3株魔芋茎腐病病原菌的分离鉴定与致病性研究

赵兴丽 贺圣凌 刘思睿 罗林丽 周罗娜 范士杰 周玉锋

（1 贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州贵阳 550006；2 贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州贵阳 550006）

魔芋为天南星科（Araceae）魔芋属（Blume）多年生草本植物，又名蒟蒻、蒟芋、蒻头、鬼芋，磨芋等，全属共有记载160 余种（吴祝平，2007；徐炜，2011）。其球茎中含有蛋白质、维生素、葡萄甘露聚糖、谷氨酸和甘氨酸等17 种人体必需氨基酸以及磷、钾、钠、铁、锌等多种微量元素（马俊和齐颖，2006），具有调整、平衡、改善人体代谢，提高机体免疫力和保健疗效的重要功能，在食品、医药、保健、美容以及工业等方面有着广阔的开发前景（周舒婷 等，2014；葛珍珍 等，2021；何国菊 等，2021；林清 等，2021；邱蓝昊 等，2021；汪佳文和谢显珍，2021；王友清 等，2021；韩晓磊 等，2022）。近年来，魔芋的加工与利用越来越受到人们的关注，魔芋加工品的开发也越来越多样化。

魔芋是贵州名、优、特农作物之一，随着魔芋消费市场需求的扩大，贵州省致力于打造魔芋产业链，很多地区已出现相对集中连片种植，据中国魔芋协会统计，2021 年贵州省魔芋种植面积约为2.31 万hm，并在不断增加。魔芋在种植过程中很容易受到各类病害危害，包括真菌引起的茎/ 根腐病（spp.）（王维 等，2002）、疫病（）（孙道旺 等，2015；王瑞仙 等，2018）、白绢病（Sacc）（高启国和张盛林，2004）以及细菌引起的软腐病（subsp.）（崔双 等，2021；张卓然 等，2021）等。由镰刀菌属（spp.）真菌引起的魔芋茎腐病是魔芋栽培种植过程中的一种重要的土传病害，大面积暴发会给魔芋生产带来毁灭性的灾难，增加芋农种植风险；虽然不断有关于魔芋茎腐病防治方法的研究报道，且产生了一定的作用（段曾平 等，2021；赵小明 等，2021；邹强，2021），但在实际种植中，魔芋茎腐病仍是魔芋生产中一大难题。球茎是魔芋重要的经济价值所在，茎腐病发生后会引起魔芋球茎腐烂，给芋农造成严重的经济损失，甚至颗粒无收，但目前针对贵州省魔芋茎腐病致病菌分离鉴定的研究较少。明确种植区茎腐病的病原种类，了解其致病力，对茎腐病防控过程中农药的选择及用量具有重要的指导意义。2019 年以来，笔者对贵州省兴义市魔芋种植区魔芋种植中出现的高发病害进行了调查，多次在倒伏的魔芋球茎腐烂部分发现大量镰刀菌分生孢子，该病害在田间的症状主要表现为：发病初期叶片黄绿色，叶缘倒卷；发病中期植株黄化萎蔫、倒伏，叶柄有纵的皱折，基部有水浸状深绿色病斑；发病后期叶柄基部变成紫褐色，根部甚至块茎全部腐烂，病株很容易拔出（蒋晓云 等，2015）；明确该地区魔芋茎腐病病原菌，可为魔芋茎腐病精准防治提供基础依据，为魔芋产业的健康和持续发展提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试病样、培养基及试剂

供试病样：2019 年7月底在贵州省兴义市魔芋种植区采集具茎腐病典型症状的发病球茎，编号，带回实验室进行病原分离。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，蒸馏水1 000 mL），1%水琼脂（WA）培养基（琼脂粉1 g，无菌水100 mL）。

供试试剂：Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR 扩增采用的2×PCR Master Mix 购于天根生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 魔芋茎腐病致病菌的分离纯化 采用组织分离法对发病球茎进行病原分离纯化，由于魔芋组织染病后，组织软化、腐臭，不宜用剪刀操作，故采用整体消毒的方式进行；具体方法为：将魔芋病症处（腐烂球茎）进行表面消毒，先用75%酒精浸泡1 min，再用3%次氯酸钠浸泡1 min，最后无菌水冲洗3～5 次；将表面消毒处理后的球茎置于经高温灭菌处理的滤纸上，在超净工作台中风干，去掉病症处的表皮，用镊子夹取黄豆大小的魔芋病样组织，铺于PDA 平板上，25 ℃培养箱中黑暗培养，每天观察；待从病样组织块上长出菌丝，并在组织周围形成菌落，挑取最外侧菌丝转接至新鲜PDA培养基上纯化培养，获得纯培养物。

1.2.2 魔芋茎腐病致病菌的形态学鉴定 纯化后的培养物在PDA 平板上培养7 d 后，观察菌落形态和色泽，并测量菌落直径；将培养7 d 的纯培养物，用无菌水冲洗制成孢子悬浮液，浓度约为1 × 10个·mL，将孢子悬浮液涂布于1%水琼脂平板上，48 h 后在显微视野下观察菌丝、大小型分生孢子、厚垣孢子以及分生孢子梗等的形态特征；同时滴1 滴孢子悬浮液于双凹载玻片上，盖上盖玻片，25 ℃培养24 h，显微视野下观察分生孢子的萌发 情况。

1.2.3 魔芋茎腐病致病菌的分子生物学鉴定 将实验用手术刀在酒精灯下反复灼烧3～4 次，冷却后刮取培养物的菌丝及分生孢子，按照Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒说明书进行操作提取纯培养物的基因组DNA；采用引物：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）（Seliger et al.，1990）、TEF1-728F/TEF1-rev（5′-CATCGAGA AGTTCGAGAAGG-3′/5′-GCCATCCTTG GAGATACCAGC-3′）（Carbone &Kohn et al.，1999），进行PCR 扩增。PCR 反应体系（25 μL）为：2×Master Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL、通用引物各1 μL、ddHO 9.5 μL。PCR 扩增程序分别为：ITS（94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min）、（95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min）。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送于生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将所得序列经过校验后在NCBI 中进行BLASTn 比对，根据比对结果选择同源性较高的序列构建数据集。利用BIOEDIT 软件对数据集进行多位点比对并进行手动校正，再利用MEGA 5.01 软件将2 条碱基序列按照→ITS 的顺序进行拼接，获得1 条含有2 个基因片段的序列，采用最大似然法运用MEGA 5.01软件构建系统发育树。

1.2.4 魔芋茎腐病致病菌的致病性测定 离体接种：根据柯赫氏法则将分离得到的菌株回接至魔芋的叶片正面和背面。将分离得到的菌株在PDA平板上培养5 d 后，用打孔器在菌落周围取直径为6 mm 的菌饼备用；选择新鲜的无病斑的魔芋叶片，表面消毒后，用无菌接种针在叶脉两侧针刺形成伤口，平铺于装有润湿的灭菌纱布的保鲜盒中，叶柄处放湿润脱脂棉保湿；用无菌接种针挑取菌饼分别接种于叶脉两侧伤口处，置于人工气候箱中培养，培养条件（昼/夜）为：28 ℃/22 ℃、95%/75%、14 h/10 h；以接种PDA 平板为对照，试验设置5 个生物学重复，接种后观察并记录其发病 情况。

活体灌根接种：将离体接种致病力较强的菌株在PDA 平板上培养7 d 后，用无菌水冲洗制成孢子悬浮液，浓度约为1 × 10个·mL，灌根接种于魔芋叶柄周围，并用灭菌手术刀划伤叶柄，每株接种30 mL，以清水为对照，试验设置15 个生物学重复，接种后观察并记录其发病情况。

2 结果与分析

2.1 魔芋茎腐病致病菌的分离纯化

通过组织分离法从采自兴义市的具茎腐病病症的魔芋球茎上分离获得3 株菌株，分别命名为xymy-7、xymy-8、xymy-9。

2.2 魔芋茎腐病致病菌的形态学鉴定

菌株xymy-7 在PDA 平板上培养7 d 后，菌落半径约为23.5 mm，菌丝生长速度较快，气生菌丝白色，表面产生土黄色色素，基物表面肉色（图1-A）；显微镜下，小型分生孢子椭圆形或卵圆形，大小为（6.75～16.00）μm ×（2.05～4.00）μm，大型分生孢子马特形，大小为（34.50～55.00）μm ×（4.55～6.05）μm，壁厚，原生质多（图1-A1）；单瓶梗产孢，产孢梗有长有短（图1-A2-1、1-A2-2）；适宜条件下，大型分生孢子和小型分生孢子均可萌发长出菌丝（图1-A3、1-A4）。通过培养特性及形态特征，结合Perez-Hernandez 等（2019）的研究，将菌株xymy-7 初步鉴定为茄腐镰刀菌（）。

菌株xymy-8 在PDA 平板上培养7 d 后，菌落半径约为22.5 mm，菌落背面淡紫红色，气生菌丝呈毡状，略带淡紫红色（图1-B）；大型分生孢子生长稀少，呈纺锤形至镰形，孢子较直，大小为（28.05～43.55）μm ×（3.10～4.50）μm，小型分生孢子数量多，卵形至椭圆形，平直或弯曲，假头状着生，大小约（4.55～12.05）μm ×（2.25～3.75）μm（图1-B1）；分生孢子着生于从菌丝的分生孢子梗旁伸出的产孢细胞上（图1-B2-1、1-B2-2）；厚垣孢子椭圆形或球形，单个间生；大型分生孢子和小型分生孢子均可萌发长出菌丝（图1-B3、1-B4）。结合前人研究，菌株xymy-8 的培养特性及形态特征与Hussain 等（2012）研究的尖孢镰刀菌（）相似，初步鉴定为尖孢镰刀菌。

菌株xymy-9 在PDA 平板上培养7 d 后，菌落半径约为24.0 mm，菌丝生长速度较快，气生菌丝白色，较菌株xymy-7 丰富，表面产生少量土黄色色素，基物表面白色（图1-C）；小型分生孢子椭圆形或卵圆形，大小为（5.65～14.55）μm ×（2.05～4.25）μm，大型分生孢子马特形，大小为（33.85～52.00）μm ×（2.65～4.95）μm，原生质多（图1-C1）；单瓶梗产孢，产孢梗有长有短（图1-C2-1、1-C2-2）；大型分生孢子和小型分生孢子均可萌发长出菌丝（图1-C3、1-C4）。通过其培养特性及形态特征，结合Perez-Hernandez 等（2019）的研究，将菌株xymy-9 初步鉴定为茄腐镰刀菌（）。

图1 3 株魔芋镰刀菌的培养性状及形态特征（标尺=25 μm）

2.3 魔芋茎腐病致病菌的分子生物学鉴定

根据NCBI中BLASTn比对结果，菌株xymy-7和xymy-9的ITS序列与strain GFR03（登录号：MT447 508.1）的序列相似度均为100.00%，菌株xymy-8 的ITS 序列与strain F1（登录号：MH553 293.1）的序列相似度达100.00%；菌株xymy-7 和xymy-9 的序列与strain NRRL 52778（登录号：JF740 846.1）的序列相似度分别为99.26%和99.25%，菌株xymy-8 的序列与f.sp.isolateATCC90245（登录号：KP964 890.1）的序列相似度为99.42%。根据比对结果，下载与目标菌株相关的同源序列（表1），以isolateLT-C1 为外群，使用MEGA 5.01构建最大似然树（图2）。系统发育分析结果表明菌 株xymy-7 和xymy-9 与聚在同一分支，菌株xymy-8 与具有较高的同源性，支持率为95%，结合形态特征将菌株xymy-7和xymy-9 确定为茄腐镰刀菌（），将菌株xymy-8 确定为尖孢镰刀菌（）。

图2 基于ITS 序列和tef 序列构建的最大似然树

表1 用于系统发育分析的真菌序列

2.4 魔芋茎腐病致病菌的致病性测定

将3 株镰刀菌菌饼接种到具伤口并经表面消毒后的叶片上，人工气候箱中培养，菌株xymy-7 培养3 d 后菌饼周围叶片开始褪绿，出现褐色病斑；培养5 d 后褐色病斑面积扩大；培养7 d 后病斑颜色加深，面积扩大，呈不规则状；培养9 d 后菌饼覆盖处叶片干枯，易脆，呈透明状。3 株镰刀菌接种后发病时间和发病程度存在一定差异，菌株xymy-7 接种3 d 后叶片就开始褪绿，出现褐色病斑，菌株xymy-9 接种5 d 后菌饼周围才产生褐色病斑。培养9 d后，与对照（图3-A、3-E）相比，菌株xymy-7（图3-B、3-F）和xymy-9（图3-D、3-H）具有较强的致病性，其菌饼周围产生黑褐色或褐色病斑，而菌株xymy-8（图3-C、3-G）没有致病性，菌饼周围没有出现病斑。由于镰刀菌菌株xymy-7的侵染时间和侵染能力均强于其他2株菌株，故又对其进行活体接种。活体接种45 d 后魔芋植株叶片开始褪绿，出现黄色病斑，接种60 d 后（图4），植株开始倒伏，随着时间延长，最终干枯死亡。

图3 离体接种下魔芋镰刀菌的致病性

图4 活体灌根接种菌株xymy-7 孢子悬浮液60 d 后魔芋的发病情况

3 结论与讨论

病害病原种类的确定在植物病害防控中起着十分重要的作用，只有明确病原种类才能有针对性地采取防控措施。随着分子生物学的快速发展，形态特征与基因组DNA 序列分析的结合极大提高了植物病原种类鉴定的准确性（孙道旺 等，2015；崔月贞 等，2020）。近年来，由于魔芋市场供不应求，且魔芋的经济价值远高于其他农作物，越来越多的人投入到魔芋产业中。然而魔芋在生长过程中对其生存的环境（土壤、气候条件等）及管理（病害防控等）具有较高要求，一旦生存条件不满足或病害防控不及时，损失将惨不忍睹，甚至绝收。镰刀菌是一种能够危害多种作物的病原真菌，研究发现，镰刀菌可侵染荸荠（Zhu et al.，2014）、辣椒（Hami et al.，2021）、西葫芦（Perez-Hernandez et al.，2019）、番茄（Lopez et al.，2021）以及核桃树（Lazarotto et al.，2014）等作物，导致其发生枯萎病。本试验发现，镰刀菌还可以侵染魔芋球茎致使球茎腐烂引起茎腐病，给魔芋种植户带来巨大的经济损失。为明确引起贵州省兴义市魔芋种植区魔芋茎腐病的病原种类，笔者从发病魔芋球茎中分离获得3 株致病菌，命名为菌株xymy-7、xymy-8 以及xymy-9；经鉴定，3 株致病菌分属于2 个种，分别为茄腐镰刀菌（）和尖孢镰刀菌（），这与蒋晓云等（2015）、高雪等（2017）研究报道的魔芋根腐病的病原菌为镰刀菌属真菌一致。

分离的3 株镰刀菌中，2 株为茄腐镰刀菌，1 株为尖孢镰刀菌；虽然茄腐镰刀菌的分离数量多于尖孢镰刀菌，但是由于取样地点及数量较少，不足以说明茄腐镰刀菌为该地区魔芋茎腐病优势菌。因此，在今后的研究中还应扩大采样范围及采集数量，明确其优势菌种，采用分子鉴定明确其分类水平，柯赫氏回接掌握其致病性，深入研究魔芋对病原菌的抗逆性及抗病机理等，为魔芋茎腐病的有效精准防控提供理论依据。

研究表明，病原种类不同，致病力会存在一定的差异性（杨剑锋 等，2021）；本试验发现，茄腐镰刀菌菌株xymy-7 和xymy-9 均能使魔芋离体叶片发病，但接种菌株xymy-7 后魔芋叶片发病程度较接种菌株xymy-9 严重，而尖孢镰刀菌菌株xymy-8 不能使魔芋叶片发病；此外茄腐镰刀菌菌株xymy-7 能使魔芋植株发病倒伏，甚至死亡，离体接种和活体接种结果均表明茄腐镰刀菌的致病力强于尖孢镰刀菌。由于在发病部位同时分离获得茄腐镰刀菌和尖孢镰刀菌，是否能够说明田间魔芋茎腐病的发生可能与多种致病菌（包括茄腐镰刀菌和尖孢镰刀菌）有关，又是否为复合侵染，尖孢镰刀菌的存在是否会加速发病时间和加重发病程度，需要今后进一步深入研究。

魔芋茎腐病是危害魔芋的一种重要病害，对魔芋的品质和产量有巨大的影响，严重制约着魔芋产业的发展。本试验明确了引起贵州省兴义市魔芋种植区魔芋茎腐病的病原种类以及优势致病菌的种类，对于该病害的防控具有十分重要的现实意义。