的基因包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SnRK2、ABA反应元件结合因子ABF、乙烯受体ETR、转录因子TGA、生长素反应蛋白SAUR家族的X10A蛋白；下调表达的基因包括生长素载体AUX1 LAX家族、生长素响应的GH3家族、生长素反应蛋白SAUR家族的X10A和ARG7蛋白、ABA受体PYR/PYL家族、茉莉酸ZIM结构域蛋白质、木葡聚糖转移酶TCH4。其中在萌发10和18 h都上调表达（图5），其通常作为一个正调控因子参与到ABA信号转导途径，且ABA的含量在种子萌发过程中决定着种子是否萌发，大量的研究表明其抑制种子的萌发[34-35]。而其他的激素对于种子萌发的影响都是通过调节ABA并且与ABA形成互作网络来实现的[32]，因此推断在干旱胁迫下调节种子的萌发。

通过分析KEGG代谢通路，还发现有较多数量的差异表达基因富集到苯丙烷类代谢和苯丙氨酸代谢。其中苯丙烷类代谢在干旱胁迫10和18 h的谷子萌发进程中最显著，而苯丙氨酸代谢在干旱胁迫10 h时显著性较差，在干旱胁迫18 h时显著性仅次于苯丙烷类代谢。苯丙烷类代谢途径是植物体内非常重要的次生代谢途径，分析苯丙烷类代谢途径（ko00940）发现苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（CA4H）基因（表5）在谷子萌发10和18 h均发生了下调表达。其中PAL是苯丙烷类次级代谢的第一个关键酶[25-26]，不仅受到内部发育的调节（活性随着植物的的生长发育不断发生变化）而且也受到外部条件的的诱导（植物在受到寒冷、伤害和病原菌感染都会激活苯丙烷代谢）。通过对拟南芥4个的研究中发现在没有给植株浇水2周后，pla1pla2双重突变体植物仍然是亮绿色，而野生型的植物出现萎蔫现象，说明和的缺失会提高植物的抗旱性[27]。通过分析发现在干旱胁迫下种子萌发过程中表达水平下降，从而使PAL酶活性降低，直接影响肉桂酸的含量而使其他次生代谢产物合成减少，进而缓解PEG胁迫对种子影响，因此，可以推测在种子萌发过程中起着关键作用。

图6 谷子萌发10 h和18 h差异基因的分子功能分类

表4 差异表达基因富集的KEGG通路

2.6 荧光定量PCR分析

经过对显著富集的GO功能分类条目和KEGG代谢通路的分析，筛选出5个差异表达基因，其中Si035342m.g、Si035908m.g、Si001109m.g和Si016504m.g下调表达；Si022448m.g上调表达。采用qRT-PCR分析其表达谱，发现5个差异基因的表达模式与其在表达谱中的表达趋势一致，但是表达量的变化上有一定的不同（图9）。

表5 苯丙烷代谢相关的差异表达基因

1：翻译、核糖体结构与生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis；2：RNA加工与修饰RNA processing and modification；3：转录Transcription；4：复制、重组与修复Replication, recombination and repair；5：细胞周期调控与分裂、染色体重排Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning；6：防御机制Defense mechanisms；7：信号转导机制Signal transduction mechanisms；8：胞壁/膜生物发生Cell wall/membrane/envelope biogenesis；9：细胞骨架Cytoskeleton；10：胞内分泌与膜泡运输Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport；11：蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣Posttranslational modification, protein turnover, chaperones；12：能量产生和转化Energy production and conversion；13：碳水化合物运输与代谢Carbohydrate transport and metabolism；14：氨基酸运输与代谢Amino acid transport and metabolism；15：核酸运输与代谢Nucleotide transport and metabolism；16：辅酶运输与代谢Coenzyme transport and metabolism；17：脂类运输与代谢Lipid transport and metabolism；18：无机离子运输与代谢Inorganic ion transport and metabolism；19：次生产物合成、运输及代谢Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism；20：一般功能基因General function prediction only；21：功能未知Function unknown

3 讨论

植物受到干旱胁迫时，为了保护自己适应环境胁迫，不仅在生理生化代谢方面作出响应，同时在基因表达水平作出响应防御干旱胁迫，因此，从分子水平上来研究干旱胁迫响应的分子基础，寻找响应干旱的关键基因，为以后利用植物基因工程手段改良作物的抗旱性奠定基础。

种子在萌发过程尤其是在胚根突破种皮时会产生大量的活性氧，因此，种子会发生氧化应激反应，种子通过产生抗氧化物质和酶来调节这种反应[28]。QIE等[29]和TANG等[30]通过QTL定位发现种子萌发与干旱相关，并将相关信息和RNA-seq数据的联合分析发现4个基因与种子萌发相关，其中包括了氧化应激反应和氧化还原反应。本研究通过GO分析发现氧化应激反应和氧化还原反应功能类别中富集了大量的差异基因，并且种子萌发到18 h富集到这两个通路中的基因明显增加。在前期的生理试验中发现SOD的活性在持续增加，而CAT活性和POD活性呈现相反的趋势，说明在晋谷45萌发受到到干旱胁迫时，调控SOD的基因对干旱的应答不够灵敏高效，而调控CAT和POD的基因可以作出迅速的应答，从而导致SOD的活性增加，CAT和POD活性降低；玉米种子受到低温胁迫后SOD、POD和CAT的活性整体是先增加后降低，而基因的表达量则是先减小后增加[31]。

A：10hCKvs10PEG；B：18hCKvs18hPEG

Tryptophan metabolism：色氨酸代谢；Auxin：生长素；Ubiquitin mediated proteolysis：泛素介导的蛋白水解；Cell enlargement：细胞增大；Plant growth：植物生长；Zeatin biosynthesis：玉米素的生物合成；Cytokinine：细胞分裂素；Cell division：细胞分裂；Shoot initiation：根的发生；Diterpenoid biosynthesis：二萜类化合物的生物合成；Gibberellin：赤霉素；Stem growth：茎的生长；Induced germination：诱导萌发；Carotenoid biosynthesis：类胡萝卜素的生物合成；Abscisic acid：脱落酸；Stomatal closure：气孔；Seed dormancy：种子休眠；Cysteine and methionine metabolism：半胱氨酸和蛋氨酸代谢；Ethylene：乙烯；Endoplasmic reticulum(ER)：内质网；Fruit ripening：果实成熟；Senescence：衰老；Brassinosteroid biosynthesis：油菜素内酯的生物合成；Brassinosteroid：油菜素甾醇；Proteasomal degradation：蛋白酶体降解；Cell elongation：细胞伸长；Alpha-Linolenic acid metabolism：α-亚麻酸代谢；Jasmonic acid：茉莉酸；Monoterpenoid biosynthesis：类单萜生物合成；Indole alkaloid biosynthesis：吲哚生物碱的生物合成；Stress response：应激反应；Phenylalanine metabolism：苯丙氨酸代谢；Salicylic acid：水杨酸；Disease resistance：抗病性

图8 植物激素信号转导

Fig. 8 Plant hormone signal transduction under seed germinate for 10h and18h between control sample and PEG-stress sample

图9 谷子萌发10 h和18 h差异基因的qRT-PCR验证

激素是调节植物生长和发育的小分子，在种子萌发的过程中脱落酸、赤霉素、乙烯、生长素、水杨酸、茉莉酸等激素都会影响种子的萌发[32-33]。其中脱落酸可以抑制种子的萌发，而赤霉素可以解除这种抑制促进种子的萌发，其他激素单独的调节种子的萌发的机制还不清楚，但是它们可以与脱落酸、赤霉素形成工作网络一起来控制种子的萌发，尤其是在响应环境胁迫的过程中[34-35]。ABA与GA的比值决定着种子是否萌发。蔗糖不发酵相关蛋白激酶2（sucrose non- fermenting-1-related protein kinase2 SnRK2）参与环境胁迫及ABA等的信号转导。在对拟南芥中SnRK2s的二重突变体SnRK2.2/3、三重突变体SnRK2.2/3/6和十重突变体SnRK2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 研究中表明拟南芥中SnRK2基因家族有利于种子的萌发及提高拟南芥在干旱胁迫的适应能力[36-38]。本研究通过KEGG分析发现植物激素信号转导途径中ABA信号转导中的下游基因的表达上调，推断这将会导致ABA对种子萌发的抑制作用增强。同时现在已经证明当植物处于冷、盐和渗透胁迫时，降低GA的水平和信号会有利于打破逆境对植物生长的限制[39]。影响GA合成的关键基因是基因家族，因此，在环境胁迫下，基因家族的表达就会影响GA的合成。GA生物合成过程中的、和基因家族受到GA含量的调节，当合成基因下调表达时，上调表达[39]。在本文表达谱分析中发现上调表达，推断在干旱胁迫下下调表达，导致GA的含量下降，对种子的萌发的促进作用减弱。通过表达谱的初步分析可以推断出在干旱条件下，ABA作用增强，而GA的作用减弱，它们的拮抗作用导致种子萌发延迟。

以上这些代谢过程或者基因，基本上对植物响应环境胁迫起到一定的作用，但是有些还未证实能够调节种子萌发，那么这些基因能否在干旱条件下去帮助种子萌发也是有待进一步的验证。同时通过对表达谱分析发现不只有已验证的5个差异基因，而这5个基因也不只参与到一条代谢通路或者是信号转导通路中去，所以谷子萌发期对干旱的响应是多种代谢途径和信号转导通路共同作用的结果。对谷子萌发期对干旱响应的研究，不是通过研究单个基因的功能就可以理解干旱胁迫下各个代谢途径之间的相互关系。表达谱的分析为我们研究谷子萌发期的抗旱机制，筛选出起关键作用的基因提供理论基础，需要利用基因工程手段对这些基因的功能进行进一步的验证，从而为改良谷子的抗旱性提供依据。

4 结论

谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因，87和267个在干旱胁迫下上调表达，369和278个在干旱胁迫下下调表达。差异基因的表达广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程。

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附表1 PEG胁迫处理下谷子种子萌发10 h和18 h时均与对照共表达的20个差异基因的表达情况

Supplemental table 1 Expression level of 20 common DEGs among 10hCKvs10PEG, 18hCKvs18hPEG, and 10hCKvs18CK

附表1 PEG胁迫处理下谷子种子萌发10 h和18 h时均与对照共表达的20个差异基因的表达情况

Supplemental table 1 Expression level of 20 common DEGs among 10hCKvs10PEG, 18hCKvs18hPEG, and 10hCKvs18CK

附表2 PEG胁迫处理下谷子种子萌发10 h时与对照差异基因的表达情况（10hCKvs10hPEG）

Supplemental table 2 DEGs under seed germinate for 10 h between control sample and PEG-stress sample

附表2 PEG胁迫处理下谷子种子萌发10 h时与对照差异基因的表达情况（10hCKvs10hPEG）

Supplemental table 2 DEGs under seed germinate for 10 h between control sample and PEG-stress sample

附表3 PEG胁迫处理下谷子种子萌发18 h时与对照差异基因的表达情况（18hCKvs18hPEG）

Supplemental table 3 DEGs under seed germinate for 18 h between control sample and PEG-stress sample

附表3 PEG胁迫处理下谷子种子萌发18 h时与对照差异基因的表达情况（18hCKvs18hPEG）

Supplemental table 3 DEGs under seed germinate for 18 h between control sample and PEG-stress sample

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Gene Expression Profiling of Foxtail millet (L.) under Drought Stress during Germination

XU BingXia, YIN MeiQiang, WEN YinYuan, PEI ShuaiShuai, KE ZhenJin, ZHANG Bin, YUAN XiangYang

(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】Foxtail millet (L.) is a drought tolerant crop. The objective of this research is to get a lot of differently expressed genes during germination in response to drought stress by high-throughput sequencing, then to obtain the key gene and the related molecular mechanism at seed germination stage in foxtail millet under drought stress.【Method】Seed of JinGu45 was treated with 18%PEG-6000（PEG-stress）and distilled water germination(control sample) at 1 h, 10 h and 18 h as a test material, and the activities of SOD, POD and CAT were measured,respectively. SOD activity was assayed by nitro blue tetrazolium (NBT) method. POD activity was determined by guaiacol method, and the activity of CAT was measured by colorimetric method. Sample of control and PEG-stress that germinated for 10h and 18h were used to construct cDNA library by gene expression profiling technology. We compared reads to the reference genome by using Bowtie and analysed the result by using RSEM. Differential expression analysis used DESeq. The functional annotation of differently expresse genes were obtained by using NR, Swiss-Prot, KEGG, COG and GO online databases. The key genes that regulate germination in foxtail millet was obtained through analyse DEGs. The reliability of sequencing results was comfirmed by qRT-PCR. 【Result】The SOD activity of PEG-stress sample was higher than that in the control sample, but the activity of POD and CAT were lower than that in the control group. With the time of germination changes, the activity of SOD was increased, but the activity of CAT and POD was gradually decreased. The sequences of gene expression profile was highly consistent with the selected reference genome sequence, and the gene expression was highly heterogeneous. Expression analysis showed a total of 35 470 genes, and with the selection criteria of RPKM ≥0.01, there were 24 030 and 24 486 genes in the control samples and 24 019 and 23 877 genes in the samples under PEG drought stress, respectively. 456 and 545 DEGs were screened out during millet germination at 10h and 18h under drought stress, in which 87 and 267 DEGs were up-regulated and 369 and 278 DEGs were down-regulated. GO enrichment analysis showed that these DEGs were mainly relating to metabolism process, cell stimulation and response process. The KEGG enrichment analysis showed that these DEGs were associated with phenylpropanoid metabolism and plant hormone signal transduction. The results obtained from five genes tested by RT-PCR agreed with the trend of regulation identified by gene expression profile. 【Conclusion】DEGs were widely involved in the metabolism of biomacromolecule such as sugar, protein, nucleic acid, secondary metabolism and energy metabolism.andgenes may regulate seed germination in foxtail millet under drought stress.

foxtail millet (L.); drought stress; seed germination; gene expression profile

（责任编辑 李莉）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.002

2017-11-03；

2017-12-26

山西省重点研发计划（201603D221003-2）、作物生态与旱作栽培生理山西省重点实验室项目（201705D111007）、山西省科技重点研发项目（2015-TN-09）

许冰霞，Tel：18734450502；E-mail：1986984710@qq.com。

尹美强，Tel：15935411700；E-mail：yinmq999@163.com