耐药蛋白NDM-1的双抗体夹心ELISA检测方法研究

贾良曦，杨柳，丁亚芳，邢维维，马立才

(北京维德维康生物技术有限公司，北京 100095)

随着微生物与人类的不断斗争，在抗菌药物的使用过程中无可避免的会有“超级细菌”的出现[1]。所谓的“超级细菌”并不仅仅单指一种细菌的名称，而是一类几乎对所有抗生素都有强劲耐药性的细菌统称。新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase, NDM) 是一种新型的碳青霉烯酶，于2009年首次从印度新德里一名患者体内的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中分离得到[2]。由于该类细菌对包括碳青霉烯类药物在内的所有β-内酰胺类抗菌药物均耐药，且携带耐氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素基因，导致其感染治疗十分困难，因此也被称为“超级细菌”，以其发现地新德里命名[3]。

Kumarasamy等[4]报道了NDM-1肠杆菌在印度、巴基斯坦以及英国等国家开始流行，引起国际性的关注。随后，美国、德国、日本、中国香港等地不断检出携带NDM-1的菌株，多为大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌等临床常见的致病菌[5]。2012年中国农业大学研究人员在北京周边养殖场和屠宰场样品中检测到一株携带NDM-1的鲁氏不动杆菌，这也是中国首次在动物养殖场中发现。随后携带NDM-4、NDM-5、NDM-9等的菌株陆续在中国被检出[6-7]。由此表明NDM基因在动物中传播具有潜在危险，动物性食品安全向人们敲响警钟[8]。

目前检测NDM-1的方法主要有纸片扩散法[9]、Etest检测法[10]、仪器方法[11]、PCR检测法[12-13]、TaqMan荧光定量PCR[14-16]、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[17]、基因芯片技术[18]等。其中，纸片扩散法、Etest检测法、微量稀释法灵敏度低，缺乏特异性，仅适合初筛试验，而PCR可通过特异性引物对NDM-1阳性细菌进行确证，但对仪器设备的要求较高，且操作复杂，易发生污染。迄今未见有酶联免疫吸附方法(ELISA)检测NDM-1的报道。本研究利用表达纯化的NDM-1可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，通过对该方法的工作条件进行优化，建立一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗体夹心ELISA方法，以期为NDM-1蛋白ELISA检测方法的开发提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原核表达载体 pET-28a、大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)购自宝生物工程(大连)有限公司。大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、铜绿假单胞菌ATCC 9027由中国农业大学提供。携带NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9基因的鸡源大肠杆菌，由国家兽药安全评价中心提供。8周龄BALB/c健康雌性小鼠、SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由北京维德维康生物技术有限公司提供。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、镍离子螯合层析柱、卡那霉素、Tris-HCl缓冲液、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、50%聚乙二醇(PEG)、HAT培养基、HT培养基、TMB显色液购自Sigma公司，LB培养基、DMEM 培养基、脑心浸液培养基(BHI)购自美国Thermo Fisher Scientific。

1.2 NDM-1重组蛋白的表达与纯化

从GenBank中获取NDM-1基因的氨基酸序列(Accession:AFI72857.1)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行NDM-1基因的碱基序列的密码子优化，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成了优化后的基因序列。采用PCR方法扩增NDM-1(G29-R270)，引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(表1)，为便于蛋白的纯化，同时设计了His Tag标签和TEV酶切位点。将NDM-1(G29-R270)片段克隆至质粒载体pET-28a中，然后通过化学转化将重组质粒，转至大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过含有50 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板筛选阳性单克隆，并进行测序确认。

表1 扩增NDM-1基因的引物序列

将重组NDM-1(G29-R270)阳性质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，挑选阳性克隆菌株，接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，分别在15 ℃条件下诱导16 h 和37 ℃条件下诱导4 h[7]。4 ℃条件下，3 200g离心15 min收集菌体，使用20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重悬菌体，3 000 W，10 s/10 s，15 min超声裂解菌体。采用Ni-NTA镍柱亲和层析分离，收集目的蛋白，并进行SDS-PAGE和Western blot检测表达及纯化结果，获得NDM-1(G29-R270)蛋白。

1.3 单克隆抗体制备

1.3.1 小鼠免疫与细胞融合

按照表2所示免疫程序，使用已获得的NDM-1(G29-R270)蛋白免疫4只8周龄雌性BALB/c小鼠，四免1周后，对小鼠眼眶采血，室温放置2 h，4 000 r/min离心10 min后采用间接ELISA方法对取血清检测[19]。末次免疫后，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，用50%PEG进行细胞融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，于96孔培养板中，37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养，5 d后用HAT培养基半换液，9 d后进行全换液。

表2 单克隆抗体(小鼠)的免疫程序

1.3.2 杂交瘤细胞株筛选

待细胞长到培养孔面积的1/4时，吸出杂交瘤细胞上清液，使用间接ELISA方法筛选阳性细胞。并用NDM-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌裂解液包被的酶标板再次筛选，阴性对照为SP2/0细胞培养上清。前后共进行3次亚克隆，以得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株[20]。

1.3.3 腹水制备及纯化

选取健康的BALB/c经产小鼠4只，腹腔内注射无菌石蜡油(0.5 mL/只)。10～14 d后即可接种杂交瘤细胞，预处理过的小鼠2月内均可使用。收集生长良好的杂交瘤细胞，1 000 r/min离心10 min，弃去上清。重悬于DMEM培养液中将细胞数调至0.5×106个/mL～1×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL细胞悬液。次日观察有无小鼠死亡情况，7 d后观察小鼠腹部可否采集腹水，待小鼠腹部明显膨大，消毒腹部皮肤后，用5 mL注射器接8号针头刺入腹腔，收集腹水，每隔1 d抽取1次，一般可抽取3～5次。5 000 r/min离心10 min，收集淡黄色上清，分装，-20 ℃保存备用，约一周后收集腹水进行分离纯化。

纯化：取5 mL离心后的腹水用50%硫酸铵沉淀，10 000 r/min离心30 min，取上清，用45%硫酸铵再次沉淀，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，沉淀溶于等体积PBS(0.01 mol/L pH 值7.4)中，4 ℃冰箱中透析2 d，每天换2次透析液；4 000 r/min离心10 min，收集上清。测量抗体浓度后，-20 ℃保存备用。

1.4 样品制备

挑取待检测的单克隆菌落于4 mL BHI肉汤培养基中，将其置于37 ℃摇床中，100 r/min培养约2～4 h，4 ℃条件下，4 000 r/min离心5 min收集菌体，然后使用1 mL 20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重悬菌体，通过超声裂解菌体(3 000 W，10 s/10 s，15 min)，作为待测样品备用。

1.5 双抗体夹心ELISA方法的建立

选择合适的包被条件稀释纯化后的捕获抗体至合适浓度，每孔加入100 μL进行包被；次日，弃去孔内溶液，用PBST(0.01 mol/L PBS，0.1%Tween-20，pH=7.4)洗板3次，每次3 min；每孔加封闭液100 μL，37 ℃温育2 h，封闭结束后，弃去孔内溶液，用PBST洗板3次，甩干；在酶标板孔内加入待测样品，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤3次，甩干；加入最适浓度HRP标记的检测抗体，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次，甩干；加入临时配制的TMB溶液，每孔100 μL；37 ℃孵育10 min，加入终止液(2 mol/L H2SO4)50 μL/孔；用酶标仪检测OD450，计算样品孔与阴性孔的比值(P/N)，以P/N大于2.1作为阳性判定标准。

1.6 捕获抗体和检测抗体的确定

将获得的单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，其余步骤按照双抗体夹心ELISA步骤进行操作，测定其P/N的值，根据P/N的值确定捕获抗体和检测抗体。

1.7 包被抗体和酶标检测抗体浓度的筛选

采用棋盘滴定法测定，将包被抗体分别按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀释包被，HRP标记的检测抗体分别按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀释，按双抗体夹心ELISA方法进行检测，选择P/N值最大时的浓度作包被抗体和检测抗体的最佳使用浓度。

1.8 包被条件的筛选

分别用含0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH值9.6)、0.015 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.4)、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值8.0)和0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH值7.4，含0.15 mol/L NaCl)作为包被液，分别置于37 ℃孵育1 h、2 h及4 ℃孵育过夜，然后按照双抗体夹心ELISA方法进行检测，计算P/N值，确定在该方法中所需最适的包被液以及包被时间。

1.9 灵敏度的判断

将NDM-1阳性及阴性的大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌活化后，接种于脑心浸液琼脂(brain heart infusion agar，BHIA)培养基上。37 ℃培养24 h后，挑取单菌落于BHI肉汤培养基中，置于摇床100 r/min，37 ℃培养24 h。将菌液按1%扩大培养至100 mL，摇床100 r/min，37 ℃培养12 h。取少量对数生长期的菌液进行平板计数，剩余菌液3 000 r/min离心10 min，收集细菌沉淀。

将NDM-1阳性的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌分别用灭菌的PBS缓冲液以10倍梯度稀释至108、107、106、105和104CFU/mL，利用优化后的双抗体夹心ELISA方法对每个稀释梯度进行检测，测定该检测方法的最低菌落数的检出量，以判定该方法的敏感性。

1.9.1 特异性验证

采用建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测。分别将携带NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9的阳性对照菌和大肠杆菌ATCC 25922，大肠杆菌ATCC35150，鲍曼不动杆菌ATCC 19606，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，铜绿假单胞菌ATCC 9027等配制成108CFU/mL同时设置阴性对照，每个样品重复3个孔，以检测其特异性。

1.9.2 重复性评价

板内重复性试验：在同一块板内同时检测阳性、阴性等共5份耐药菌菌数含量不同的样品，每份样品，重复5孔，按照双抗体夹心ELISA进行测定，计算同一份样品的OD450值的变异系数(CV)以检验板内检测样品的重复性。

板间重复性试验：取5块用NDM-1抗体包被好的酶标板在相同条件下，检测5份不同耐药菌菌数含量不同的样品，按照双抗体夹心ELISA方法进行测定，计算同一份样品在不同板间的OD450值的CV，以检验板间检测样品的重复性。

2 结果与分析

2.1 NDM-1蛋白的纯化和鉴定

NDM-1表达质粒pET28a(+)-NDM-1经诱导表达后进行镍柱亲和层析纯化，结果显示：在相对分子质量约54.6 kDa的区域出现明显表达的蛋白条带，该条带与预期融合蛋白分子量大小一致，并且纯度较高，而含有pET28a(+)-NDM-1的未诱导对照组和在15 ℃条件下诱导16 h的对照组，在相应位置均未出现明显的目的蛋白条带(图1)，说明pET28a(+)-NDM-1表达成功，在非变性条件下，利用镍柱亲和层析柱对细胞裂解液上清中NDM-1蛋白进行纯化。SDS-PAGE结果表明，获得纯化NDM-1蛋白(图1)。

M1.蛋白Marker；M2.Western blot Marker；PC1.BSA (1 μg)；PC2.BSA (2 μg)；NC.未经诱导的细胞裂解液；1. 15 ℃诱导16 h的细胞裂解液；2. 37 ℃诱导4 h的细胞裂解液；NC1.未经诱导的细胞裂解上清；NC2.未经诱导的细胞裂解沉淀；3. 15 ℃诱导16 h的细胞裂解液上清；4. 15 ℃诱导16 h的细胞裂解液沉淀；5. 37 ℃诱导4 h的细胞裂解液上清；6. 37 ℃诱导4 h的细胞裂解液沉淀图1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B, GST标签抗体)检测结果

2.2 抗血清效价的筛选

表3显示，1号小鼠和2号小鼠血清效价均为1∶1 600时，3号小鼠血清效价为1∶12 800，4号小鼠血清效价为1∶25 600，对于后续生产阳性对照血清来说，满足1∶3 200即可，因此选择3号小鼠用于后续细胞融合。

表3 免疫BALB/c小鼠抗体效价ELISA检测结果

2.3 单克隆抗体杂交瘤细胞株筛选

使用间接ELISA方法筛选出的阳性杂交瘤细胞，经3次亚克隆后，当细胞融合率达到100%时可以建株。最终筛选到2株能稳定分泌NDM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3H5和4G1，结果见表4。

表4 杂交瘤培养上清检测结果

2.4 抗体配对的筛选

采用3H5和4G1 2株单抗分别作为捕获抗体和检测抗体，当抗体不同稀释度OD450值和阴性对照OD450值的比值(P/N)越大，灵敏度越高，效果越好。结果表明，当3H5作为捕获抗体，4G1作为检测抗体，抗体稀释浓度分别为1∶2 000和1∶8 000时，P/N的比值最高，为31.850(表5)。当4G1作为捕获抗体，3H5作为检测抗体时，抗体稀释浓度分别为1∶4 000和1∶32 000，此时P/N的比值最高，为10.650(表6)。因此，选择3H5作为捕获抗体，4G1作为检测抗体时效果最优。

表5 3H5为捕获抗体的测定结果

表6 4G1为捕获抗体的测定结果

2.5 包被抗体和检测抗体工作浓度的确定

如表7所示，经方阵法检测，随着包被抗体3H5浓度的降低和检测抗体4G1稀释倍数的增大，其OD450值不断变小。当3H5包被浓度为1∶2 000、4G1的稀释浓度为1∶5 000时，P/N值达到最大，所以选择1∶2 000和1∶5 000作为包被抗体3H5和检测抗体4G1的最佳稀释浓度。

表7 包被抗体(3H5)与检测抗体(4G1)最佳工作浓度的确定

2.6 包被条件的确定

通过建立双抗体夹心ELISA方法对包被条件进行优化，根据P/N的值确定最佳包被时间和稀释液。结果如表8所示，0.05 mol/L，pH值9.6碳酸盐缓冲液作为抗原包被液，4 ℃孵育过夜时，包被条件最好，且P/N值最大，因此选择0.05 mol/L，pH值9.6碳酸盐缓冲液，4 ℃孵育过夜作为最佳包被条件。

表8 包被条件的确定

2.7 双抗体夹心ELISA方法的灵敏度

将带有NDM-1的阳性样品进行10倍梯度稀释，用建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测，结果见9。随着样品中NDM-1含量的升高，OD450值逐渐升高。以测定孔与阴性对照孔OD450值之比大于2.1为阳性判定标准，当大肠杆菌、肺炎克雷伯菌中耐药菌菌液浓度降低到105CFU/mL以下，P/N值就小于2.1；当鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌中菌液浓度降低到106CFU/mL以下，P/N值就小于2.1。因此得出该方法对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌检出测限为105CFU/mL，对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌检测限为106CFU/mL。

表9 双抗体夹心ELISA检测的灵敏度

2.8 特异性验证

分别选大肠杆菌ATCC 25922，大肠杆菌ATCC 35150，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，鲍曼不动杆菌ATCC 19606，铜绿假单胞菌ATCC 9027、阴性对照菌以及NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9阳性对照菌，按照双抗体夹心ELISA方法做交叉反应试验，结果见表10。该方法中NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9等4种阳性对照菌有明显的交叉，这是因为几种亚型与NDM-1氨基酸差异小，所以会出现交叉反应，但与大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、鲍曼不动杆菌ATCC 19606和铜绿假单胞菌ATCC 9027没有交叉反应，说明本研究所建立的方法具有良好的特异性。

表10 特异性检测

2.9 重复性评价

2.9.1 板内重复性试验

在同一块板内同时检测阳性、阴性等共5份耐药菌，样品的含菌数量不同，每份样品，重复5孔，按照试剂盒的操作程序，进行测定，计算同一份样品OD450值的变异系数，以检验板内检测样品的重复性。由表11可以看出其中OD450值变异系数均小于6%。具有良好的板内重复性。

表11 板内重复性试验

2.9.2 板间重复性试验

取5块用NDM-1抗体包被好的酶标板，在相同条件下检测5份不同耐药菌，样品含菌数量不同，按照试剂盒的操作程序，进行测定，计算同一份样品在不同板间的OD450值的变异系数，以检验板间检测样品的重复性。由表12可以看出板内检测的5份样品的OD450值变异系数均小于10%。说明板间检测样品的重复性好。

表12 板间重复性试验

3 讨论

现在国内外NDM-1细菌的报道越来越多，甚至已在全球范围流行并引发多种类型的感染，不仅可直接威胁人类健康，还可通过动物性食品对人类健康造成严重的威胁[21-22]。国内外许多学者针对NDM-1基因研究建立了普通PCR、荧光定量PCR等快速检测方法，对于双抗体夹心ELISA方法检测NDM-1研究报道甚少。本研究采用化学合成的方法获得优化后的NDM-1蛋白基因序列，并将其克隆至表达载体pET-28a，得到重组质粒pET-28a-NDM-1(G29-R270)，并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。通过免疫BALB/c小鼠，获得了2株杂交瘤细胞株，分别命名为3H5和4G1，分别用作捕获抗体和检测抗体，建立双抗体夹心ELISA方法。

双抗体夹心ELISA方法是一个多成分系统，每个成分都会对试验结果造成影响，针对捕获抗体和检测抗体，浓度过高易造成蛋白分子多层化，容易将蛋白洗掉造成浪费，而且容易造成试验的非特异性；浓度过低易造成假阴性。包被条件对结果影响很大，若温度过低则需要延长反应时间，温度高则应减少反应时间[23]，因此本研究选择4 ℃包被过夜，捕获抗体和检测抗体的稀释度分别选择1∶2 000和1∶5 000。

研究发现，携带NDM-1基因的细菌主要有大肠杆菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等[24-25]。因此，本试验检测了上述几种耐药菌中NDM-1耐药蛋白的灵敏度和特异性，结果显示，NDM-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的最低浓度为1×105CFU/mL，NDM-1阳性鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的最低浓度为1×106CFU/mL。应用该方法检测NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9，与4种阳性对照有明显的交叉，但与大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031和铜绿假单胞菌ATCC 9027均无交叉反应，说明此方法具有良好的特异性；对本方法进行了重复性试验，得到板内变异系数小于6%，板间变异系数小于10%，说明本方法具有良好的重复性。