牛支原体病流行病学及其诊断技术研究进展

王天宇，李继东，张志诚，郭亚男

(1. 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032；3. 宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002)

牛支原体是柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属、革兰氏染色呈阳性的原核生物，是一种能引起牛肺炎、乳房炎和关节炎等疾病的病原微生物[1]。牛支原体最早于1961年在美国发现，随后在全球传播、流行。在我国2008年辛九庆等[2]首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离出牛支原体；2017年在新西兰奶牛群中暴发牛支原体病，造成多达15.8万头牛被扑杀，截止目前，挪威是唯一没有被牛支原体感染的养牛国家。牛支原体常与多杀性巴氏杆菌和溶血曼海姆氏菌等混合感染，给养牛业造成了严重的经济损失。牛支原体和无乳支原体、丝状支原体丝状亚种等的病原结构以及其致病的临床症状很相似，难以鉴别诊断及预防控制[3]。牛支原体基因组具有的可变脂蛋白家族基因及众多的可插入序列导致牛支原体极易突变，能在不同的地理环境中独立进化，在国际上存在多种基因分型的菌株，表现出高度的多样性[4]。

1 病原学与流行病学

1.1 病原学

牛支原体与其他支原体相似，具有多种形态，在显微镜下呈球形、椭圆形和棒形等；细胞膜由三层膜构成，内、外层由电子密度高的蛋白质与糖类构成，中间层主要由电子密度低的脂质构成，细胞质内含有双链DNA和核糖体，没有内质网、高尔基体等细胞器[1]。牛支原体是能在无活细胞培养物中存活的最小微生物，其基因组大小仅为大肠杆菌基因组的1/5，能够通过0.45 μm微孔滤膜，在加压情况下能通过0.22 μm的微孔滤膜[1]。牛支原体的基因组大小为9.48～10.39 kb，C+G含量较低，仅占27.8%～32.9%。以牛支原体国际参考菌株PG45为例，其基因组包含826个开放阅读框(ORF)，编码密度为89%，能编码众多基因，包括6个rRNA、 34个tRNA基因和96个假定的脂蛋白基因(包括13个vsp基因簇)等。染色体上还含有54个插入序列(IS)和2个整合共轭元件(ICE)即ICEB-1和ICEB-2，大小分别为2.33 kb和3.74 kb，ICEB-1与无乳支原体PG2的ICEA非常相似，所以，牛支原体和无乳支原体被认为是由同一个祖先进化而来的[5]。牛支原体兼性厌氧，能在无活细胞的培养基上生长，适宜在5%～10%的CO2环境下生存，因为基因组较小，缺乏完整的酶系统，代谢活性受到限制，因此不能分解葡萄糖和精氨酸，而是利用有机酸、乳酸和丙酮酸为其生长能源，生长的菌液通常透亮不浑浊，低倍镜下菌落呈典型的煎蛋外观[1, 6]。牛支原体对环境的抵抗力较强，4 ℃的海绵或牛奶中能存活2个月，-20 ℃下能存活半年，-70 ℃下能存活一年以上；对高温敏感，65 ℃热处理2 min或70 ℃热处理1 min活性丧失。

1.2 流行病学

1961年，Hale等从美国一例严重的牛乳腺炎病例中首次分离出牛支原体，由于血清学、生化特性与无乳支原体相似，最初命名为无乳支原体牛变种，被认为是造成牛乳腺炎的病原体之一。这种支原体自发现以来，在世界范围内广泛传播。20世纪60年代在亚洲的以色列和欧洲的西班牙发现了该支原体，随后在20世纪70年代扩展到大洋洲的澳大利亚以及法国等欧洲国家[3]。1975年，Thomas等在英国率先从患有肺炎症状的3～5月龄的荷斯坦小牛中分离出无乳支原体牛变种，动物接种试验发现该支原体可以导致牛发生肺炎，1976年该支原体被正式命名为牛支原体。随后，由牛支原体引起的肺炎与乳腺炎相继在世界各国暴发并报道，包括丹麦(1981)、日本(1982)、瑞士(1983)、摩洛哥(1985)、韩国(1989)、巴西(1989)、爱尔兰(1994)、智利(1997)、南非(2005)、捷克共和国(2007)等。我国于2008年由辛九庆等[2]首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体，现除海南省未发现牛支原体肺炎疫情外，各地相继出现牛支原体感染病例[7-8]。目前，牛支原体呈全球传播，之前没有牛支原体感染的芬兰(2012)和新西兰(2017)也确诊暴发了牛支原体疫病[9-10]。

1.3 流行菌株

1961年美国首次分离出的牛支原体菌株PG45已于2011年完成了全基因组测序，成为牛支原体国际参考株[5]。Rosales等[11]对全球的多个牛支原体分离株进行VNTR分析，发现存在两个主要种群即A和B组，各组包含的分离株与其地理起源高度相关。应用MLST分析发现，源自欧洲的牛支原体分离株主要为CC1组，以色列、澳大利亚和中国的牛支原体分离株主要为CC2组。在CC1组中鉴定出两个常见祖先菌株序列型(ST2和ST19型)，ST2型是代表性牛支原体中最常见的ST型，ST19型是仅来自欧洲大陆(西班牙、德国、法国和立陶宛)的代表性分离株，后者被证明与美国的PG45菌株具有极大的相似性，这一发现支持了牛支原体PG45与欧洲分离株之间存在共同祖先的假说，可能与过去两大洲之间的活牛及其产品贸易有直接关系。CC2组包括了所有中国分离株以及大多数来自以色列和澳大利亚的分离株ST10、ST33和ST34型，该组分离株在地理起源方面表现出高度的多样性，与大多数欧洲分离株分开，支持了牛支原体分离株在地理上独立进化的理论。Yair等[12]和Menghwar等[13]研究发现，中国、以色列和澳大利亚的流行分离株主要为ST10型，提出了中国与以色列的分离株可能来源于澳大利亚的结论，这与中国和以色列从澳大利亚大量进口牛只有关。

1.4 传播途径

牛支原体能在牛群中广泛传播，包括水牛、肉牛、奶牛、野牛在内的所有种类，以及所有年龄段的牛都易感[14]。牛支原体病在牛群中暴发主要是由输入牛只与运输工具携带病原体传播导致的，患病牛和病原携带牛是主要的传染源，被感染的牛可能成为无症状的携带者，持续排出病原体长达数年之久[7]。气溶胶传播是最主要的传播方式，牛支原体通过呼吸道排出，能在气溶胶内存活数月甚至长达几年之久，牛之间的直接接触、排出的分泌液、唾液和粪便都能携带病原造成健康牛的感染。牛支原体也可以发生垂直传播，怀孕母牛能通过胎盘传播给胎儿，还可以通过初乳传播给新生犊牛，在公牛的精液中也检测到了牛支原体的存在[15-16]。牛支原体具有黏附性，寄生于黏膜、纤毛等部位的细胞，可随部分脱落的细胞排出体外，这个排泄过程呈周期性，一般在感染后一周脱落，最快能在24 h后脱落，气候变化、过度拥挤或运输等应激因素可能会加速这一过程使牛更容易受到感染，并引起疾病暴发。除了直接传播，牛支原体还能通过环境因素进行传播，能通过运输车辆、饲料、围墙栏杆、饲喂用具和垫料等传播。有研究表明，牛支原体能在4 ℃的牛奶中存活2个月，在肥料中存活37 d，棉花上存活18 d，稻草上存活13 d，木材和不锈钢上存活1～2 d[3]。除牛之外的一些其他动物也是牛支原体的携带者，如绵羊、山羊、猪、鸡和鹿等都是牛支原体的储存宿主，牛支原体跨物种感染其他动物后又反过来感染牛，造成疾病的循环往复[17-20]。牛支原体通常是不感染人的，但由于长期接触感染牛的牛奶、粪便，农场员工体内检测到了牛支原体[21]。

2 诊断方法

由于牛支原体能与多种病原混合感染，因此对于牛支原体病的鉴别诊断显得尤为重要。目前主要的实验室诊断方法有：病原的分离鉴定、分子生物学方法和免疫学方法。其中分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增技术、DNA微阵列技术、遗传鉴定；免疫学方法主要包括免疫组织化学技术(IHC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2.1 分离鉴定

由于支原体结构简单，因此无法合成氨基酸，并且无法完全或部分合成脂肪酸。为了满足这种高营养需求，支原体培养基通常富含牛心浸出液、血清、酵母提取物和蛋白胨等，培养基pH值为7.3～7.8[1]。接种后的培养基在37 ℃、5% CO2条件下，孵育7～10 d，光学显微镜下可见牛支原体菌落出现“煎蛋”样形态。牛支原体革兰氏染色呈阳性，因为没有细胞壁，革兰氏染色困难，吖啶橙染色效果更好，染色后菌体呈亮红色或橘红色[22]。虽然通过分离培养法鉴定牛支原体相对简单且成本低廉，但存在局限性。如在采集样品时动物必须有活菌排出，这和牛支原体的排泄模式有关。在慢性和亚临床支原体乳腺炎病例中，常有牛支原体呈间歇性排出的情况，其间隔时间甚至能长达56 d，这可能导致单个样本的诊断失败，因此建议应至少采集3份样品并间隔3～4 d，收集后进行培养鉴定[23]。牛支原体的储存对环境要求较高，采集的病料需冷藏并在24 h内送往实验室，也可以冻存运输，但冻存会导致活菌数量降低1或2个数量级。此外，牛支原体的培养经常受到其他柔膜体纲病原的污染，分离难度大、分离周期长，不适用于牛支原体的快速检测[24]。

2.2 分子生物学方法

为了克服常规分离培养的不足，目前已经开发了多种基于核酸的分子检测方法，这些方法具有检测速度快、灵敏性和特异性高等优点。由于基于核酸的分子检测方法是物种特异性的，所以能够区分不同种类的支原体以及牛支原体的不同基因型。常用牛支原体核酸诊断技术比较见表1。

表1 牛支原体核酸诊断技术

2.2.1 PCR技术

应用PCR技术检测来自各种样品类型的支原体具有更高的效率、特异性和敏感性。早期主要利用16S rRNA基因做靶标，但由于牛支原体与无乳支原体的16S rRNA序列一致性高达99%，所以经常发生交叉扩增的现象[25]。为了区分不同病原体，设计了针对16S～23S rRNA间隔区的PCR方法，可以区分支原体与无胆甾原体；使用几个引物组设计的多重PCR，能够同时鉴别感染牛的几种不同支原体，在牛奶样品中的检测下限低至1×101CFU/mL[26-27]。目前，实时荧光PCR技术也逐渐应用于牛支原体的检测。由于与无乳支原体16S rRNA高度的同源性，人们选取了特异性更好的DNA修复基因uvrC基因、ATP结合蛋白oppD/F基因和p81基因等作为靶基因进行特异性扩增，Clothier等[28]针对uvrC基因设计开发了实时荧光PCR检测方法，检测下限低至2.4×102CFU/mL，灵敏度和特异性良好。

2.2.2 等温扩增技术

Zhao等[29]针对牛支原体uvrC基因设计开发了重组酶聚合酶扩增技术与侧流层析试纸分析(RPA- LFD)相结合的检测方法，能在30 min内检测到牛支原体，检测下限为20个拷贝，灵敏度和特异性分别为99%和95.6%。Bai等[30]针对牛支原体uvrC基因设计开发了LAMP法，与普通PCR方法相比较，在纯培养物中测定的灵敏度比PCR高10倍，检测下限为34个拷贝，该方法的灵敏度和特异性分别为100%和74%，灵敏度高，特异性较准确，适宜于在生产中检测牛支原体。Yumiko等[31]针对oppD/F基因区域设计6对引物，改进后的LAMP法，其灵敏度、特异性分别为97.2%和90.9%(kappa系数为0.823 1)。中国农业大学吴文学团队研发的牛支原体环介导等温扩增检测试剂盒于2020年获得了国家新兽药注册证书((2020)新兽药证字35号)。

2.2.3 DNA微阵列技术

Schnee等[32]根据基因组高度保守区16S～23S rRNA间隔区和可变区交替分布的23S rRNA序列，对38个支原体、3个无胆甾原体和3个解脲脲原体设计了70个寡核苷酸探针；为了扩展微阵列的区分能力，将tuf基因视为另一个靶标，设计了86个满足基本选择标准的寡核苷酸探针，经过PCR扩增和生物素化后，在阵列上探针与DNA的杂交可特异性鉴定目标病原，一次最多可以检测出37种支原体。微阵列测定法的主要优点包括操作简便、快速和信息量高，分析灵敏度与实时荧光PCR相当，并且无需培养即可检查野外样品。

2.2.4 遗传鉴定

由于牛支原体基因组相对于病毒较大，全基因测序比较困难，人们使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、可变串联重复序列(VNTR)、多基因座可变串联重复分析(MLVA)和多基因座序列分型(MLST)等对支原体基因组的几个管家基因进行独特的序列分析，用于牛支原体的遗传鉴定与基因分型。最近提出了3种MLST方案用于研究牛支原体的种群结构、进化和传播：Manso-Silvan等[33]开发的MLST方案基于4个管家基因(fusA、gyrB、lepA和rpoB)，分辨力为0.833；Register等[34]开发的MLST方案基于7个管家基因(adh-1、gltX、gpsA、gyrB、pta-2、tdk、tkt)，分辨力为0.923；Rosales等[11]开发改进的MLST方案基于7个管家基因(dnaA、metS、recA、tufA、atpA、rpoD和tkt)，分辨力为0.91(95%置信区间为0.88～0.93)，后两种改进方案均优于第一种方案。

2.3 免疫学方法

不同于牛支原体的分离与PCR检测，免疫学检测方法无需在牛支原体的排泄期采集样本，因为动物机体感染牛支原体所产生的抗体可以保持几个月之久。在病料采集与检测难度方面，免疫学方法具有极大优势，通过优化，免疫学方法在检测牛支原体方面具有良好的灵敏性与特异性。

2.3.1 免疫组织化学技术(IHC)

Hermeye等[36]对脓肿的细支气管或终末呼吸道、肺脏和肾小管上皮细胞等组织进行了染色检测，在显微镜下组织切片可见棕黄色颗粒，呈弥漫性出现于细胞周围，即为牛支原体阳性。

2.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

目前有多种类型的ELISA用于检测牛支原体，包括间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等。利用VSP重组蛋白或膜脂蛋白作为包被抗原以检测血清中的IgG，所建立的间接ELISA方法是检测牛血浆、血清和牛奶等样本的首选方法，应用最为广泛。

间接ELISA检测方法依赖于牛对牛支原体的免疫反应及其产生的抗体。研究显示，动物机体产生的牛支原体抗体可以持续数月，且不受牛支原体间歇性排泄的影响，这表明间接ELISA适用于牛支原体抗体的检测，但几例实验性感染表明，血清IgG抗体转化需要2～3周，在该时间段内进行检测可能显示阴性结果[37]。间接ELISA方法还适用于对牛奶样品的检测，可应用于大罐奶的检测以大规模分析牛群中牛支原体的感染情况，进行流行病学调查，但单个乳样本检测结果往往并不理想[38]。这可能是因为IgG抗体是在血液中产生的，当转移到牛奶中时导致浓度较低的缘故，并且抗体在牛奶中存在的时间没有在血液中持久[39]。CABI的入侵物种纲要对ELISA检测患病牛的鼻拭子、肺、牛奶、关节液和滑膜、精液和生殖器分泌物等样本与血清样本的检测效果进行了比较分析，发现在血清中都能检测到抗体，而其他样品只有相关部位发生炎症时才能检测出来。由此可知，血清样本最适用于做牛支原体的间接ELISA检测样本，但需要注意在血清抗体转化后进行检测诊断，或增加样本检测量以提高准确度。

目前已有开发的牛支原体抗体ELISA检测商品化试剂盒，但阳性检出率差，灵敏度不足[34,39]。最近Wawegama等[40]建立了一种基于MilA蛋白重组片段的间接ELISA，检测实验性感染犊牛，最佳临界值估计为68.6抗体单位(AU)；对于成年牛群，最佳临界值估计为58.7 AU；在自然条件下，育肥牛的最佳临界值估计为105 AU。在此临界值时，诊断灵敏度为94.3%，95%概率区间(PI为89.9%～99.6%)，特异性为94.4%， PI为90.3%～99.6%)。与目前的商品化试剂盒相比，Wawegama等[41]开发的间接ELISA方法诊断灵敏性和特异性更佳，更适用于牛支原体的血清学诊断与流行病学调查。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所辛九庆团队研发的牛支原体ELISA抗体检测试剂盒于2017年获得了国家新兽药注册证书((2017)新兽药证字48号)。

3 常用诊断技术比较

不同诊断技术有各自的优点和不足，对牛支原体常用诊断技术比较的结果见表2[35]。

表2 牛支原体常用诊断技术比较[35]

4 小结

我国是养牛大国，牛支原体病严重危害我国养牛业，掌握其流行病学特征以及诊断技术是控制和预防该病的关键。同时我国也是牛及其产品的进口大国，目前国际上存在多种基因型牛支原体，基因组测序和基因分型鉴定有利于对牛支原体进行分析溯源，有助于降低牛支原体通过国际贸易传入的风险。不同的诊断方法具有一定的优缺点，使用者需针对不同使用环境、不同的诊断需求，选择最合适的方法。目前还需要将新材料、新技术和计算机技术结合起来，研究快速和高通量检测技术，以提高疾病的诊断能力。