TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

王小月，李丹，蓝肇煜，武静桥，范真玮，姚景丽，何敬文，赵微，陈婷，金天明

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有免疫功能的小分子多肽，由10～60个氨基酸残基构成，广泛存在于各种生物体内[1]。由于抗菌肽易被蛋白酶分解，在生物体内不易形成残留，因此，不易形成耐药性，现已成为抗生素替代领域的研究大热点。TLN-58是2016年被发现于人掌跖脓疱病中的一种抗菌肽[2]，含有58个氨基酸，带有7个静正电荷，疏水性为34%，对人红细胞无溶血活性，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌均具有抑菌活性[3]。人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)又名N-乙酰基胞壁酸水解酶，是人体免疫防御的组成部分，其通过水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1，4糖苷键而起到裂解细菌的作用[4]。hLYZ抗菌作用广，因独特的作用机理使得其不会产生抗药性、耐药性、药物蓄积、药物残留及其他副作用。hLYZ对致病菌(包括革兰阳性和阴性菌)都具有明显的抑菌作用，还可增强机体的免疫力[5]。鉴于上述特性，本试验对TLN-58和hLYZ融合基因的细胞毒性进行检测，为后续利用hLYZ和TLN-58融合基因替代常规抗生素时的安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

pMD-TLN-58(KanR)、pMD-hLYZ(KanR)、pEGFP-N1 Vector(KanR)、大肠杆菌XL-10Gold感受态细胞购自上海捷瑞生物工程有限公司；HEK293细胞由天津农学院预防兽医学实验室保存。

1.2 重组真核质粒的构建

根据The Antimicrobial Peptide Database中的TLN-58基因序列(APD ID：AP02750)和GeneBank中hLYZ基因标准序列(NC_000012.10)结合真核表达载体pEGFP-N1分别设计特异性引物(见表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 扩增目的片段的引物

利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别对质粒pMD-TLN-58、pMD-hLYZ和真核表达载体pEGFP-N1进行消化。通过薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对消化产物进行回收和纯化，采用SanPrep柱式胶回试剂盒回收酶切产物。利用T4 DNA连接酶，将双酶切后胶回收获得的hLYZ和TLN-58基因分别与真核表达载体pEGFP-N1于16 ℃连接过夜，采用融合表达的方式构建双基因重组质粒。将制备成功的重组真核质粒分别转化感受态XL-10Gold，再经PCR鉴定和测序分析筛选出阳性菌。

1.3 重组真核质粒转染条件的摸索

根据文献设定重组真核质粒pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58的DNA用量分别为0.5、1、1.5和2 μg，GeneTwinTW转染试剂和质粒的比例设定为1∶3。将GeneTwinTW稀释液滴加到DNA稀释液中，获得转染复合物，然后将转染复合物逐滴加入到24孔板各孔中央，置于5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养。分别在8，12，24及48 h，用倒置荧光显微镜观察并记录，计算转染后细胞存活率，确定质粒DNA的最佳用量，GeneTwinTW转染试剂和质粒的比例及转染时间，试验重复3次。

1.4 RT-PCR检测目的基因表达情况

采用TRIzol法从转染24 h后的HEK293细胞中提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒获得cDNA模板后，以表1中的引物，PCR检测目的基因，对构建的重组质粒进行鉴定。

1.5 DAPI染色和AO/EB染色检测细胞凋亡

首先选择DAPI作为染色剂，将转染成功的HEK293细胞，弃上清液，加少量DAPI覆盖样品，室温染色5～10 min；吸出DAPI染色液，用PBS洗涤2～3次；置荧光显微镜下观察，激发波长360～400 nm，试验重复3次。然后进行AO/EB染色，当转染成功的HEK293细胞汇合度达到80%～90%且生长状态良好时，离心后调整细胞浓度为1×106个/mL，取90 μL细胞悬液，加入5 μL AO染色液和5 μL EB染色液(AO∶EB=1∶1)，室温避光孵育1～5 min，充分作用后置于荧光显微镜下观察，试验重复3次。

1.6 CCK-8法检测重组真核表达产物的细胞毒性

为了确定重组真核质粒对HEK293细胞的的细胞毒性，通过CCK-8试验检测重组质粒对细胞活力的影响。将对数生长期且状态良好的HEK293细胞调整细胞浓度为5×104个/mL，充分混匀后，96孔板中每孔加100 μL，置于恒温培养箱中培养24 h。重组真核质粒的DNA用量分别为0.5、1、1.5和2 μg，GeneTwinTW转染试剂和质粒的比例为1∶3混匀，终体积为100 μL，每组均设5个复孔，同时设置PBS加细胞、培养基加细胞和只加培养基3组对照。孵育一定时间(24，48，72及96 h)，到达检测时间点时，弃去培养液，每孔加入100 μL稀释后的CCK-8溶液；37 ℃培养箱中避光孵育0.5，1，2及4 h，使用酶标仪检测OD450值，试验重复3次。

按下列公式计算细胞活力：细胞活力(%)=(AC-A0)/(AS-A0)×100% 。

AC(试验组)：转染后细胞的吸光度；A0(空白组)：不含细胞的吸光度；AS(对照组)：有细胞，但细胞没被转染的吸光度。

1.7 流式细胞术检测转染重组质粒对细胞周期的影响

在6孔细胞培养板中转染成功的HEK293细胞汇合度达到80%～90%且生长状态良好时，进行细胞周期检测。根据细胞周期检测试剂盒KGA511-KGA512说明书处理细胞：用PBS洗涤2次，离心弃去上清后，收集并调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL单细胞悬液离心，去除上清液，在细胞中加入体积分数为70%冷乙醇500 μL固定(2 h至过夜)，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液，将Rnase A∶PI工作液按1∶9体积配制成染色工作液，在每管中各加500 μL染色工作液，室温避光30～60 min，用流式细胞仪检测，记录激发波长488 nm处红色荧光，每组设3个重复。

2 结果与分析

2.1 重组真核质粒的构建

利用特异性引物，以pMD-TLN-58和pMD-hLYZ质粒为模板，经过双酶切和产物胶回收转化感受态细胞XL-10Gold，获得重组真核质粒，菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别扩增到638 bp的hLYZ和TLN-58融合基因片段、464 bp的hLYZ基因片段和197 bp的TLN-58基因片段，目的条带与预期相符，结果见图1。将测序结果与GenBank中的标准序列进行BLAST分析比对，结果表明，TLN-58基因和hLYZ基因序列与已发表的基因序列的同源性为100%，且无碱基缺失、增添和突变。阳性重组真核质粒分别命名为pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58。

M.DL2500 Marker；1.hLYZ-TLN-58 基因；2. hLYZ 基因；3. TLN-58 基因

2.2 重组真核质粒转染HEK293细胞的条件优化

在荧光倒置显微镜的蓝色激发光下，观察24孔细胞培养板中经重组真核质粒转染24 h后的HEK293细胞绿色荧光蛋白表达量和细胞状态。当质粒DNA用量为1 μg和GeneTwinTW转染试剂用量为3 μL时，转染24 h为最佳转染条件，此时的绿色荧光蛋白表达量最高且细胞状态较好，见图2。

2.3 RT-PCR检测目的基因表达情况

分别利用表1中的引物，PCR检测各重组真核质粒转染24 h后的HEK293细胞中hLYZ-TLN-58融合基因、hLYZ基因和TLN-58基因转录情况，结果显示分别在638、464和197 bp处获得目的基因条带(见图3)。表明重组质粒携带目的基因，并可在HEK293细胞中正确转录表达。

2.4 重组质粒对细胞凋亡的影响

将重组真核质粒分别转染HEK293细胞，24 h后将转染后的细胞经DAPI染色，显微镜下观察，细胞核变化情况较对照组区别不大，未呈致密浓染，未见明显细胞凋亡。用重组真核质粒转染HEK293细胞24 h后，经AO/EB染色结果显示，对照组的细胞多呈绿色荧光，未见细胞病变(CPE)，在pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58组中观察到凋亡细胞现象较少，结果见图4。

图2 荧光显微镜下观察转染HEK293细胞

M.DL2500 Marker；1.hLYZ-TLN-58 基因；2. hLYZ 基因；3. TLN-58 基因

图4 DAPI染色和AO/EB染色检测细胞凋亡

2.5 重组真核表达产物对细胞毒性作用的检测

重组真核质粒转染HEK293细胞24 h后细胞活力随着质粒用量的增加而降低，当质粒用量为1 μg时细胞活力最大，加CCK-8后孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的光吸收值较稳定。利用CCK-8测定分析重组质粒的细胞毒性，当pEGFP-N1质粒用量为4 μg时，转染96 h加CCK-8后孵育4 h其细胞活力最小为62.48%；当pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58质粒用量为2 μg时，转染96 h加CCK-8后孵育2 h其细胞活力最小为61.01%；当pEGFP-N1-hLYZ质粒用量为4 μg时，转染96 h加CCK-8后孵育4 h其细胞活力最小为65.47%；当pEGFP-N1-TLN-58质粒用量为4 μg时，转染96 h加CCK-8后孵育4 h其细胞活力最小为66.62%。重组真核质粒的细胞活力较好，说明重组真核质粒的细胞毒性较小，为安全低毒，重组真核质粒的构建是完全有意义的。结果见图5-图8。

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

2.6 转染重组质粒对细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，试验组pEGFP-N1-TLN-58转染的细胞与对照组未经转染的细胞相比G1%、G2%比例升高，S%比例降低，但升高和降低均不显著(见图9)。经重组真核质粒转染后的试验组细胞与对照组的细胞相比G1%、G2%和S%无显著区别。说明经重组质粒转染后对细胞周期无显著影响。

图9 流式细胞仪检测细胞周期

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，抗生素的频繁使用，导致越来越多的病原微生物对传统抗生素不仅出现了耐药性，还有很强的毒副作用。这一情况使得人类对新型抗菌药物的探究变得非常迫切，利用基因工程技术在生物、食品、医学等领域开展相关研究变得越来越广泛[6]。研究表明抗菌肽是生物体内天然防御系统的一个重要组成部分，抗菌肽TLN-58抗菌谱广，对革兰阳性菌和阴性菌均有抑制作用[7]。hLYZ具有广谱抗菌性，对奶牛乳房炎的主要致病菌如金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等都具有明显的抑制作用[8]。TLN-58和hLYZ联用可增加抑菌效果和抑菌谱。天然的TLN-58和hLYZ抗菌肽分布广但获取困难，因其分子量大，难以形成正确的空间构象，无法实现人工直接合成，需要采用基因表达的方式纯化出蛋白。通过本研究可实现TLN-58和hLYZ融合表达，无细胞毒性，为后续纯化蛋白奠定基础。

一般情况下，通过筛选、优化影响转染效率最大的因素，即转染试剂GeneTwinTW和DNA质粒的用量以及转染时间，进而确定转染试剂和DNA质粒的最佳用量[9]。本研究结果表明，转染试剂GeneTwinTW和DNA质粒的用量及转染时间都影响着细胞的转染效率。当质粒DNA用量为1 μg、GeneTwinTW转染试剂用量为3 μL时，即GeneTwinTW转染试剂和质粒DNA用量比例为1∶3，转染时间为24 h时，能得到最佳的转染条件，且该转染条件不会影响绿色荧光蛋白的正常表达。本研究构建的重组真核质粒均在HEK293细胞中获得转录，筛选出最优转染条件可以提高目的基因的表达效率。

通过DAPI染色、AO/EB染色和CCK-8法检测细胞凋亡，测定经过不同质粒DNA用量转染HEK293细胞的相对增殖率，可用于分析重组质粒的细胞毒性[10]。本研究获得的重组质粒经试验证实细胞毒性相对较小。利用流式细胞术检测细胞周期，结果显示，在G1、G2及S期各处理组无显著差异，证明构建的重组质粒对HEK293细胞周期无显著影响。

综上，本研究首次将TLN-58和hLYZ融合表达，构建出能够高效稳定融合表达外源基因的真核表达载体pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58，通过对重组真核表达质粒细胞毒性的验证，为后续该融合蛋白抑菌活性研究奠定基础。