福建省部分地区鹦鹉喙羽病的分子流行病学调查及其病原Cap蛋白抗原表位预测

常巍，陈科元，杨世丽，袁梦，陈小丽，唐耀，马燕梅*

(1. 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002；2. 福州动物园,福建 福州 350012)

鹦鹉喙羽病(psittacine beak and feather disease，PBFD)的病原为鹦鹉喙羽病病毒(psittacine beak and feather disease virus，PBFDV)，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)[1-2]。PBFD的临床症状主要为羽毛和喙出现病变，患病鹦鹉的羽毛出现对称性萎缩、脱落或异常生长，新生羽毛发育不全甚至停留在羽管阶段，有些鹦鹉的喙出现畸形甚至变黑，爪出现异常变形[3-4]。PBFD是一种免疫抑制性传染病，患病鹦鹉虽然不会即刻死亡，但PBFDV会侵袭鹦鹉的法氏囊和胸腺等免疫器官，抑制机体免疫功能，从而出现继发感染或者混合感染导致死亡[5]。Todd[6]报道PBFD可通过水平传播和垂直传播，且目前尚无商品化的疫苗可供使用。因此，本病对鹦鹉的养殖业造成极大威胁。PBFDV为单股DNA病毒，其基因组大小约为1.7～2.0 kb，基因组主要包括2个相反方向的开放阅读框(open reading framework，ORF)，一个编码复制相关蛋白(Rep)，另一个编码衣壳蛋白(Cap)。Rep参与启动基因组的滚环复制，具有特定的核苷酸结合基序，具有解旋酶和拓扑异构酶活性，可识别和结合基因组DNA[7]。Cap蛋白是病毒粒子的组成部分，具有核定位功能，在引导病毒DNA进入细胞核，以及病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的组装中起重要作用[8]。由于Cap蛋白具有免疫原性，突变率较高，所以常用于PBFD流行病学以及系统进化等相关研究中一个可靠的基因遗传进化标记。

迄今为止，全世界约40个国家报道PBFD的存在，包括野生鹦鹉和圈养鹦鹉均有感染此病[9-10]。2002年我国台湾报道非洲灰鹦鹉(Psittacuserithacus)和吸蜜鹦鹉(Vinikuhlii)感染此病[11]。2009年[12]、2012年和2017年山东[13-14]及2018年北京分别报道有PBFD存在[15]，2019年山东、河北、江苏和福建也发现此病[16-17]。为调查福建部分地区鹦鹉感染PBFD及PBFDV的遗传进化情况，本文分别对福州市某动物救助站、福州动物园、三明动物园、福州市花鸟市场、福州市某鹦鹉繁殖基地和南平动物园进行PBFD的分子流行病学调查，针对 PBFDV的 ORF中编码衣壳蛋白的 C1基因，设计引物进行 PCR扩增，同时对上述地点的阳性样本进行Cap基因测序，与GenBank中部分PBFDV毒株的亲缘关系比对，绘制系统进化树，并进行Cap蛋白抗原表位预测，以了解福建省PBFDV毒株的情况，为疾病的预防与诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及预处理

2017—2018年于福州动物园、福州市花鸟市场、福州市某动物救助站、福州市某鹦鹉繁殖基地、三明动物园和南平动物园共采集298份鹦鹉粪便样品。用棉拭子在待检粪便样品上涂抹采样，装入含有1‰抗生素的1 mL PBS中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

Taq酶、dNTP Mixture、Oligo d(T)18 Primer、PrimeSTAR 高保真酶均购自TaKaRa公司，OMEGA Stool DNA Kit(200)试剂盒购自Omega公司，胶回收试剂盒购自Vigorous公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank公布的PBFDV序列(登录号：EF457974)的C1和Cap基因序列设计特异性引物。引物由广州擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物序列信息

1.4 核酸提取和PCR检测

病毒核酸提取采用OMEGA Stool DNA Kit(200)试剂盒，操作步骤按说明书进行。用PCR扩增，扩增体系15 μL。PCR反应体系为: dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL、10×Buffer 1.5 μL、10×TaqDNA聚合酶 0.1 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、DNA模板 1 μL、水 10.2 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ～58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 Cap基因的扩增、回收与测序

选取福州市某动物救助站、福州动物园、三明动物园、福州市花鸟市场和福州市某鹦鹉繁殖基地各地阳性样品，分别命名为FZ-JZZ、FZ-DWY、SM-DWY、FZ-HNSC和FZ-JD，进行PCR扩增(方法同1.4)。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下所需回收目的DNA条带，称重，用Invitrogen Ambion胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的DNA样本委托广州擎科生物科技有限公司进行测序。应用DNAStar序列分析软件对所测PBFDV的Cap基因序列与GenBank中的国内外一些PBFDV毒株进行同源性比较，用MEGA 5.1软件绘制系统进化树。

1.6 PBFDV Cap蛋白B细胞抗原表位的预测

通过DNAStar软件包中的Editseq软件将测序得到的Cap基因序列翻译成氨基酸序列，用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测PBFDV FZ株Cap蛋白的二级结构。用Kyte-Doolittle方法分析Cap蛋白的疏水性，用Emini方法分析Cap蛋白的表面可及性，用Karplus-Schulz方法分析Cap蛋白柔韧性，用Jameson-Wolf方法对Cap蛋白的抗原指数进行预测，最后综合评价PBFDV FZ株Cap蛋白的B细胞抗原表位。

2 结果与分析

2.1 不同地点采集的鹦鹉粪便样品中PBFDV的PCR检测

采集了福州市某动物救助站、福州动物园、三明动物园、福州市花鸟市场、福州市某鹦鹉繁殖基地和南平动物园6个不同地点鹦鹉的298份粪便样品，通过PCR方法对样品进行检测，部分样品PCR电泳图见图1。

M. DNA Marker；- . PBFDV-C1阴性对照；+ . PBFDV-C1阳性对照；1～15.部分样品

统计结果见表2，各地鹦鹉的PBFDV的阳性率不同，其中，阳性率高于50%的为福州市某动物救助站和福州动物园，分别为65.17%和64.29%；其余地区从高到低依次为三明动物园(41.67%)、福州市花鸟市场(30.95%)和福州市某鹦鹉繁殖基地(23.76%)，南平动物园未检测出阳性样品。

2.2 不同种类鹦鹉PBFDV分子流行病学调查结果统计

此次分子流行病学调查共采集了14种不同鹦鹉的粪便样品，各品种鹦鹉的PBFDV的阳性率也不同，结果见表3。鹦鹉样本数量在5以上且平均阳性率高于50%的分别是金头凯克鹦鹉(100%)、非洲灰鹦鹉(55.77%)和红绿金刚鹦鹉(50%)。

2.3 Cap基因同源性和遗传演化分析

将5个不同来源的阳性样品FZ-JZZ、FZ-DWY、SM-DWY、FZ-HNSC和FZ-JD的Cap基因序列与GenBank中国内外一些PBFDV毒株进行同源性比较，并绘制系统进化树，结果发现所测毒株与GenBank中的参考株之间核酸序列同源性均很高，介于82.4%～97.8%之间。其中福建的5株PBFDV的同源性为100%，与新西兰株(AY518913)同源性最近，高达97.8%，在进化树上处于同一分支；与国内较早报道的青岛株(KU596572，GQ386944)及北京株(MG257487)亲缘关系较远，不在同一分支(图2和图3)。

2.4 PBFDV Cap蛋白B细胞抗原表位预测

2.4.1 PBFDV Cap蛋白二级结构的预测

结合Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法预测PBFDV Cap蛋白α螺旋结构形成在1～4、35～46、81～89、130～137和162～167位氨基酸残基；β折叠分布比较均匀，在16～20、28～34、47～66、73～75、96～101、105～110、114～119、125～129、152～157、168～172、176～179、188～198和203～213位氨基酸残基。在各β折叠之间存在β转角和无规卷曲，其中β转角在10～15、24～27、90～93、111～114、140～143、148～151、173～175和182～185位氨基酸残基；无规卷曲在68～72、94～95、120～121、158～161和199～201位氨基酸残基，共16个氨基酸残基。

2.4.2 PBFDV Cap蛋白亲水性分析

用Kyte-Doolittle方法对PBFDV Cap蛋白的亲水性进行了分析，Cap蛋白疏水性区域较少，亲水性区域主要分布在1～26、28～53、65～72、74～99、112～142、144～156、158～167、179～193和201～204位氨基酸残基，提示这些区段暴露于表面的几率较大，作为抗原表位的可能性也更大。

表2 不同地点PBFDV调查结果统计

图2 不同PBFDV毒株Cap基因同源性分析

图3 不同PBFDV毒株Cap基因遗传进化分析表3 不同种类鹦鹉PBFDV调查统计

种类样品数量阳性数量阳性率/%非洲灰鹦鹉1045855.77暗色锥尾鹦鹉631523.81虎皮鹦鹉381436.84琉璃金刚鹦鹉17847.06青绿顶亚马逊鹦鹉15746.67绯胸鹦鹉1516.67牡丹鹦鹉13323.08和尚鹦鹉12325.00红绿金刚鹦鹉8450.00金头凯克鹦鹉55100.00鸡尾鹦鹉4375.00蓝喉金刚鹦鹉2150.00小葵花凤头鹦鹉11100.00棕榈凤头鹦鹉100合计29812341.28

2.4.3 PBFDV Cap蛋白的表面可及性分析

用Emini方法分析PBFDV Cap蛋白表面可及性较大的区域主要是第1～24、31～37、42～48、68～70、77～81、112～127和145～151位氨基酸残基，其他区段的呈现在表面的可能性较小或为负值。

2.4.4 PBFDV Cap蛋白柔韧性分析

用Karplus-Schulz方法对PBFDV Cap蛋白柔韧性进行分析，Cap蛋白柔韧性区域主要位于第5～15、20～27、43～50、63～72、100～102、110～127、132～136、141～153、155～164、171～174、180～191和200～204位氨基酸残基，分布较均匀。

2.4.5 PBFDV Cap蛋白B细胞抗原表位分析

利用Jameson-Wolf方法对PBFDV Cap蛋白的B细胞抗原表位进行预测，Cap蛋白存在几段抗原指数较高的区域，提示这些区域含有潜在优势抗原表位，分别在第5～27、110～127和141～153位氨基酸残基，其他区域的抗原性低或表面可及性及亲水性偏低。

3 讨论

随着我国经济的持续快速发展，人们生活水平的提高，带动了一些观赏性禽业的养殖，如鹦鹉养殖。随着鹦鹉养殖规模的扩大，随之出现的管理不当或气候及环境因素等所导致的疾病又制约其规模养殖的发展。本文调查了2017—2018年福建省部分地区PBFD的流行情况，调查结果表明，在298份粪便样品中PBFDV平均阳性率为41.28%(123/298)，其中福州市某动物救助站的PBFDV阳性率最高(65.17%)，其次为福州动物园(64.29%)，南平市动物园未检测出阳性样品。分析原因可能为动物救助站的鹦鹉饲养环境过于狭小、鹦鹉在运输条件下产生应激等致使鹦鹉免疫力下降，给PBFD的传播创造了便利的条件，导致动物救助站的阳性率最高。鹦鹉繁殖基地为规模化养殖场，环境较为封闭，相对卫生条件较好，携带病毒较少。各动物园的饲养管理及鹦鹉的引种地不同，导致PBFDV的阳性率也不同。从流行病学检测结果分析，这些地区PBFDV阳性率与其他同种类全球平均阳性率相似。在系统发育分析中，检测的5个PBFDV毒株Cap基因同源性100%，与新西兰株(AY518913)亲缘关系较近，均处于同一分支，但与青岛株(KU596572，GQ386944)及北京株(MG257487)亲缘关系较远，不在同一分支，说明福建省的PBFDV基因型可能与其他省的PBFDV在系统发育上不同。

生物信息学自20世纪90年代创建以来，由于其投入少、见效快和起点高的特点，已被充分应用于生命科学多个领域。蛋白质的二级结构影响其作为抗原表位的潜力，α螺旋和β折叠的结构较稳定，起到稳定蛋白的作用，不易产生形变，嵌合抗体难度大，成为抗原表位的可能性低，而β转角及无规卷曲更易突出于蛋白表面，且比较松散，容易扭曲，因此该区域常含有B细胞的优势抗原表位[18]。由于蛋白质的三维构象受二级结构的影响，预测蛋白质二级结构可以得到许多重要信息[19]。本研究通过生物信息学及序列分析软件，在氨基酸一级结构的基础上，对PBFDV Cap蛋白的二级结构和B细胞抗原优势表位进行了分析与预测。结果表明，Cap蛋白有丰富的二级结构，进一步通过软件分析了Cap蛋白的疏水性、表面可及性、柔韧性和Cap蛋白的抗原指数，最后综合评价了PBFDV Cap蛋白B细胞抗原表位，发现其存在多处抗原指数较高的区域，有潜在的B细胞抗原表位，位于第5～27、110～127和141～153位氨基酸残基或其附近，结果为Cap蛋白今后的研究提供一定的预测和理论指导。

PBFDV虽较少引起鹦鹉大批死亡，有些鹦鹉不表现明显的临床症状，但PBFDV诱导的免疫抑制会导致机体对继发性感染的易感性增加，造成宿主免疫抑制，而继发性感染通常是造成鹦鹉死亡的原因，从而对鹦鹉养殖带来严重的经济损失。Raidal 等[20]报道澳大利亚大多濒危鹦鹉物种均易受PBFDV的感染，而在我国山东省。吴汝娟等[21]发现PBFDV的阳性率较高，个别鹦鹉养殖场的PBFDV阳性率高达100%。目前PBFD仍无有效的治疗方法，也没有保护性疫苗，通常的防控方法是检测和扑杀，因此建议做好养殖环境的卫生工作，保证合理的养殖密度，避免由于野生鸟类等加快病毒的传播，真正做到防患于未然，以提高鹦鹉养殖的经济效益。