H3N2亚型犬流感病毒头部缺失血凝素蛋白的真核表达及抗原性研究

李思宇，赵丹，温霞，刘永杰

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

犬流感是由犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)引起的以流涕、咳嗽、发热，甚至死亡为主要临床表现的一种病毒性疾病[1]。2004年在美国的佛罗里达州，H3N8亚型流感病毒由马传播至犬，引起犬呼吸系统疾病，并在犬群内传播，被命名为“H3N8亚型犬流感病毒”[2]；随后，在韩国[3]、中国[4]、泰国[5]以及美国[6]等多个国家和地区相继出现了H3N2亚型犬流感病毒的报道。近年来，还发现了许多其他亚型，如H1N1、H5N1、H5N2、H10N8等流感病毒感染犬[7]，特别是不同亚型流感病毒感染犬后可出现基因重组现象，如Song等[8]分离出的H3N1亚型流感病毒为H1N1(CA/09)及H3N2亚型病毒重组的结果。CIV不仅对犬的生存和健康带来严重危害，同时也给人类健康带来巨大的风险。犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，存在犬作为中间宿主将流感病毒传播给人的风险。因此开展犬流感的防控研究具有十分重要的公共卫生意义。

疫苗免疫是防控流感最有效的手段。由于可感染犬的流感病毒亚型较多，针对某一特定亚型的犬流感疫苗保护范围较小，研制一种可抵御不同亚型流感病毒感染的广谱疫苗已成为目前的研究热点。流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)的茎部区域较为保守，是研制流感通用亚单位疫苗的理想靶向区域[9]。为减少HA头部区免疫显性带来的影响，本研究将HA基因的头部区去除，使得免疫应答定向在HA保守茎部结构域，从而为研发具有更广泛保护作用的犬流感广谱疫苗，抵御多种亚型流感病毒的感染奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株、细胞及实验动物

H3N2亚型CIV毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010的血凝素基因HA，GenBank序列号为JN247619，由Lin等[10]分离；H1N1亚型人源流感病毒毒株A/Jiangsu/1/2009 (H1N1)，由江苏省疾病预防控制中心祁贤研究员馈赠；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)感受态细胞，购自上海唯地生物科技有限公司；草地贪夜蛾细胞(sf-9)由江苏省农科院兽医研究所王永山研究员馈赠；犬胚胎肾细胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)，购自ATCC并由本实验室保存；6周龄雌性BALB/c小鼠购自扬州大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

抗His-Tag鼠单克隆抗体，购自艾比玛特(Abmart)生物医药(上海)有限公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG 抗体、硝酸纤维素膜(NC)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；His(组氨酸)蛋白纯化镍柱、超灵敏化学发光检测试剂盒，购自上海雅酶生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)，购自Gibco公司；cDNA反转录试剂盒、DNA连接试剂盒、2×PCR Mix、高保真酶Prime STAR HS、EcoRⅠ、X-gal、IPTG、反转录酶 (M-MLV) 、pMD19-T Simple Vector试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；BAC/PAC DNA Isolation Kit、RNA提取试剂盒，购自Omega公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司；pFastBac HTA质粒购自上海唯地生物科技有限公司。H3N2亚型CIV阴、阳性抗小鼠血清由南京农业大学兽医微生物学实验室保存。

1.3 病毒RNA的反转录

根据Geneaid病毒RNA提取试剂盒说明书操作。提取H3N2亚型CIV病毒RNA，并以其为模板，进行反转录。采用20 μL反转录体系：4 μL 4×gDNA wiper Mix，1 μL Uni12，1 pg～1 μg RNA，用移液器轻轻吹打混匀，于PCR仪中42 ℃加热2 min；在上述体系再加入5 μL 5×HisScript Ⅱ Select qRT SuperMix Ⅱ，上述溶液混合均匀后于PCR仪中50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，产物即为cDNA，于-20 ℃保存。

1.4 头部缺失HA基因片段的克隆与鉴定

1.4.1 引物的设计与合成

根据HA基因(GenBank登录号JN 247619)设计引物，见表1。优化的头部区去除的HA片段构建见图1。用四甘氨酸接头肽取代位于C 52～C 277的HA球状头部结构域(红色区域)；片段1为四甘氨酸接头肽前的HA茎部区域；为保证头部缺失HA片段蛋白质的正确折叠[11]，将T4折叠三聚体结构序列基因分成4段，通过引物合成的方式分别加在片段2、片段3、片段4和片段5的下游引物序列中，得到含T4折叠三聚体结构(以下简称为T4)的头部区去除HA片段；片段2：片段1+HA2+T4 的前27个碱基；片段3：片段2+T4的28～55个碱基；片段4：片段3+T4的56～77个碱基；片段5：片段4+T4的78～81个碱基；片段6：含T4结构的头部去除区HA片段。所用引物序列信息见表1，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4.2 头部缺失HA片段的基因扩增与克隆

以反转录回收的cDNA为模板，以HA1-1-F、HA1-1-R为引物扩增片段1，以HA2-T4(27)-F、HA2-T4(27)-R为引物扩增片段2；以片段2为模板，以HA2-T4(55)-F、HA2-T4(55)-R为引物扩增片段3；以片段3为模板，用HA2-T4(77)-F、HA2-T4(77)-R为引物扩增片段4；以片段4为模板，用HA2-T4-F、HA2-T4-R为引物扩增片段5；将片段1和片段5进行融合PCR，用1%的琼脂糖凝胶分别对产物进行电泳，按照DNA胶回收试剂盒步骤回收纯化得到906 bp大小的片段6。将片段6同源重组连接到pMD19-T载体中，转化至大肠杆菌DH5α；蓝白斑筛选白色菌落，菌液PCR鉴定正确的质粒送测序，测序正确得到含T4结构的头部缺失HA片段质粒，命名为T-HAj-T4。

1.5 重组杆状病毒转移载体及穿梭质粒的构建

按照质粒提取试剂盒说明书提取T-HAj-T4质粒，用EcoR和XhoⅢ限制性核酸内切酶对T-HAj-T4和pFastBac HTA质粒进行酶切，胶回收目的片段，按分子克隆法连接、转化，在氨苄霉素平板上挑取单菌落，酶切鉴定，阳性质粒命名为HAj-T4-pFastBac。将HAj-T4-pFastBac转化至含Bacmid DNA和Helper plasmid的DH10Bac感受态，在LB培养基中于37 ℃振荡培养4 h，用LB培养液稀释至10-2，涂布卡那霉素(50 mg/L)、庆大霉素(7 mg/L) 、四环素(10 mg/L) 3种抗性的平板(含100 mg/L X-gal和40 mg/L IPTG),蓝白斑筛选, 挑取白色菌落，用流感病毒通用引物M 13(上游5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，下游5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)进行PCR鉴定，鉴定正确的质粒命名为HAj-T4-DH10，空载体质粒pFastBac HTA作为阴性对照。

表1 引物序列

图1 头部去除区HA片段的设计及优化

1.6 穿梭质粒转染昆虫细胞

用BAC/PAC DNA Isolation Kit质粒提取试剂盒抽提HAj-T4-DH10质粒。按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System说明书步骤将穿梭质粒HAj-T4-DH10转染至对数生长期的昆虫细胞sf-9，另一加入等量脂质体的细胞孔作为阴性对照，72 h后在显微镜下观察细胞有无病变。当细胞发生明显病变后, 收集细胞上清，即为第1代重组杆状病毒，命名为P1-HAj-T4。用第1代重组病毒感染对数生长期的sf-9昆虫细胞，72 h后收集细胞上清，为第2代重组杆状病毒。按此方法获得第3代病毒P3-HAj-T4。试验同步设立未插入目的基因片段的空载体质粒pFastBac HTA转染sf-9细胞作为对照。

1.7 头部缺失HA片段在昆虫细胞中的表达

用第3代重组病毒P3-HAj-T4感染对数生长期的sf-9昆虫细胞，72 h后分别收集上清和细胞沉淀。用Binding Buffer按照原体积的1%重悬细胞沉淀后进行超声破碎，离心去除沉淀，使用His蛋白纯化镍柱进行蛋白纯化。

1.8 穿梭质粒在昆虫细胞中的表达产物鉴定

将纯化后的头部缺失HA结构蛋白与 SDS蛋白上样缓冲液按照4∶1混合，沸水煮样5 min，浓缩胶电压80 V，分离胶120 V进行SDS-PAGE，电泳后切下包含目的蛋白大小位置的凝胶。按照0.8 mA/cm2通电转印1.5 h，将蛋白转印至NC膜上后，用5%的脱脂乳4 ℃封闭过夜，分别与抗His标签抗体、CIV全病毒抗体室温结合1 h，PBST洗涤3次后，与HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶2 000) 室温结合1 h。PBST洗涤3次。应用超灵敏ECL发光液为底物溶液显色5～30 min后进行曝光显色观察。

1.9 小鼠血清抗体的制备

取10只6周龄雌性BALB/c小鼠，后腿部肌肉注射纯化后的头部缺失HA蛋白，首次免疫剂量为100 μg/只，二免和三免的免疫剂量为150 μg/只；每组小鼠均免疫3次，每次免疫间隔14 d。收集三免后14 d的小鼠血清，以10 μg/mL的头部缺失HA蛋白包被酶标板，4 ℃过夜，用5%脱脂乳37 ℃封闭2 h。将待测血清2倍比稀释后按100 μL/孔加入96孔反应板中，设立阴性对照及小鼠阳性血清对照，37 ℃孵育1.5 h后洗涤，加入1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1.5 h后洗涤。最后加入TMB单组分显色液显色，2 mol/L硫酸终止液终止显色，用酶标仪读取每孔的OD450值。

1.10 血清抗体的中和试验

为了验证头部缺失HA结构蛋白血清中抗体能否抑制不同亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应(CPE)，在MDCK细胞上进行了微量细胞中和试验。将免疫组小鼠的血清抗体起始浓度调整为1 mg/mL，在1.5 EP管中预先进行2倍比稀释，100 μL/孔，每个稀释度做3个重复，计算所需用量，分别加入96孔板中。将实验室保存的甲型H1N1流感病毒稀释至200TCID50，100 μL/孔加入不同稀释度的血清抗体，37 ℃静置孵育1 h后，吸出每孔内液体，加至汇合度为80%左右MDCK细胞的96孔板中，同时设置阳性对照(已知阳性抗体)、病毒对照(只加病毒)及空白对照(只加培养液)。观察CPE产生情况；同样的方法观察血清抗体与实验室保存的甲型H3N2流感病毒的作用情况。中和效价以抗体中和病毒使50%细胞不产生病变的最高稀释度来表示[12]。

2 结果

2.1 头部缺失HA片段基因的扩增

提取病毒总RNA，以反转录回收的cDNA为模板，分别扩增得到片段1、片段2、片段3、片段4和片段5，片段1和片段5进行PCR融合得到片段6(头部缺失HA片段)(图2)。

2.2 重组供体质粒的鉴定

使用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切重组供体质粒HAj-T4-pFast Bac，经琼脂糖凝胶电泳分析可见4 790 bp大小的载体片段和906 bp大小的目的基因片段(见图3)。

2.3 重组穿梭质粒的鉴定

重组穿梭质粒HAj-T4-DH10经M13引物特异性扩增，琼脂糖凝胶电泳分别得到3 300 bp大小的条带。未插入目的片段的pFastBac HTA空载体质粒阴性对照经PCR扩增得到的片段大小为2 430 bp(图4)。

M. DNA分子量标准(DL2000)；1～6. 分别为片段1～片段6

M. DNA分子量标准(DL5000)；1. 双酶切的HAj-T4-pFast Bac质粒

M. DNA分子量标准(DL5000)；1～4. HAj-T4-DH10质粒；5～8. pFastBac HTA-DH10载体质粒

2.4 重组杆状病毒的鉴定

正常sf-9细胞贴壁生长，呈多角形(图5A)；穿梭质粒转染sf-9细胞后第3天，细胞出现脱落、漂浮、破碎等(图5B)，表明细胞被重组杆状病毒侵袭。

A. 正常细胞；B. 重组穿梭质粒转染昆虫细胞第3天

2.5 重组蛋白的表达与检测

采用SDS-PAGE分析头部缺失HA蛋白的表达，结果发现纯化的蛋白在47 ku大小的位置上出现单一条带(图6A)，大小与预期蛋白分子量相符；采用His标签抗体作为一抗进行Western blot分析(图6B)，进一步证实蛋白成功表达；头部缺失HA蛋白经CIV全病毒抗体Western blot验证(图6C)，表明其具有良好的免疫反应性。

A. 表达蛋白的SDS-PAGE分析：M. 蛋白Marker；1. 感染pfastBac HTA空载毒的细胞超声破碎产物；2. 纯化的头部缺失HA蛋白；3. 细胞上清液；4. 未纯化的头部缺失HA蛋白

2.6 间接ELISA法测定小鼠免疫血清抗体

用纯化的头部缺失HA蛋白包被酶标板，以小鼠三免后第14天的血清作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体作二抗，进行ELISA效价测定，结果显示免疫组小鼠血清抗体具有较高的效价，为1∶12 800。表明纯化的头部缺失HA蛋白对小鼠具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性抗体。

2.7 头部缺失HA结构蛋白血清抗体的中和活性测定

正常的MDCK细胞呈长梭形单层上皮样细胞形态(图7A)。当H3N2亚型毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010感染MDCK细胞后出现明显细胞病变(图7B)，血清抗体稀释320倍时(图7C),MDCK细胞无明显细胞病变；而当血清抗体稀释640倍时(图7D)，部分细胞发生病变。因此头部缺失HA蛋白制备的小鼠抗血清对H3N2亚型流感病毒感染引起的细胞病变效应有一定的抑制作用，其中和效价为1∶320。

A. 正常细胞组；B.H3N2病毒对照组；C. 1∶320稀释血清抗体组(H3N2感染)；D. 1∶640稀释血清抗体组(H3N2感染)；E. H1N1病毒对照组；F. 1∶160稀释血清抗体组(H1N1感染);G. 1∶320稀释血清抗体组(H1N1感染)

当H1N1亚型毒株A/Jiangsu/1/2009(H1N1)感染的阳性对照出现明显细胞病变(图7E),血清抗体稀释160倍时(图7F),MDCK细胞无明显细胞病变；而当血清抗体稀释320倍时(图7G)，部分细胞发生病变。因此头部缺失HA结构小鼠血清抗体对H1N1亚型流感病毒感染引起的细胞病变效应有一定的抑制作用，其中和效价为1∶160。

3 讨论

犬流感是一种新发传染病，由于其在公共卫生上的重要意义，开展疫苗研究防控犬流感病毒的传播和流行势在必行。目前对CIV疫苗研究已取得一些进展，主要集中在全病毒灭活苗上。2009年，美国农业部批准的H3N8亚型CIV疫苗上市，有效减少了该亚型病毒的传播；2012年，韩国针对H3N2 CIV的疫苗获得授权；2016年美国农业部批准H3N2犬流感疫苗上市。尽管目前流行的犬流感病毒以H3亚型为主[13]，但由于流感病毒变异非常快，并容易发生重组，因此研发一种能够针对不同亚型或同一亚型不同突变株提供最大限度保护作用的通用疫苗非常必要。

2004年，在犬体内发现马源犬流感病毒后，人源、猪源、禽源等多种不同动物来源的犬流感病毒相继出现[14]。这些病毒在犬体内复制、重配，甚至通过犬传播至其他宿主，对其他动物造成威胁。犬源H3N2与人源H1N1病毒的基因片段具有高度相容性，北美三重配体H3N2、欧亚类禽H1N1和pdm09/H1N1三种流感病毒在猪体内重配产生独立的两种H1N1流感病毒，感染犬后与H3N2病毒重配产生猪源重配犬流感病毒H1N1[7]。该猪源CIV对人类的威胁更为严重，对人类的适应性较强，能在人体内成功复制，因此重组H1N1 CIV 病毒能跨种传播至人类。目前在犬体内流行较为常见的亚型为H3N2，而H1N1亚型在人类较为多见，因此本试验以犬源H3N2和人源H1N1亚型流感病毒为研究对象，探究头部缺失HA的血清抗体抵御病毒感染的能力，为后续研发具有广谱性保护作用的头部缺失HA亚单位疫苗奠定基础。

目前已有的流感疫苗诱导产生的抗HA抗体大多针对HA头部，研究表明针对相对保守的HA茎部的广谱中和抗体能中和不同亚型的流感病毒，是近年来流感疫苗研究的一个热点[15]。Wang等[16]根据广谱单克隆抗体12D1的结合表位设计并合成了基于HA2的多肽疫苗，证实该疫苗能保护小鼠抵抗H3N2、H1N1和H5N1等亚型流感病毒的感染，为广谱流感疫苗的设计提供参考。连接HA1半胱氨酸 C52和C277的保守二硫键的侧翼环状结构构成了HA球形头部结构域的主体，而HA1的N51和C52氨基酸从半胱氨酸桥向下延伸并形成茎部区域[17]。由于C52和C277在HA的三维结构中接近，有研究表明用短接头肽取代中间环不会破坏分子其余部分的折叠[17]，因此本研究设计用四甘氨酸接头肽代替HA1头部，去除有免疫优势的HA1头部，使得免疫反应针对更加保守的HA茎部结构域，又不破坏HA茎部分子三维结构，利用杆状病毒表达系统成功表达头部缺失HA蛋白，证实其具有良好的抗原性；进一步通过中和试验验证了该血清抗体对H3N2、H1N1两种不同亚型流感病毒感染均有一定的保护作用。但整体来看中和效价不高，分析原因可能是HA1球状头部被四甘氨酸接头肽取代后，HA血清抗体的中和位点形成空间位阻, 从而降低了血清抗体的中和活性。

为保护蛋白天然构象，本试验在HA茎部添加了T4折叠三聚体，其对抗原蛋白免疫效果是否存在影响需要进一步研究。另外，本研究虽然在昆虫细胞内成功表达了头部缺失HA蛋白，但蛋白产量偏低，限制了其作为亚单位疫苗在临床中的应用，未来试验中将进一步优化蛋白表达条件。另外，以该头部缺失HA片段为亚单位疫苗的免疫效果尚需后续通过动物试验进一步验证。

综上，本研究成功构建了含头部缺失HA基因的穿梭质粒并验证了其转染昆虫细胞后真核表达的蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫应答，这为后续以头部缺失HA区域为靶向的广谱性犬流感疫苗研究奠定基础。