鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析

曹祁峰，任显东，李阁锦，李冰*

(1. 锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001；2. 锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121001)

鸡传染性支气管炎(chicken infectious bronchitis)是由冠状病毒科、γ冠状病毒属的传染性支气管炎病毒(infections bronchitis virus，IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，该病主要侵害呼吸系统、消化道和泌尿生殖系统，是危害世界养禽业的传染病之一[1]。冠状病毒仅感染脊椎动物，主要引起人和动物的肠道及呼吸道疾病[2]。21世纪以来暴发的严重急性呼吸综合征和中东呼吸综合征以及新型冠状病毒肺炎，使得该类病毒备受人们关注[3]。冠状病毒可分为4个属：α、β、γ、δ。α和β冠状病毒主要为哺乳动物病毒，γ冠状病毒主要包括IBV、火鸡冠状病毒、白鲸冠状病毒及其他禽类物种中分离到的冠状病毒，其中造成严重经济损失的γ属冠状病毒主要为IBV与火鸡冠状病毒[4-5]。IBV是第一个被发现的冠状病毒，于1930年在美国NorthDakota首次被分离；1931年Beaudette和Hudson首次对该病毒进行文字报道；1956年Jungherr等利用中和试验证实IBV存在多个血清型，且不同血清型之间没有交叉保护。1972年邝荣禄等首次报道我国广东省存在IBV，随后鸡传染性支气管炎在我国广泛流行，每年对我国养禽业造成巨大经济损失。

IBV属于单股正链、含囊膜的RNA病毒，其核酸长度约为27.6 kb，编码纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、小包膜(E)蛋白和核(N)蛋白4种结构蛋白和15个非结构蛋白(nsp2～16)，其中S蛋白是位于病毒粒子囊膜上的棒状纤突结构，具有十分重要的生物学功能[6]。IBV的S蛋白存在碱性氨基酸裂解位点，通常是由RRXRR/S(X为任意氨基酸)或HRRRR组成，成熟的S蛋白可以被宿主细胞的弗林蛋白酶切割成S1和S2亚基[7]。S1蛋白是中和抗体的主要诱导蛋白，能够诱导机体产生中和抗体、血凝抑制抗体，对IBV的感染性、致病性、组织嗜性及细胞嗜性起决定作用，也是决定IBV血清型的主要蛋白，因此S1基因核苷酸序列是IBV分离株分型的重要依据[8]。本研究通过对疑似病例进行病毒的分离鉴定，并对S1基因进行测序分析，初步明确了辽宁分离株遗传演化特点，为辽宁地区鸡传染性支气管炎的防控和疫苗的选择提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源及试验动物

锦州某鸡场3只疑似传染性支气管炎濒死肉鸡的肾脏病料样品，由锦州市动物疫病预防控制中心提供；10日龄鸡胚、14日龄未免疫雏鸡，均购于锦州鸿强牧业有限公司。

1.1.2 主要试剂

鸡新城疫活疫苗(La Sota株)，购自山东绿都生物科技有限公司；TRIzol试剂，购自深圳市康初源有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司；Millipore超滤管，购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；pMD18-T载体、DNA连接酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞，均购自大连TaKaRa公司。Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病料的检测

将临床无菌采集的疑似IBV感染病料剪碎，与无菌PBS 1∶5倍混合并研磨，研磨液反复冻融3次，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，将样品分为2份，一份置于-80 ℃冰箱保存，另一份按照TRIzol试剂方法提取病毒总RNA。参照Nguyen等[9]建立的针对N基因的RT-PCR方法进行IBV检测。上游引物5′-TG-GGTGACTCAATTCTGCTGTTGGACGTGTVCCTACACCA-3′,下游引物5′-GTCTACCAGGCATTCGCTTCCAGGAYCAGCARAAGAAGG-3′，产物片段大小386 bp。反应体系为：1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL cDNA、9 μL MixTaq酶、6 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后于72 ℃延伸10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用PCR方法进行新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV H5、H7、H9)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽腺病毒(FAdV)等病原检测[10-13]。

1.2.2 病毒的增殖与EID50的测定

将上述检测IBV阳性样品经0.22 μm滤膜过滤后，加入双抗置于4 ℃冰箱1 h后， 10日龄鸡胚尿囊腔接种，0.3 mL/个，每次接种6枚鸡胚，并设置生理盐水对照组，置37 ℃孵化器孵化，弃去24 h内死亡鸡胚，72 h统一收胚，盲传5代，回收尿囊液置于-80 ℃冰箱保存。取45枚10日龄鸡胚，使用无菌PBS对第5代病毒液进行稀释，分别稀释至10-1～10-8，鸡胚尿囊腔接毒，每个梯度接种5枚鸡胚，0.1 mL/个，对照组接种等剂量的无菌生理盐水，37 ℃恒温孵育，每天照蛋2次，弃去24 h内死亡鸡胚，144 h后统一收胚，根据24～144 h鸡胚死亡情况及活胚有无发育受阻等特异性症状进行综合评估，利用Reed-Muench方法计算EID50。

1.2.3 病毒纯化与血凝试验

取第5代鸡胚尿囊液，12 000 r/min离心5 min，取上清经0.22 μm滤膜过滤后，参照Millipore 超滤管使用说明对病毒液进行纯化，纯化后置于-80 ℃冰箱保存备用，取2 mL纯化病毒液,将其分为A、B组，1 mL/组，A组加入等体积终浓度为3%的胰酶，37 ℃水浴3 h，每15 min震荡1次，消化结束后加入1%胎牛血清终止胰酶作用；B组病毒液不处理，进行血凝试验，测定血凝效价。

1.2.4 新城疫病毒抑制试验

将30枚10日龄鸡胚分为3组，10个/组进行尿囊腔接种。A组单独接种新城疫La Sota株疫苗；B组先接种0.2 mL第5代尿囊液，12 h后再接种等剂量的新城疫La Sota株疫苗；C组接种生理盐水作为对照组，37 ℃恒温培养72 h。按常规方法测试各组血凝滴度。

1.2.5 S1基因克隆与测序

参照GenBank中公布的鸡传染性支气管炎QXIBV毒株(NO.MN548289)的S1基因组序列设计特异性引物：上游引物5′-AAGAAGGAACAAAAGACCGACT-3′，下游引物5′-CAAAAWCTGCCATAACTAACATA-3′。按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书从第5代尿囊液中提取总RNA，按常规方法进行反转录，采用PCR方法扩增S1基因序列，退火温度53 ℃，产物片段大小1 735 bp。按照胶回收试剂盒操作说明进行目的条带回收，将目的基因连接pMD18-T载体，连接产物转化DH5α感受态细胞。挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒，经PCR检验，阳性重组质粒送生工生物工程股份公司测序，为了确保全基因序列的准确性，每个阳性质粒测序3次。

1.2.6 S1基因序列遗传进化分析

以GenBank数据库中的IBV传统疫苗株、流行毒株和国内外部分经典毒株作为本次研究的参考毒株，利用DNAStar 7.1软件中MegAlign程序的ClustalW方法进行序列比对及核苷核序列和氨基酸序列的同源性分析。参考文献[14]中基于IBV S1基因的分型方法，采用MEGA 7.0软件中Neighbor-Joining方法构建基于S1基因序列的系统发育进化树。

1.2.7 动物回归试验

将40只14日龄未免疫健康鸡平均分为2组，攻毒组和对照组，分别饲养于隔离饲养器内。攻毒组使用分离株CH/LN/2019进行滴鼻、点眼，接种剂量为0.2 mL；对照组以同等剂量的生理盐水进行滴鼻、点眼，分别置隔离器中饲喂21 d。攻毒后每天观察鸡只的精神状态、食欲以及呼吸道是否出现临床症状，对死亡鸡只进行剖检。计算发病率和死亡率。

2 结果与分析

2.1 病料检测

利用IBV的N基因特异性检测引物分别对3份病料处理样品进行RT-PCR检测，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，均见约386 bp的目的条带(见图1)，与预期片段大小一致，证明3份病料样品中存在IBV。经PCR鉴定未检测到NDV、AIV、IBDV、ALV和FAdV(见图2)。

M.DL2000 Marker;1～3. 疑似IBV病料;4. 阴性对照

M.DL2000 Marker;1. 阳性对照;2. 阴性对照;3. 待测样品

2.2 鸡胚发育情况和EID50的测定

病毒液在10日龄鸡胚尿囊腔接种后，传至第3代时，鸡胚发育明显受到病毒抑制，出现死胚、侏儒胚等现象。胚体自气室取出后，可观察到胚体蜷缩，双脚抱头，羊膜增厚与胚体粘连，胚体体积明显小于对照组。鸡胚半数感染量测定时，根据鸡胚病变情况与数量，采用Reed-Muench方法计算，分离株CH/LN/2019的EID50为105.66/0.1 mL。

2.3 血凝试验

A组病毒液经3%胰酶处理后，可凝集鸡红细胞，血凝效价平均为26；B组未经处理胰酶的病毒液，对鸡红细胞无凝集作用，证明该病毒液内无具有血凝特性的外源性病毒。

2.4 新城疫抑制试验

单独接种新城疫La Sota株疫苗的鸡胚尿囊液血凝效价平均为27。先接种第5代尿囊液，再接种新城疫La Sota株疫苗的血凝效价平均为23。生理盐水对照组无血凝特性。说明该分离株能抑制新城疫病毒在鸡胚内的增殖，符合IBV特性。

2.5 S1基因克隆与测序

采用本研究设计的S1基因特异性引物对第5代尿囊液进行RT-PCR扩增，所得目的片段与预期片段大小一致(见图3)。经测序确定辽宁分离株S1基因核苷酸长度为1 620 nt，基因序列已上传至GenBank数据库，登录号为MT292303，并将该分离毒株命名为CH/LN/2019。

M.DL2000 Marker;1. 第5代尿囊液;2. 阴性对照

2.6 S1基因遗传演化、同源性分析与裂解位点分析

根据IBV S1基因序列绘制遗传进化树，结果显示(图4)，分离株CH/LN/2019与参考毒株形成8个不同的进化分支(基因型)，分别为CHⅠ～CHⅥ 型、Gray型和Mass型，分离株CH/LN/2019与CHⅠ型亲缘关系最近。通过同源性对比发现，分离株CH/LN/2019与国内的常规疫苗株H120、H52和MA5等核苷酸和氨基酸序列同源性分别为77.2%～76.9%和75.4%～76.2%；与CHⅠ型代表毒株QXIBV株核苷酸和氨基酸同源性分别为95.6%和94.8%；与基因Ⅱ型代表毒株4/91株核苷酸和氨基酸同源性分别为76.6%和78.3%。因此，可判定该分离株属于以QXIBV株为代表的CHⅠ型(QX型)毒株。测序结果显示，分离株CH/LN/2019 S1基因全长为1 620 nt，编码540个氨基酸。根据推导的氨基酸序列显示，分离株的S1基因裂解位点为HRRRR，与CHⅠ型分支的所有参考毒株裂解位点一致，而疫苗株H120 S1基因长度为1 611 nt，编码537个氨基酸。这表明分离株CH/LN/2019的核苷酸存在基因插入和缺失的现象。利用DNAStar中的Megalign软件对分离株CH/LN/2019与疫苗株H120核苷酸序列进行比对，结果显示，分离株CH/LN/2019分别在66～68、358～360和365～367位点插入了核苷酸TTC、ACA、TCT，因此推导其氨基酸序列差别较大。

2.7 动物回归试验

人工感染CH/LN/2019毒株后，第3天攻毒组出现甩头、口鼻流出浆液性黏液，第7～9 天出现闭目、呆立、羽毛蓬乱、张口呼吸、饮水显著增加、排白色稀粪，第10天开始出现死亡，第16 天症状转归，第20天鸡只恢复正常。剖检病死鸡只均呈现典型“花斑肾”现象，输尿管内有大量尿酸盐沉积，气管轻度出血并附着浆液性黏液，法氏囊肿大。攻毒组发病率100%，病死率为50%，对照组未出现症状与死亡。

3 讨论

IBV的S蛋白是最重要的保护性抗原，同时也是变异最大的蛋白，S蛋白的抗原位点和高变区主要集中在S1蛋白上，当S1蛋白发生基因缺失、插入、片段重组或点突变时会导致新的血清型和基因型出现和流行[15]。本研究通过临床病料分离到1株IBV，并命名为CH/LN/2019。基于S1基因核苷酸以及推导的氨基酸序列遗传演化分析，分离株CH/LN/2019与CH Ⅰ 型(QX型)的代表毒株同源性最高，分别为95.6%和94.8%，且具有相同的HRRRR裂解位点特征。IBV的S1蛋白是中和抗体的主要诱导蛋白，其含有3个高变区(HVRs)，分别位于38～67、91～141和274～387位氨基酸，含有特异性抗原中和表位[16]。相较于国内常规疫苗株H120，分离株CH/LN/2019的S1基因在位于高变区的121、122位分别插入了氨基酸G和S，这些插入是导致分离株与疫苗株ORF长度不同的主要原因。有研究表明IBV的S1基因在第269～298位氨基酸存在1处强亲水区[17]，对比疫苗株H120，分离株在该区域出现大量氨基酸替换现象，说明该位置已经出现了基因变异，这一点可能会影响IBV血清型及毒力的强弱。HVRs区域内的核苷酸或氨基酸出现突变或位置改变时，都可能产生1个新的变异毒株，此外S1蛋白与IBV的组织嗜性有关[18-19]。但该分离株CH/LN/2019是否出现组织嗜性的改变有待进一步研究。

▲为分离株;◇为疫苗株

IBV的基因分型主要聚焦于S1基因，分析S1基因序列有助于了解该地区IBV流行趋势。Luo等[14]对2009—2010年国内不同地区的38株野外毒株进行S1基因遗传进化分析，将IBV划分为分为7个基因型，分别为MASS型、CHⅠ(QX型)～CHⅥ型。赵烨[20]对国内近20年IBV分型统计结果显示，我国每年70%以上的IBV病例都是由QX型引起。陈良珂等[21]对2013—2017分离的390株IBV进行S1基因序列遗传进化分析结果表明，QX型是我国目前主要的优势基因型，另外CHⅤ型比例也在逐年上升。CHⅡ型与CHⅥ 型病毒在中国IBV分离株中所占比例相对稳定(约占总分离株的15%)，CHⅢ型与CH Ⅳ型病毒所占比例较低且呈逐年下降趋势[22]。本研究于2019年在辽宁地区分离得到了IBV CH/LN/2019株，参照Luo等[14]基于S1基因的分型方法，确定该分离株属于QX基因型。由于QX型毒株与国内当前广泛使用的MASS型疫苗亲缘关系较远，从而导致鸡群免疫后仍不能完全抵御IBV流行毒株的侵袭[23]。我国临床上针对该基因型已研制出鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+QXL87株)，该疫苗针对当前QX型流行毒株可产生高达80%以上的免疫保护率[24]。建议各地区在防控鸡传染性支气管炎时，应根据当地流行毒株类型选择适合本地的疫苗，有助于提高疫苗的免疫保护率。