奶牛养殖场环境微生物群落结构及多样性研究

闫艳华，曹慧慧，董李学，杜瑞焕 ，郑百芹,李爱军*

(1. 唐山市食品药品综合检验检测中心，河北 唐山 063000；2. 河北省农产品质量安全检测技术创新中心，河北 唐山 063000；3. 唐山市功能性农产品产业技术研究院，河北 唐山 063000)

近年来，我国畜牧业持续稳定发展，其所带来的畜禽污染物(主要包含畜禽粪便、尿液和冲洗水)造成的环境问题不容忽视。畜禽粪便中携带的病原微生物主要包括细菌、病毒和寄生虫等，其中致病微生物的种类及数量最为丰富，且对养殖动物的健康及其产品存在极大的威胁。随着第2代高通量测序技术在微生态领域得到广泛的应用，越来越多的领域通过该方法解决了以往难以解决的科学问题[1]。李红梅等[2]采用16S rDNA高通量测序方法揭示了四川省邛崃市金利猪场的空气微生物群落结构，假单胞菌属、放线菌属和链球菌属是优势微生物。孙翠丽等[3]采用高通量测序方法检测了位于内蒙古不同城市的10个规模化羊场的空气微生物群落结构及多样性，指导羊场疾病防控。但是利用该技术研究奶牛养殖场环境菌群的还鲜见报道。

原料乳中微生物来源广、种类多，奶牛的饲养环境、榨乳间的卫生条件、原料乳的运输过程等都可能对原料乳中微生物的种类和数量产生影响。原料乳中的微生物菌群组成和数量直接影响乳制品质量与安全。刘洋等[4]、刘潇忆等[5]、马园等[6]通过检测发现榨乳过程会在原料乳中产生多种微生物污染，奶牛的乳房、榨乳设备、环境卫生状况都会直接影响原料乳中的微生物数量和种类。

本研究基于高通量测序技术对奶牛养殖场中粪便、冲洗和养殖用水、榨乳设备、运乳罐和牛乳房擦拭样品的微生物群落结构和多样性进行研究，可对原料乳中可能出现的微生物种类进行预判，对控制原料乳中微生物污染来源，有针对性地对养殖场进行消毒灭菌来保证奶牛的健康提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.1.1 试验地点与动物

本研究在唐山市郊规模化奶牛养殖场(存栏奶牛1 500余头)进行，奶牛品种为荷斯坦奶牛。

1.1.2 牛体(C1)采样

随机选取3头榨乳间奶牛，在每头牛靠近乳房处选择2处约9 cm2面积，用无菌脱脂棉球蘸取0.9%生理盐水各涂抹3次，检样编号标记为C1.1～C1.6(C1代表牛体)，涂抹后的棉拭子迅速放入已灭菌的10 mL生理盐水试管中，投入液氮罐保存备检。

1.1.3 榨乳设备(E)样本采集

根据榨乳设备位置分布，选取能覆盖全场的6个设备将无菌脱脂棉球用0.9%无菌生理盐水沾湿，在设备检验表面涂抹，1个检样用3个无菌脱脂棉球涂抹，涂抹完后立即放入装有10 mL生理盐水的试管中并依次编号为E1～E6，投入液氮罐保存备检。

1.1.4 牛粪便(F)样本采集

选取养殖场中南北方向长条形运动场的6个采样点：南1、东2、东3、西4、西5、北6。每个点选中后拨开表层，采集无尿液等杂质的粪便1 g左右，用无菌钥匙放入无菌试管中并依次编号为F1～F6，投入液氮罐保存备检。

1.1.5 养牛场水体(W)样本采集

选择清洗用水(W1～W3)、养殖用水(W4～W6)进行采样，每个样品采集>10 L水过滤后将滤膜(滤膜剪下或拆下)转移到无菌离心管中保存备检。

1.1.6 运乳罐(E2)样本采集

对运乳罐的内壁和出奶罐口用无菌脱脂棉球(0.9%无菌生理盐水沾湿)进行涂抹取样，涂抹完后立即放入装有10 mL生理盐水的试管中并标记编号为E2.1～E2.6，投入液氮罐保存备检。

1.2 基因组DNA提取和PCR扩增

根据细菌DNA抽提试剂盒(E.Z.N.A. Stool DNA Kit，Omega)说明书进行各样本的细菌总DNA提取，以提取的DNA作为PCR模板，扩增16S rRNA基因的V3～V4高变区。PCR反应的正反向引物分别为341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-TAATCTWTGGGVHCATCAGG-3′)，纯化PCR扩增产物，通过HiSeq2500平台进行测序(华大基因公司进行)。

1.3 测序数据分析处理

对测序得到的原始数据进行初次质控，将2条序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时要求去除含有N的序列、引物和接头序列，得到原始标签序列(Tags)数据 (Raw Tags)[7-8]，然后使用FLASH软件对原始Tags进行截取、过滤和去嵌合体序列等处理，得到最终的高变区有效数据(Effective Tags)[9]。利用UPARSE 软件对全部样品的有效Tags进行聚类，按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)聚类成为分类单位(operational taxonomic units，OTUs)[10]，在聚类过程中利用UCHIME (v4.2.40)软件将PCR扩增产生的嵌合体从得到的OTUs代表序列去除[9]。采用RDP Classifier 贝叶斯算法[11]对OTUs代表序列进行分类学分析，并在门、纲、目、科、属阶元水平统计各样本的群落组成及物种的丰度分布情况。利用QIIME(v1.80)软件计算样品的Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数的Alpha多样性值[12]，使用R语言工具绘制稀释型曲线、Venn图，得到样品内物种丰富度和多样性信息及其共有和特有OTUs信息等。根据Beta多样性距离对样品细菌群落进行聚类分析，使用Weighted UniFrac距离矩阵做UPGMA聚类分析，构建树状结构，用于样品的物种组成及差异的直观分析。用PCoA主坐标分析法研究样本群落组成的相似性或差异性[13]。

2 结果与分析

2.1 样品测序结果及取样深度验证

通过对养殖场的粪便、冲洗和饮用水、牛体与采奶、贮奶设备中细菌基因组16Sr RNA(V3～V4区)进行高通量测序，获得了其微生物群落结构的组成。每个样品的序列信息如表1所示，共读取到原始序列条数为1 640 803条，拼接后得到1 633 370条Tags，拼接率为99.55%，Tag平均长度为(414±6)bp(去接头)，测序深度均超过99.4%，拼接的Tags经过优化得到1 599 416条，根据barcode和引物区分样本，在对初始序列进行去冗余处理后，在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTUs，统计得到各个样品在不同OTUs中的丰度信息，30个样品共产生26 337个OTUs。其中奶牛乳房擦拭样品(C1)、榨乳设备(E)和奶牛粪便(F)样品中的OTUs数目普遍高于养殖用水和运乳罐样品，说明C1、E、F样品微生物多样性较高。生乳运输罐(E2)样品的OTUs数目和微生物多样性最低。

30个样品的稀释曲线如图1所示，所有曲线已趋于平缓，即再增大数据量对OTUs的发现也没有影响，可以说样本的OTUs覆盖度已基本饱和，说明测序数据量合理，更大的测序量不会引起物种多样性的显著增长，基于现有数据量的分析结果准确可靠。

表1 样本的序列信息

图1 各样本的稀释性曲线

2.2 奶牛场不同采样点细菌群落之间的差异性和多样性

2.2.1 样品OTUs聚类分析

从图2可以看出，5种样本共有的OTUs为585个，占各样品OTUs总数的7.7%～27.7%，数据显示C1、E、F样本微生物群落丰富且重叠性较大，分析原因可能是与奶牛受粪尿等污物的污染且不能及时清理有关，造成奶牛卧床时乳房与地面、污物的接触机会增多导致牛体自身微生物增多，榨乳时乳房未彻底清洁即接触采奶设备导致的交叉污染。另外每种样本特有的OTUs分别为178、233、44、319和139个，表明不同样本的细菌组成存在一定差异。

图2 5种样本的细菌OTUs维恩分析

2.2.2 Alpha多样性分析

不同样本的Alpha多样性指数如表2所示，C1、E、F样本Chao指数分别达到1 510、1 489和1 116，明显大于W、E2样本，表明牛体、粪污和采奶设备微生物群落的总体丰富度较高。由表2综合分析可知，E和F的 Shannon指数明显高于其他组样本，说明采奶设备和粪污的细菌群落具有较高的多样性，其次为C1，运乳罐E2的物种多样性最差。

表2 样本中Alpha多样性指数

2.2.3 细菌菌群结构差异分析

由图3聚类树分析可见，所采集样本的微生物群落根据进化关系聚类为两大分支：样本E、F、C1聚类构成一个大支，群落相似性较高，另外此大支内包含1个W和2个E2样品，推测可能是相邻空间微生物气溶胶扩散导致；样本E2与W中细菌群落相似度较高构成另一大支。

图3 样本物种相似度聚类树

2.3 样品细菌群落的组成与丰度分析

基于OTUs的物种分类分析，在相似性为0.97水平上，30个样本中的细菌种类共注释到35个门，79个纲，119个科，127个目，436个属，210个种。由图4可见，在门水平上，丰度最高的包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、螺旋菌门、软壁菌门和梭杆菌门。其中，变形菌门在所有样本细菌类群中所占比例极高，尤其是养殖用水(W)样本中变形菌门占比81.8%；牛体乳房擦拭样品(C1)中优势细菌类群与采奶设备(E)和粪便(F)样本相似，丰度最高的细菌均是厚壁菌门，但所占比例不同，分别占各样本细菌总量的32.4%、44.7%和53.4%；运乳罐(E2)所采样本中丰度最高的细菌是放线菌门，占比56.4%。

进一步分析发现(图5)，30个样本中在属水平上已注释到的物种丰度前10位分别为不动杆菌属、节杆菌属、鞘氨醇杆菌属、巨球菌属、棒状杆菌属、诺尔氏菌属、普雷沃菌属、嗜冷菌属、瘤胃杆菌属、梭菌属。在C1和E样本中菌群组成最为相似，占比例较高的均为变形菌门的不动杆菌属和放线菌门的节杆菌属，检测出的棒状杆菌属和嗜冷菌属也主要存在于C1和E样本中，推测是牛乳房与榨乳设备接触后不能及时清洗和消毒造成交叉传播；F样本细菌类群的优势菌属为拟杆菌门的普雷沃菌属和厚壁菌门的梭菌属； 养殖用水(W)样本与其他样本相比，在属分类阶元细菌多样性较低，不动杆菌属占有极大比例；而运乳罐(E2)的优势菌属则为具有有机污染物降解作用的考克氏菌属。

图4 样本中细菌在门分类水平的比较

图5 样本中细菌在属分类水平的丰度

3 讨论

规模化养殖是目前奶牛养殖产业发展的主要方式之一，而养殖环境的好坏直接影响奶牛的健康和原料乳的品质。外界环境因素会因应激引起牛体免疫力下降、内环境改变，从而导致机体感染病原微生物或其他致炎因子，影响奶牛的健康和生产能力，甚至还会导致传染病的流行。目前有关奶牛肠道微生物研究较多[14]，而针对牛场环境和牛乳接触设备及牛体自身细菌类群多样性和关联性的研究却鲜有报道。本文基于16S rRNA高通量测序技术测定了唐山地区规模化奶牛养殖场粪污以及榨乳设备等的微生物群落结构特征，分析了它们的微生物组成、多样性以及差异信息，所采集的30个样品共注释到35个门，79个纲，119个科，127个目，436个属，210个种，表明唐山地区规模化奶牛养殖场的粪污及牛乳设备细菌种群丰富且多样，是潜在的病原菌传播源。

在所有样本中检出的微生物大部分物种是一致的。这说明一些微生物能够在同一环境下竞争后成为此环境中的优势菌种，并且保持一定的繁殖和代谢能力，成为影响奶牛养殖环境的关键微生物。分析发现变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、螺旋菌门、软壁菌门和梭杆菌门是牛体、牛场粪便、污水、榨乳设备和贮奶设备样品中细菌的优势菌门，这与相关研究结果[15-17]基本一致。变形菌门是养殖用水(W)样本中的优势类群，厚壁菌门是E、F的优势菌门，放线菌门则是E2样本的优势菌门。不同取样点的物种多样性存在差异，可能与各空间环境卫生状况、牛体是否及时清洁擦拭、榨乳设备消毒状况和气溶胶污染传播等因素有关。但值得注意的是以上优势菌在牛乳房擦拭样品(C1)中均有大量存在，这表明养殖场环境因素及榨乳、运乳等设备所含细菌都可能通过接触或气溶胶形式感染奶牛，进而影响原料乳品质。Okuda等[18]和Saito等[19]研究发现，梭杆菌门在结肠癌细胞中生长较为旺盛，并且与结肠炎发病有关；Swidsinski 等[20]的研究认为，梭杆菌门中的各种梭菌都与急性阑尾炎有关。曾学琴等[21]研究发现，奶牛乳房炎的发生与梭杆菌门细菌密切相关。

本试验对30个样本的菌群丰度进行检测，奶牛乳房附近及采奶设备样本中亦鉴定出丰度较高的鞘氨醇杆菌属、巨球菌属、嗜冷菌属，通过榨乳过程进入生乳中，分解乳品蛋白和脂肪，降低乳品品质。鞘氨醇杆菌属、棒状杆菌属、普雷沃菌属、梭菌属等均属于机会致病菌。随着畜牧业的迅猛发展，疫病更加复杂化，原来不被重视的条件致病菌引起的损失也越来越大[22]。值得注意的是，巨球菌属是牛体样本中丰度较高的菌属，其在自然环境中广泛存在，通常不会引起人类或动物疾病。然而，据报道1株高致病多重耐药的超级细菌——巨球菌在商品肉鸡中暴发，死亡率高达25%，主要引起颅腔内干酪样渗出、脑炎、脑坏死、以及其他器官的出血和炎症[23]。 结果分析中养殖环境尤其是牛乳房周围和粪便中丰度最高的为不动杆菌属。来自环境的不动杆菌聚集在奶牛潮湿的乳房周围，造成乳房感染引发奶牛乳房炎。不动杆菌属包含的细菌多为条件致病菌，这些条件致病菌将对人和动物的健康及环境造成严重威胁[24]。近年来，作为条件致病菌的不动杆菌已经变成重要的感染致病菌之一，可引起肺部、肠胃等多个系统的感染，尤其是感染感染免疫功能低下、小儿、手术后及患有其他基础疾病的患者[25]，是人类公共卫生安全的潜在风险源。通过牛的运动或空气流动，这些条件致病菌可在动物机体、养殖场粪污和环境设备间交叉转移[26-27]，甚至是这些细菌携带的耐药基因也会随之传播[28]。由此可见，如果养殖场粪污不经科学有效处理就排放到环境中，将会增加细菌性传染病的发生概率，从而威胁人与动物的健康[29]。

4 结论

本研究通过HiSeq2500高通量测序技术分析了奶牛养殖场部分环境因素及奶牛乳房处的细菌多样性与差异性，30个样品均有相对较高的细菌多样性，并发现榨乳罩杯涂抹样本与奶牛乳房处样本微生物相似性最高，不动杆菌属、节杆菌属和嗜冷菌属是2种样本的优势菌群，表明榨乳设备受到了环境污染或者是接触牛乳房导致交叉传播。因此控制微生物污染必须严格执行养殖场卫生管理规范。此外，具体污染来源还需进一步扩大采样点范围进行深入研究。